发酵工程及设备的实验讲议

发酵工程及设备实验指导书（适用专业：生物工程）2005 年 4 月目 录实验一 土壤中产醋酸菌种的分离筛选1实验二 紫外线的诱变育种2实验三 摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件3实验四 细菌增殖曲线的测定4实验五 木霉 T6 淀粉酶的固态发酵实验6实验六 小型连续发酵实验9实验七 啤酒麦芽汁制备实验11实验八 啤酒的酿造14实验九 啤酒风味保鲜期的测定15实验十 反应器的安装与拆卸16实验十一 pH 电极的校正17实验十二 氧电极的校正19实验十三 体积溶氧传递系数的测定21实验十四 反应器培养液的灭菌与接种培养23实验十五 气升式生化反应器的使用24实验十六 中试发酵设备的使用方法25实验十七 补料分批发酵动力学研究27实验一 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 一实验目的：1根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株。2加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二基本原理：分离上样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立若干富集技术。同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。三培养基与仪器 1培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基 2仪器：全自动高压灭菌锅，培养箱，酸式滴定管四实验步骤 1. 确定方案：首先查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 2. 采样：选取离地面 515 cm 处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 3. 增殖：称取 0.5g 土样（湿重） ，加到含 10ml 25%无菌土样浸出汁的试管中，于 26、150rpm 条件下振荡培养 25min，以适宜的样本稀释液系列稀释培养液。然后取 0.1 m1 涂布于已添加及未添加富集底物的土浸出汁平板。26下皿底朝上培养 410 天，将长出的菌落接入斜面，但应挑分离成单个的，以免不纯。 4. 分离：利用产物特性分离得到产目标产物的纯种。 初筛：将细菌接种到含有一定的碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行培养，如果细菌产酸则培养基出现混浊半透明状态，可以根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中 37深层培养24 h 后。取出培养液 5m1 加入试管内，加 0.1moL/LNaOH 液中和，然后加氯化铁液 23滴，摇匀，观察液色是否变为黄红色，如将试管放在火焰上煮沸，有无红褐色沉淀生出，根据所消耗的 NaOH 量确定产物醋酸的具体生成量。五实验结果菌 株 1 2 3 4 5 6NaOH 的 消 耗 量（ ml）醋 酸 的 生 成 量 （ ml）反 应 液 颜 色 变 化六 思 考 题如果培养中有其它种挥发酸共存，应采用什么方法来测定醋酸的生成量？实验二 紫外线的诱变育种一目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。二基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是 DNA 的分子结构发生改变（同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。三菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养 48 小时的枯草芽孢杆菌的斜面 45 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡 30 分钟，以打碎菌块。（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤 23 次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108 个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55左右时倒平板，凝固后待用。（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约 20 分钟。（b）取直径 6cm 无菌平皿 2 套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。（c）将盛有菌悬液的 2 平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W 的紫外线灯下分别搅拌照射 1 分钟及 3 分钟。(4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以 10 倍稀释法稀释成 10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。(5)涂平板取 10-4、10 -5、10 -6 三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3 只，每只平板加稀释菌液 01ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置 37培养 48 小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。(7)计数将培养 48 小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1 分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。(8)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在 56 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC 值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取 HC 比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。五实验结果1结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落处理时间 （数/皿）诱变剂 （min）10-4 10-5 10-6 存活率% 致死率%0（对照）1紫外线（UV）3透明圈和菌落直径大小（）及其 HC 比值1 2 3 4 5 6结果处理透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV 处理对照六思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？(2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验三 摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件一实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。三仪器与试剂 1仪器设备 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。2试剂（1）葡萄糖标准溶液：准确称取 100 ml 分析纯葡萄糖（预先在 105烘至恒重） ，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100 ml 的容量瓶中，以蒸馏水定容，冰箱中保存备用。（2）3, 5二硝基水杨酸试剂（DNS 试剂）：甲液： 溶解 6.9 g 苯酚于 15.2 ml 10氢氧化钠中，并稀释至 69 ml，在此溶液中加入 6.9 g 亚硫酸氢钠。乙液： 称取 22.5 g 酒石酸钾钠，加到 300 ml 10氢氧化钠溶液中，再加入 880 ml1的 3、5二硝基水杨酸溶液。将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，放置 710 天以后使用。（3）37甲醛溶液（4）0.05 mol/L 氢氧化钠溶液：称取 2 g 氢氧化钠，溶于水并稀释至 1000 ml。四实验方法 （1）培养基的配制(见表 1,2) 表 1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表 2 正 交 表 实 验 方 案 生物量 （OD） 编号 葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 0h 12h 24h 36h 48h 60h1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) （2）将上述培养基配制好以后，每 250 ml 三角瓶装入培养基 100 ml，于 121下灭菌30 min，冷却。（3）冷却后接种（接种量为 5），置于 28培养箱进行培养。（4）测 0D 值：将接种 0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 不同时间的菌悬液摇均匀后于 560nm 波长、1cm 比色皿中测定 0D 值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将 0D 值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五思考题(1)比浊计数在生产实践中有何应用价值 ?(2)本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的 0D 值，你将如何选择波长 ?实验四细菌增殖曲线的测定一实验目的：通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线图二实验原理大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每 20mln 分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。三菌种与培养基菌种：大肠杆菌种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na 2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH至 7.2。四仪器光电比色计，摇床，冰箱五操作步骤1、将在种子培养基中培养 20 h 的培养液 3000rpm 离心 10min 倾去上层液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数系 109/m1。2取 10 个盛发酵培养液的三角瓶，各接 3m1 菌液作种子，在摇床上相同位置 30振荡培养，并立即取下一瓶为 0 时的增殖状态之后于培养 1、2、3、4、5、6、7、8、9 各取一瓶，约 9 个间隔的菌液分别吸取 5m1 菌于无菌试管中，置 4下保存。3用没接种的培养液为空白对照，将上述菌液于波长 600nm 处比色，但要求消光度在 0.3 一 0.6 之间，若超过，用未接种培养液适当稀释。六实验结果：1结果(1) 将测定的 OD600 值填入下表培养时间（h） 对照 0 1.5 3 4 5 6 7 8 9 10 12光密度值 OD600（2）以菌悬液 0D 值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌培养的增殖曲线七思考题(1) 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同 ?两者各有什么优缺点 ?(2) 细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短 ?若细胞密度为 103 m1，培养 4.5h 后，其密度高达 2108 m3，请计算出其代时。(3) 次生代谢产物的大量积累在哪个时期 ?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？实验五 木霉 T6 淀粉酶的固态发酵实验1实验目的了解和掌握木霉 T6 菌株在发酵过程中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲线和测定方法。2 基本原理淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解 a1，4葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与 3、5二硝基水杨酸共热，3、5二硝基水杨酸被还原为 3氨基5硝基水杨酸（棕红色物质） ，还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在722 型分光光度计 540 nm 波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量，从而求出淀粉酶的活力。3培养基培养基（250mL）：麸皮 7g ，面粉 0.5g，NaNO 3 0.15g，营养盐 6.5mL，pH 自然。营养盐配方（g/L）：KH 2PO4 3.0；(NH 4)2SO4 2.0；Cacl 2 0.5；MgSO 4.7H2O 0.5；Cocl 2 0.003；FeSO 4 .7H2O 0.0075；ZnSO 4 0.002； pH56。四实验方法：1 还 原 糖 的 测 定 培养时间（h）OD600 值0（ 1）标准曲线的制作 取 9 支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确浓度为 1.00 mg/ml 的葡萄糖标准液和3，5二硝基水杨酸试剂。表中单位为 ml。 表 1 还 原 糖 标 准 曲 线 制 作管号 加入试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.4 0 3、5二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 3 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热 5 min，立即用冷水冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。在 540 nm 波长下，以 0 号管为空白，在分光光度计上测定 18 号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 （2）发酵液中残留还原糖的测定 发酵液单层滤纸过滤，滤液 0.2 ml 定容至 100 ml，500 倍稀释至含糖量 2-8 mg/100ml为试样。 取 4 支干燥试管,编号,按表 2 所示的量,精确加入待测 液 和 试 剂 (ml) 表 2 还 原 糖 的 测 定 空白 还原糖 管号 项目 0 1 2 3 样品量 0 2.0 2.0 2.0蒸馏水 2.0 0 0 03、5二硝基水杨酸试剂3 3 3 3总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 加 完 试 剂 后 ,其 余 操 作 步 骤 与 制 作 葡 萄 糖 标 准 曲 线 时 的 相 同 ,测 定 出 各 管 溶 液的 吸 光 度 值 。 （ 3） 计 算 以 管 1、 2、 3 的 吸 光 度 值 的 平 均 值 在 标 准 曲 线 上 查 出 相 应 的 还 原 糖 毫 克 数 ， 按下 式 计 算 样 品 中 还 原 糖 的 百 分 含 量 ： 2 氨 基 态 氮 的 测 定 （1）取发酵滤液 5.00 ml，置于 100 ml 烧杯中，加入 15 ml 水，磁力搅拌器搅拌 5 min 后，将电位计插入烧杯中，用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示 pH=8.20，此为游离酸度，不予计量。加入 10.0 ml 甲醛溶液，立即混匀，速用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示 pH=9.20，计下消耗 NaOH 标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。 （2）计算 氨基氮（%）=（V-V0）N0.014 20/5100 式中： V加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积， ml; V0加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积， ml; M NaOH 标准溶液的浓度,mol/L； 0.014与 1.00mlNaOH 标准溶液相当的氮的质 量 ， g； （ 3） 淀粉酶活力的测定及计算：CK 样品 1 样品 2 样品 3底物（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5酶液（mL） 0 0.5 0.5 0.5沸水浴 10minDNS（mL） 3 3 3 3酶液（mL） 0.5 0 0 0蒸馏水 加蒸馏水至 20. 5mL550nm 处测 OD 值 OD1 OD2 OD3淀粉酶活力（IU/g 干培养基 ）：本实验条件下，每分钟释放出 1umol 还原糖所需要的酶量称为一个酶活力单位。IU/g 干培养基 *0ODnvkMt其中：n稀释倍数；v浸提比（mL/g 干培养基 ） ；k斜率；M葡萄糖的分子量；t反应时间（10min） ；1000转换系数五操作步骤：1配制培养基，灭菌，冷却。2冷却后接种，并搅拌均匀，置于 28培养箱进行培养。3每隔 24h 取样，用 0.2M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（ pH6.0）按一定的浸提比进行浸提 1h，离心得粗酶液。共取样 6 次。4分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。六实验结果：1以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。2以氨 基 态 氮 浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨 基 态 氮 的变化曲线。0培养时间（h）还原糖（mg/mL）氨 基 态 氮（mg/mL）3以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。七思考题1、测定淀粉酶可采用哪些方法？2、比较固态发酵和液态发酵异同点。实验六小型连续发酵实验一实验目的学习组建微生物连续发酵装置，掌握连续发酵的操作原理和方法，运用所学的连续培养知识求算发酵过程的稀释率。二基本原理在分批培养中，一次加入所有的培养基，不予补充，不再更换。随着微生物的活跃生长，培养基中营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可长时间维持。如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流出量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变。连续培养方法的出现，不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平。此法已成为当前发酵工业的发展方向。三、菌种与培养基1、菌种：大肠杆菌（E. coli ） ；2、培养基(g/L)基本培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。培养 8h 后接入发酵培养基培养或 4冰箱保藏。发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na 2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH至 7.2。四、简单连续培养装置00培养时间（h）培养时间（h）淀 粉 酶 活 力（ IU/g 干 培 养 基 ）图 1 简单连续培养装置1培养基贮槽2流出液接受器3蠕动泵4恒温水浴5磁力搅拌器 6培养槽中搅拌转子7温度调节器8培养基加入管9培养液流出量10输送管五测定方法1还原糖的测定：3，5二硝基水杨酸比色法测定2蛋白质浓度的测定：考马斯亮蓝染色法3大肠杆菌的增殖曲线测定（具体操作步骤见实验四）大肠杆菌接种于母种培养基，在 37培养 6h，将培养液在 3000rpm 离心 10min，倾去上清液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数为 107 个/ml，接种于发酵培养基，在相同条件下进行培养，并每隔一定时间进行取样，用无菌的相同培养液作为 CK，将上述菌液于 600nm 波长比色（要求消光度在 0.30.6 间，如果超过用未接种的培养液适当稀释） ，然后将培养液在红外线烘箱 110120内烘干至恒重，以菌悬液 OD 值为纵坐标，相对应的菌体浓度为横坐标，绘制直线，求出斜率 1/K。K生物量/OD 值六操作步骤：1制备好的发酵培养液倒入 2L 的三角瓶中。用棉塞固定玻璃管， 玻璃管上端接内径 3mm、外径 5mm 的橡皮管。用弹簧夹夹住，灭菌备用。2灭菌后冷却至 30的三角瓶安装于恒温水浴中培养。3将大肠杆菌培养液以 10的接种量接入三角瓶中，先进行搅拌间歇式培养，若有无菌空气导管，也可通气搅拌培养。4将补料用的 3L 培养基装在 3L 的三角瓶中，将送料的橡皮管的一端插入，用棉塞固定，另一端用油纸包好，灭菌备用。5定时取出测定间歇培养的菌液浓度，以求出增殖速度。=dx/xdtt=dx/x(t 2t 1)=ln(x2/x1)= (lnx 2ln x1)/ (t2t 1)6取下输液用的橡皮管，剥去牛皮纸纸，与蠕动泵进液口相接，将培养器的输液橡皮管接到蠕动泵出液口。7据菌体增殖速度，以较小稀释率开始流加培养基，此时稀释率必须小于此增殖率。F F(lnx 2ln x 1)/ (t2t 1)七实验结果1将测定的 OD600 值及相应的生物量填入下表培养时间（h） 对照 0 1.5 3 4 5 6 7 8 9 10 12光密度值 OD600生物量（g/L）2绘制大肠杆菌连续发酵过程中的还原糖、蛋白质浓度和生物量的时间曲线(注明何时补料)八思考题：测定微生物比生长速率有什么重要的意义？ 实验七 啤酒麦芽汁制备实验一实验目的：了解和掌握啤酒麦芽汁制备的方法；了解糖化工艺条件对麦芽汁组分的影响；了解 氨基氮的测定方法及其对麦芽汁的影响。二麦芽汁制备的工艺要求（1）原料中有用成分得到最大限度萃取。指原料麦芽和辅料中的淀粉转变成可溶性无色糊精和可发酵性糖类的转化程度，它关系到麦芽汁收率或原料利用率。（2）原料中无用的或有害的成分溶解最少。主要指麦芽的麦壳物质、原料的脂肪、高分子蛋白质等，它们会影响啤酒风味和啤酒的稳定性。（3）麦芽汁的有机或无机成分的数量和配比应符合啤酒品种、类型的要求。啤酒的风格、类型的形成，除了酵母品种和发酵技术外，麦芽汁组成是主要的物质基础。三原辅料与仪器生物量（g/L）mg/mL时间（h）0原辅料优级（或一级）大麦芽粉、大米粉、酒花（或酒花浸膏、颗粒酒花） 。耐高温 -淀粉酶（使用量为 0.060.08ml/100g 淀粉） 、糖化酶（用量为 30u/g 大麦、大米） 、复合酶（用量为大麦用量的 0.3%） 。乳酸（或磷酸） 。0.025mol/l 碘液。实验仪器温度计（120） 、恒温水浴锅（4 孔） 、糖度计、布氏漏斗、台秤、分析天平、纱布、玻璃仪器。四实验方法1氨基氮甲醛滴定法2麦芽汁的糖度糖锤度计直接测定法五麦芽汁制备操作步骤1工艺选择根据麦芽汁质量指标分析数据、成品啤酒的类型和质量要求、辅料种类等，结合糖化原理选择设计适合的糖化方法，并给出糖化工艺曲线。本实验选用优质麦芽，采用适于淡爽型啤酒的复式浸出糖化法。糖化工艺曲线见下图。图 2 麦芽的糖化工艺曲线2外加酶糖化法（1）水处理取 1500ml 水煮沸 10min，冷却澄清过滤，备用。（2）麦芽汁制备称取 30g 大米粉，按 1:89 加水比加入处理后的热水进行混合，水温 52，用乳酸或磷酸调 pH 至 6.5，按 7u/g 大米的量添加耐高温 -淀粉酶，保温 10min。以 1/ min 速率升温到 93，保温 20min 迅速升温至 100，煮沸 20min 即完成辅料的糊化和液化。然后于 5min 内降温至 63用于混醪。注意，在蒸煮过程中应适当补水，维持原体积。麦芽粉 70g 投入 50热水中，加水比为 1：3，用乳酸或磷酸调 pH 至 5.2，保温30min，是蛋白质休止。然后升温至 63与糊化醪混合，加糖化酶 30u/ (g 大麦大米) ，保温 30min，进行第一段糖化，充分发挥 淀粉酶及核苷酸酶、内切酶的活性。然后再于 5min 内升温至 68进行第二段糖化，主要发挥麦芽中 淀粉酶的催化作用，提高麦汁收率。用碘液检测醪液不呈蓝色时，再升温至 75，保温 15min，糖化过程结束。在糖化过程中应注意补水，维持原体积。（3）过滤将醪液用 4 层纱布过滤，如果醪液不清，返回再过滤，直至麦汁澄清。用糖度计测一道麦汁糖度，用 7880热水 400ml 分 23 次洗槽。洗槽水与滤液混合，测其糖度。添加约 0.05g 酒花，煮沸 70min，补水至糖度为 10Bx，趁热用滤纸过滤，即得到澄清的麦汁。3协定法糖化（1）取 50g 麦芽，在 EBC 标准磨上粉碎；（2）将已经粉碎好的麦芽粉放入已称重的糖化杯中，加 200mL46水，不断搅拌并在46水浴中保温 30min；（3）使醪液以 1/ min 速率升温到 70。此时杯内加入 100mL70水，保持恒温。（4）5min 后用玻璃棒取麦芽汁 1 滴，置于白滴板上，再加碘液 1 滴，混合后观察碘液颜色变化。直到碘液呈纯黄色不再变色，停止保温，糖化结束。（5）在 1015min 内急剧冷却到室温；（6）冲洗搅玻璃棒拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为 450g；（7）用玻璃棒搅拌糖化杯，并注于漏斗中进行过滤，即获得麦芽汁。六实验结果测定麦汁的还原糖、麦芽糖、-氨基酸等基本理化指标，并填入下表中。氨基氮（mg/L） 麦芽汁的糖度（）协定法糖化外加酶糖化法七思考题啤酒糖化中要提高麦汁 氨基氮水平的方法有哪些？你所采用的方法优点是什么？补充材料：1、麦芽汁制备俗称糖化。所谓糖化是指将麦芽和辅料中高分子贮藏物质（如蛋白质、淀粉、半纤维素等机器分解中间产物）通过麦芽中各种水解酶类（或外加酶制剂）作用降解为低分子物质并溶于水的过程。溶解于水的各种干物质称为浸出物，糖化后未经过滤的料液称为糖化醪，过滤后的清夜称为麦芽汁，麦芽汁中浸出物含量和原料干物质之比（质量分数）称为无水浸出率。麦芽的组成是酿造啤酒的物质基础之一，麦芽汁的组分和颜色关系将直接影响成品的类型和质量。2、啤酒的度数啤酒的度数则不表示乙醇的含量,而是表示啤酒生产原料,也就是麦芽汁的浓度,以 12 度的啤酒为例,是麦芽汁发酵前浸出物的浓度为 12%(重量比)。麦芽汁中的浸出物是多种成分的混合物,以麦芽糖为主。啤酒商标上标的度数却不是指酒精含量，而是指麦芽汁中含糖的浓度，通常以每公斤麦芽汁中含糖类物质的质量( 克) 的 1/10 为标准例：每公斤麦芽汁中若含有 120 克糖类物质，该啤酒就是 12 度，其酒精含量一般为 3-3.5。实验八 啤酒的酿造一实验目的了解和掌握啤酒酿造全过程及其中间控制。二实验原理利用啤酒酵母对麦芽汁中某些组分进行一系列的生物化学代谢，产生酒精及各种风味物质，形成具有独特风味的酿造酒。啤酒是酒类中酒精含量最低的饮料酒，而且营养丰富。三实验材料与方法1实验材料浓缩麦芽汁、活性干酵母、发酵桶、p计及糖度计等。2实验方法（1）啤酒酸度的测定电位滴定法（2）啤酒中酒精含量的测定（3）啤酒的色度测定比色法（4）啤酒中细菌总数显微镜直接计数法（5）啤酒中大肠菌群数的测定平板计数法四实验步骤1酵母活化：取 2g 蔗糖放入 100mL 水中，煮沸晾凉至 25左右。称取 4g 活性干酵母放入上述糖水中，在 25下保温 30min 以上。2称取 350g 白糖放入 1000mL 水中，煮沸制成一定浓度的糖水。将约 600g 浓缩麦芽汁和上述以冷却的糖水倒入发酵桶中，并加入 7工艺用水（纯净水、净化水或凉开水等），搅拌均匀。调整麦汁的温度使其接近室温。测定麦汁的浓度和 p，将活化好的酵母倒入发酵桶中，再搅拌均匀。盖好桶盖，即进入前发酵阶段。3发酵液的浓度下降到 4.5，主发酵阶段结束，转入后发酵阶段。4 将前发酵的酒液装入干净的瓶子中，每瓶再加入浓度为 30的糖水mL。将液量控制在 8590。在室温下放至 2d 后转入 1冷藏柜中，后发酵周以上，即可成为成品啤酒。五实验结果测定啤酒酸度、酒精含量、色度、细菌总数、大肠菌群数，并将数据填入下表。酸度 酒精含量 色度 细菌总数 肠菌群数六思考题1、为什么酿造啤酒要进行后发酵处理？2、本实验中麦芽起到哪二个作用？实验九 啤酒风味保鲜期的测定一实验目的通过对啤酒风味保鲜期的预测，了解啤酒的抗老化能力以及啤酒的保鲜时间。二实验原理在糖化发酵过程中会产生一定量的羰基化合物，它们是啤酒老化的主要原因。用硫代巴比妥酸法（TBA）测定的是以二烯醛为代表的一类羰基化合物，而非啤酒、麦汁中全部的羰基化合物，硫代巴比妥酸与羰基化合物发生呈色反应，在 530nm 有吸收峰。三实验仪器及试剂（1）实验仪器：分光光度计，恒温水浴锅等。（2）试剂：TBA 溶液：取 0.33g 硫代巴比妥酸，用 50%（v/v）的冰醋酸溶解并定溶至 100ml ，配为 0.33%（v/v）的 TBA 溶液。四实验步骤（1）取同一批次的啤酒，其中四瓶放置于 60水中加速陈化，每隔 12h 从水浴锅中取走一瓶啤酒，轻拿轻放，冷却至室温后放于 4冰箱内。另取一瓶作为对照事先放置于冰箱中保存。（2）待四个样品全部陈化后进行过滤，取滤液，在 530nm 下测定不同的陈化样品的TBA 值（以对照啤酒为空白） ，计算TBA。CK 12h 24h 36h 48h水（ml） 2 0 0 0 0啤酒滤液（ml ） 0 2 2 2 2TBA 溶液（ml） 2 2 2 602 2充分混匀，在 60水浴锅中加热 60min 后，用冰水冷却在 530nm 处测定不同陈化时间的吸光度五实验结果1TBA 的测定结果12h 24h 36h 48hTBA2风味保鲜程度 RSV 的计算RSV=（12/TBA 12+24/TBA 24+36/TBA 36+48/TBA 48）/4六思考题RSV 的数值越大，表示成品啤酒的保鲜时间越长还是越短？实验十 反应器的安装与拆卸生物反应器是生物工程的重要组成部分，是生物技术转化为产品的关键设备，在生物工程中处于中心地位。机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是进行液体发酵的特殊设备。实验室使用的小型发酵罐，其容积可从 1 L 至数百升。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。一实验目的认识和了解生物反应器的结构与功能，掌握生物反应器安装和拆卸的操作规程。二基本原理园筒形反应器具有上盖和下盖，上盖可以取下，它与罐体是通过橡皮垫圈和螺栓密封的。盖上设有接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、消泡剂和酸碱液注入口、取样口、备用口、压力表、安全阀等；罐底部设有夹套层，用以热交换，罐内有搅拌桨叶、档板、空气分布器；中部侧面装有温度传感器及溶氧电极和 pH 电极插口。与罐体连接的部分布有无菌空气系统，并配备一台自动调控装置。整个装置处于工作状态时，必须保持无菌状态，而操作结束后，必须移走培养液，并进行清洗罐体等。因此必须进行安装和拆卸步骤。三实验装置16 升园柱形不锈钢机械搅拌式生物反应器（发酵罐） 。机械搅拌式发酵罐控制台 计算机pH 控制部分温度控制部分溶氧控制部分进气取样管图 3 16L 机械通风式搅拌生物反应器四实验步骤首先拧下螺栓，打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。插入校正完毕的 pH 电极和氧电极于罐侧面相关位置，并与放大器连接。加入配置好的培养液，加盖（由于盖上的零件较多，必须对准位置后再盖上去） ，并对称地拧紧螺母，直至上盖被密封固定。将事先清洗干净并开启的尾气过滤器装于盖上，安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管，以及灭过菌的无菌空气过滤器进气管等，剩余的孔洞须用硅胶塞和瞎塞拧紧备用。使用完毕后拆卸时与以上步骤相反，并彻底清洗罐体及零件。五思考题为什么要进行生物反应器安装和拆卸，这两个操作步骤是在生物反应的什么时间进行的？实验十一 pH 电极的校正一实验目的了解 pH 电极的基本原理，掌握其校正方法及步骤。二基本原理待校正的 pH 电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起的复合玻璃电极。复合电极的内层玻璃管与玻璃球泡相通，内充以恒定 pH 植的标准缓冲溶液，从中引出氯化银电极导线，组成玻璃电极（即指示电极） 。在外层玻璃管引入银丝，其表面覆盖一层AgCl 薄膜。从上部扩大部分边上的注液口加入饱和氯化钾溶液，就形成氯化银电极，在外玻璃管的下部，开有一小口，装有多孔陶瓷芯，使 KCl 溶液可稍许向外溶液渗漏，即所谓液络部。气体流量计尾气压力表观察灯泡沫传感器复合电极的基本性能参数有电极转换系数（也称 Nernst 斜率） ，电极零电位，电极内阻，参比电阻，电极响应时间，耐高温冲击的次数等等，它们都有一定的要求和测试方法，对新使用的电极或已经发酵运行一段时间的电极，其性能参数要发生变化，对某些性能参数要进行测定，决定是否可投入使用。图 4 复合玻璃电极的构造三实验步骤：打开 pH 操纵器、测量范围和温度开关，将 pH 电极的电插头插入放大器插孔。首先测标准 pH 试剂的温度，然后记下缓冲液瓶子标签上的温度条件下所得到 pH 值。缓冲液和电极组件应该是在同样的温度，如果不是，则允许 23 分钟时间达到热平衡。温度恒定后，调节温度。将电极浸入缓冲液 pH7.0（0.2mol/LNa 2HPO4 16.47mL，0.1mol/L 柠檬酸 3.53mL）中，一获得稳定读数就立即将 pH 表（asymmetry ）设定到缓冲液的值。将蒸馏水漂洗电极玻璃球泡部位，然后用软纸轻轻擦干，再浸入第二种缓冲液pH9.2（1/15mol/LNa 2HPO4）或 pH4.0（0.2mol/LNa 2HPO4 7.71mL，0.1mol/L 柠檬酸12.29mL）中，获得稳定读数后，用斜率电位计（mV/pH）纠正 pH 值。如此反复 23 次，直至读数与被测试剂相同并稳定。以上程序不得颠倒，否则不能获得有效的校准。四思考题（ 1）为什么 pH 电极在生物反应之前要进行校正？（ 2）在 pH 电极的校正操作过程中应注意哪些事项？实验十二 氧电极的校正一实验目的了解溶解氧（DO）电极的基本原理，掌握其校正方法。二基本原理：a电解型电极 b原电池型电极图 5 氧电极的类型a、(极谱型 )电解型电极电解型电极是由一个阴极（贵重金属如铂或金） 、一个阳极（Ag/AgCl）和一种电解质，如中性 NaCl 溶液组成的。在某一溶氧浓度一定的溶液系统中，通过电极之间约 0.60.8 的电压，使溶解氧在阴极上被还原，从电极的电流电压极谱图（图 6）可以看出，OA 为极谱残余电流；A 点为氧的分解电压，当外加电压大于分解电压 A，这时电极输出电流随着电压增大而增加，当达 B 点后，电极电流就不再随着外加电压而增加，即电极电压进入恒图 6 扩散电流与氧浓度的关系定区，这时称为饱和电流或扩散电流。当外加电压继续增至 C 点时，电极输出电流迅速增加，这是由于水被还原成氧所造成的。从图中也可看出饱和电流与溶氧浓度成正比关系。因此，只要把外加电压固定在电流电压图中的平坦部分，电极输出电流就可以校正测量溶解氧，这个固定电压常选在 0.60.8V 之间。反应式为：阴极： O2 + 2H2O +2e- H2O2 + 2OH-H2O2 +2e- 2OH- 阳极： Ag +Cl- AgCl + e-总反应：4Ag + O 2 + 2H2O + 4Cl- 4AgCl + 4OH- 用 NaCl 或 KCl 作为电解质，电解质在使用过程中被消耗，必须在一段时间后补充。b、原电池型电极原电池型电极不采用外电压，而是选用参比电位比阴极电位高的碱性金属（锌、铝或镉）作阳极，以贵重金属（银或金）作阴极，这是氧就在阴极自发地被还原，产生电动势。银铅电池型电极的电子反应为：阴极：O 2 +2H2O + 4e- 4OH - 阳极：Pb Pb 2+ + 2e-总反应：O 2 +2Pb + 2H2O 2Pb(OH) 2 随着时间的推移，这一反应也会氧化电极。为了校正氧电极，使液体被空气中的氧饱和，假定饱和度被扩大至 100%显示。电极的零点适宜用氧气调节，因为电极显示是氧分压而不是氧浓度，显然在 1M KCl 溶液中饱和时氧的实际浓度只有其在水中浓度的 73%，但还是假定空气饱和时，在 1M KCl 溶液中得到与在水中相等的数值显示。三实验器材及仪器氮气、压缩空气、水浴锅、铁架台、推车、带夹套烧杯、气体分布管、胶管、磁力搅拌器、DO 测量放大器（指示组件） 。四实验步骤将氧电极置于与恒温水浴（温度调至与被测发酵液相等）相连接的内部盛有水的带夹套烧杯中，并置于气体分布管的上方，电极的连线与放大器连接并将放大器开关打开。a.设置 0：设置压力选择器至 0（mmHg ） ，调节零电位器，使数字显示器达到 0 值。b.设置满量程：将空气通入气体分布管，使带夹套烧杯中的水被空气饱和，使其达到充分搅拌。设置压力选择器至三档中的任何一档（即 100，200，800 mmHg） ，使数字显示器指向约 95%，再操作斜度电位器，仔细调节指示值，至 95%显示。c.精度检查：用惰性气体 N2 通入气体分布管，使水饱和。显示器将指向 0，而在此操作期间，压力选择器、0 和斜度电位器不在调节。五思考题（ 1）为什么在生物反应之前要对 DO 电极进行校正？是否每次反应都必须校正？为什么？（ 2）在校正溶氧电极时应如何控制数字显示器，为什么？实验十三 体积溶氧传递系数的测定一实验目的学习运用溶氧电极法测量计数获得 kLa 值。二基本原理单位体积发酵的氧传递系数 kLa 可称为“通气效率” ，可以用来表征发酵罐的通气情况。由于各发酵罐设备情况不同以及整个发酵过程中培养液物性的变化，k La 不是常数，通过kLa 的测定，就可以了解发酵过程中氧的传递效果的好坏，对提高氧的利用率和增产节能都有着重要意义。三实验方法（1）根据电极显示值求 C 值：如果温度为 T 时，水被空气所饱和，可得到氧分压式：Po2 = （P PH2O ）Yo 2 空气P总压 PH2O水蒸气压=f（T）Yo2 空气 空气中氧的分子分数 =0.21当总压为 1bar，温度为 20时Po2 = （1 2.3410 -2）0.21= 0.205（bar）相应的浓度可根据 Henry 定律计算：H = Po2/Xo2 *Xo2 *液相中氧的分子分数 = ci水的克分子浓度 = = 55.55ci108温度 T = 30OC 时水中的亨利常数：H （T = 30 OC）= 4.8110 4 barC* = 0.2155.55/4.81104空气氧饱和浓度值 C* = 2.4210-4Mol/L将电极显示值 E（%饱和）换算成氧浓度为：C = E/100C* = E/1002.4210-4Mol/L（2）K La 的获得：可以运用动态测定法获得 KLa 值，此法就是在非稳定时用下列衡算式：=kLa (C*C)Qo 2 X（1）dct首先观察暂停通气后 C 值随是的下降速度率求得一 Qo2 值，其次再观察重新通气时的 C 值 (图 7)。图 7 动态电极法测定 kLa 的曲线（a） 停止通气再通气实施的溶解氧浓度变化（b） 利用动态过程的数据求将（1）式加以整理：C = ( +Qo2X) + C*（2）L1Kadct将重新通气后的过渡阶段 C 值对应于（ + Qo2 X）值作图，应当得到一直线，这dct条直线的斜率就表示（ ）值。La四实验器材溶氧电极、发酵罐、培养液、控制台等。五实验步骤1溶解氧（DO）浓度的测定（1）将组装好的氧电极与测定装置连接好，插入水中，接通电源约 5min （长时间未使用的氧电极预热约 30 min） 。（2）将氧电极浸入饱和亚硫酸钠溶液（无氧水）中，DO 值减小到一定后，调节溶氧仪的调节旋钮，使仪表指针至零点。（3）从无氧水中取出氧电极后，用水冲洗，并用滤纸吸去覆膜上的水滴后将氧电极插入已充分通入空气的纯水中，至指针稳定后，调节校正旋钮使指针与饱和 DO 值吻合。（4）重复（2） 、 （3）两步骤，使显示数值稳定在一定范围内。2k La 的测定（1）将培养基加入至发酵罐，插入调整好的氧电极，设定好相应的温度、通风量及搅拌转速。（2）连接氧电极输出端。（3）接入适量的种子液，开始培养。（4）培养一定时间，此时 DO 值为一定，停止通气。（5）当 DO 值下降至 12mg/Kg 时，通气，DO 值迅速回升，渐渐恢复至原值。（6）进行不少 kLa 于 3 个搅拌转速条件下的测定，每一搅拌转速条件至少进行两次测定，利用转速（n）计算 kLa 的值。A 停止通气B 开始通气六实验结果T（ ） C* E C L1Ka七思考题1、为什么要测定 kLa？本实验是用何种方法测定 kLa 值的？2、测定 kLa 值有没有其他方法？采用不同的方法测得的 kLa 值能否进行比较，为什么？实验十四 反应器培养液的灭菌与接种培养一实验目的学习和掌握生物反应器灭菌与接种培养的操作，认识和掌握运用现代化反应器的操作规程及方法。二基本原理一般小型台式玻璃生物反应器置于高压中灭菌，而金属制生物反应器的灭菌是采用夹套层蒸汽加热灭菌的方式进行的，可将反应器内培养液的温度升至 121，以达到灭菌的效果，灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。三材料及仪器1材料菌种：黑曲霉培养基：5%葡萄糖，1%酵母汁，0.5%蛋白胨，pH5.5。2仪器与设备16 升不锈钢制生物反应器、反应器控制台、三角瓶、胶管、接种针、火柴。四实验步骤1灭菌在反应器安装就序后，接通电源，打开控制台总开关，开启冷却水阀，分别按下温度、pH、溶解氧、搅拌器开关键，调节搅拌器转速约 1000rpm， 调整灭菌时间（30min） ，设置灭菌温度（121） ，同时，按下灭菌开关键。使电加热器对罐底夹套层进行加热，罐内温度逐渐上升，待