G蛋白及其受体的研究

,2016.11.19,G蛋白及其 受体的研究进展,讲述步骤,01,GPCR的概念,2.由，三个不同亚基组成。激素与激素受体合诱导GTP跟G蛋白结合的GDP进行交换结果激活位于信号传导途径中下游的腺苷酸环化酶。3. G蛋白将细胞外的第一信使肾上腺素等激素和细胞内的腺苷酸环化酶催化的腺苷酸环化生成的第二信使cAMP联系起来。具有内源GTP酶活性。,1. G蛋白是指能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有GTP水解酶活性的一类信号转导蛋白,是细胞信号传导中的重要蛋白质,GPCR分类,1,2,3,其中亚单位在多数G蛋白中 都非常类似，分子量36kDa左右。亚单位分子量在8-11kDa之间，除Gt外，大多数G蛋白的亚单位都是相同的。,两个亚单位的不同可以将蛋白分为Gs、Gi、Go、Gq、G12及Gt等六类。这些不同类型的G蛋白在信号传递过程各种发挥不同的作用,GPCRs的概念,02,1. G蛋白偶联受体,是一大类膜蛋白受体的统称。2.这类受体的共同点是其立体结构中都有七个跨膜螺旋，且其肽链的C端和连接第5和第6个跨膜螺旋的胞内环上都有G蛋白（鸟苷酸结合蛋白）的结合位点。3.目前为止，研究显示G蛋白偶联受体只见于真核生物之中，而 且参与了很多细胞信号转导过程。,GPCRs的概念,GPCRs的结构与分类,03,GPCRs的结构,GPCRs的分类,04,GPCRGPCRs研究进展,GPCR被发现的历史,Lefkowitz通过同位素标记的配体结合等实验提出配体-受体-效应器相互作用的三级复合物模型。,Lefkowitz 2011年第一次在原子分辨率阐明了GPCR参与信号转导的机制,3 GPCR工作机制研究,方法,随后Lefkowitz实验室克隆的GPCR,标记并分离纯化扩散型配体的GPCR,诺贝尔奖得主,诺贝尔奖得主罗伯特莱夫科维茨,1,2,1,2,b2肾上腺素能受体,异丙肾上腺素,Lefkowitz,肾上腺素受体扩散型配体的GPCR的基因克隆,基于这一推论，Lefkowitz，Kobilka等人很快成功克隆了编码人类b2肾上腺素受体蛋白的cDNA，编码人类b1肾上腺素受体、人类血小板2肾上腺素受体、5-羟色胺受体以及第一个孤儿受体等在内的一系列受体的基因,工作中得到的信息和技术也帮助了嗅觉受体这一超家族的发现和克隆,诺贝尔奖得主布莱恩-科比尔卡,2001,2007,2007年，Kobilka利用T4溶菌酶融合蛋白方法解析了第一个非视紫红质GPCR晶体结构：人beta2肾上腺素受体，他还独立地通过抗体片段介导法解析了人beta2肾上腺素受体的结构。,GPCR工作机制研究,1.中国科学院生物物理所的王江云课题组和山东大学医学院的孙金课题组于2015年9月8号在权威期刊Nature communications上发表了研究论文，报道了他们应用最新的非天然氨基酸编码技术，揭示了G蛋白偶联受体重要的信号转导机制的详细过程,研究GPCR,GPCRs的新发现,2. 研究 GPCRs 与 G 蛋白相互作用的传统技术包 括免疫共沉淀、免疫共定位、GST 融合蛋白沉降等， 这些技术自身存在一定的不足，无法满足在生理条 件下检测受体或蛋白的相互作用。 而BRET、TIRF 及 FRET 等相关技术的出现解决了这一难题，它们 可以实时、动态、连续地监测生理状态下受体-受体、 受体 -G 蛋白间的动力学关系，并且不会对细胞造 成损伤，这为受体与 G 蛋白相互作用的动力学研究 提供了更加便利、准确的研究手段。,研究GPCR,GPCRs的新发现,1,2,3,获得第一 个人 GPCR 的精细结构，也是第 2 个 GPCR 的高 分辨率晶体结构，该结果被 Science 杂志评为 2007 年十大科技进展之一.,2008 年 5 月 Midori Murakami1 和 Tsutomu Kouyama 等报道了从乌贼视细胞中分离得到的 Rhodopsin 的精细结构，分辨率达 3.7 A，它与牛 Rhodopsin 结 构 基 本 相 似,主 要 区 别 在 于 牛 Rhodopsin 的 N 末 端 为 无 规 卷 曲 ， 而 乌 贼 Rhodopsin 的 N 末端形成了规则的 螺旋结构， 这可能与其生活的海洋环境有密切关系.,2008 年 7 月 Tony Warne 等采用缺失突变 的方法，将火鸡 1 肾上腺素受体中不稳定的氨基 酸进行点突变，,同时将较长的 N 末端、C 末端以 及胞内 loop 进行缺失突变，降低其柔性，增加了 稳定性，最终获得了该突变体 2.7 A的精细结构.,研究GPCR,GPCRs的新发现,1,2,1）胆酸钠；2）饱和 剂量的受体拮抗剂 ZM241385；3） 胆固醇琥珀酸 单酯. 最终获得了该突变体（A2A-T4L-C）与拮 抗剂 ZM241385 复合体 2.6 魡 的晶体结构，这也 是第二个人 GPCR 的高分辨率晶体结构.,除了上述两个天然分离的 Rhodopsin 的结构 外，另外 3 个重组表达得到的 GPCR 晶体结构 （见表 ）也为我们提供了两条可能获得 GPCR 高 分辨率晶体结构的方法，即融合蛋白法和缺失突 变法.,尽管二者都对原始蛋白进行了结构改造， 这样获得的晶体结构可能会与其实际结构有一 定的差别，但也为我们更多了解该蛋白的结构与 功能关系提供了重要的参考.,1.近年来，有些学者还提出了另外一种可能获 得高质量膜蛋白晶体的方法：盒式突变法. 即采 用渐进式的多位点突变技术，以亲水残基系统性 地替换 GPCR 蛋白跨膜螺旋表面的多个疏水残