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细胞培养技术 药物科学与技术学院 周立军 1 学习资料 参考书目 细胞培养 世界图书出版公司 1996年 培养细胞学与细胞培养技术 上海科学技术出版社 2004年 2 学习资料 本次课内容细胞培养的基本知识 一 绪论培养法的种类 培养法的发展 细胞培养的常用术语 培养细胞的作用及意义 培养法的应用二 培养细胞的特征培养细胞的生长方式和类型 培养细胞的生长特点和生长增殖过程 细胞培养的条件及影响因素 3 学习资料 一 绪论 4 学习资料 细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术 即 从活体中取出小块组织分离出细胞 在一定条件下进行培养 使之能继续生存 生长 增殖的一种方法 涉及有细胞生物学 生物化学与分子生物学 动物学与植物学 病原学 肿瘤学 遗传学 生物工程学甚至光学 物理学等等学科 因其涉及面很广所以已经渗透到生命科学的各个领域 细胞培养 cellculture 5 学习资料 组织培养的概念 组织培养 tissueculture 其本意是指从体内取出组织和细胞 模拟体内生理环境 在无菌 适当温度和一定营养条件下 使之生存和生长并维持其结构和功能的方法 6 学习资料 器官培养 Organculture 指的是应用和组织培养相似的条件 培养的是器官的原基 器官的一部分或整个器官 使之在体外生存 生长和保持一定功能的方法 以上三个层次的培养 又可统称之为体外培养 invitro 7 学习资料 培养法的种类 体外培养细胞培养组织培养器官培养 8 学习资料 体外培养种类 9 学习资料 细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种 群体培养 massculture 即将大量细胞置于培养瓶中 让其贴壁或悬浮生长 形成均匀的单层细胞或单细胞悬液 克隆培养 cloneculture 即将少数细胞加入培养瓶中 贴壁后彼此间隔距离较远 经过繁殖每一个细胞形成一个集落 称为克隆 10 学习资料 群体培养 左 和克隆培养 右 11 学习资料 原代培养第4天 成纤维样细胞散布于培养瓶底 个别集落形成 细胞围绕中心漩涡状排列 100 12 学习资料 原代培养第7天 多个集落形成并融合 100 13 学习资料 培养法的发展 组织培养法的发展经历近百年 德国人Roux 1885 用温生理盐水体外培养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的萌芽试验 1903年Jolly用盖片悬滴培养法 培养蝾螈白细胞生活一个月 提示组织或细胞离体后 在人工培养条件下 仍能生存 发展简史 14 学习资料 培养法的发展 关于神经轴突的结构和形成有争议 哈里森 生理学家 首先解剖了蛙胚的原始脊髓节段在淋巴液中进行培养 在显微镜下观察到从神经芽细胞延伸出神经轴突的状况 建立起一套合理的无菌培养技术 哈里森悬滴培养法 发展简史 15 学习资料 哈里森悬滴培养法 将蛙胚原始脊髓节段 移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴的盖玻片上 淋巴很快凝固 使组织小块固定在一定的位置上 然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上 盖玻片的周缘用蜡封固 蛙胚神经组织存活了数周 体外培养组织和细胞的基本模式系统 发展简史 16 学习资料 卡氏瓶的发明 Carrel用反复传代的方法使细胞系存活34年 他采用的无菌技术 以及后来设计的培养瓶 卡氏瓶 Carrelflask 等都是对组织培养的重要贡献 特别是他的连续培养 为后来的传代培养奠定了基础 发展简史 17 学习资料 组织培养发展示意图 1923年 Carrel设计了卡式瓶培养法 扩大了组织的生存空间 1924年Maximow的双盖片培养法 使之更易于传代和减少污染 发展简史 18 学习资料 1957年Dulbecco等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法 获得了的单层细胞培养 单层培养成了组织培养普遍应用的技术 促进了细胞系 cellline 的建立 近年各种条件已商品化系列化 应用冷冻技术 各国建立细胞库 发展简史 19 学习资料 我国组织培养的发展 20世纪30年代传入我国 20世纪50年代起步 20世纪70年代 成为医学和生物学研究中应用的手段 20 学习资料 组织培养常用术语 原代培养 primaryculture 从直接取自生物体细胞 组织或器官开始的培养 传代培养 passageculture 将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养 注 传代 passage subculture 21 学习资料 原代培养 胎儿细胞培养比成人容易 成体组织中成纤维细胞 肾上皮细胞比较容易 上皮细胞培养难 细胞间的分离酶 胰蛋白酶 胶原酶 单一种类细胞的分离培养 根据培养条件 培养基 细胞接着面的条件 接着速度 离心法等 术语 22 学习资料 细胞系 cellline 原代培养经首次传代成功后即成细胞系 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成 细胞株 cellstrain 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志 并能稳定保持这些特性的培养物 克隆 clone 指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体 术语 23 学习资料 有分化特性的细胞系和细胞株 24 学习资料 对细胞培养技术的评价 优点 1 活细胞 能长时间 直接观察 研究活细胞的形态 结构 生命活动 2 可控制 选择对象 均一性 重复性 类型 性质 阶段 调节条件 各种因素 物理 化学 生物等因素 利用方法 研究技术 记录方法 3 应用广 领域多 医学研究 生物技术 基因工程等对象广 各种动物 低等动物 高等动物 人类 一种动物 不同年龄 不同组织 正常或异常 肿瘤 4 较经济 可提供大量 同时 重复性好的 生物学性状相似的实验对象 25 学习资料 缺点 1 培养细胞会发生改变 2 对人员 设备等要求较高 与体内主要不同相对孤立 相对单一 缺乏体内的系统作用 失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 主要表现失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱 细胞趋向单一化 提示要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体 对细胞培养技术的评价 26 学习资料 细胞培养技术的研究 观察内容 细胞内活动 例如能量的代谢 DNA转录 凋亡及蛋白合成等 细胞内部与细胞外界之间的作用 如细胞对外界刺激的反应 药物对细胞的作用 细胞内产物的分泌等 细胞间的相互作用 如形态发生 细胞间的粘着作用 接触抑制 密度抑制等 细胞内的流动 如信号传导 钙离子的流动 RNA的移动 激素受体复合物的易位等 遗传学 如遗传分析 转染 转化等 27 学习资料 细胞培养的应用领域 一 在病毒学研究中的应用 二 在免疫学研究中的应用 三 在分子生物学研究中的应用 四 在遗传学研究中的应用 五 在药理学研究中的应用 六 在毒理学研究中的应用 七 在肿瘤学研究中的应用 八 在器官移植中的应用 28 学习资料 病毒检验方法 病毒学 29 学习资料 检测病毒 30 学习资料 杂交瘤技术Hybridomas 免疫学 31 学习资料 单克隆抗体制备 免疫学 32 学习资料 在分子生物学研究中的应用 1 体外培养细胞的转化2 DNA转导技术3 基因诊断和基因治疗 33 学习资料 器官移植 组织工程 种子细胞 干细胞 支架材料 34 学习资料 组织工程 35 学习资料 36 学习资料 37 学习资料 38 学习资料 39 学习资料 40 学习资料 41 学习资料 42 学习资料 43 学习资料 44 学习资料 二 培养细胞的基本特征 培养细胞的生长方式和类型培养细胞的生长特点和生长增殖过程细胞培养的条件及影响因素 45 学习资料 一 培养细胞的生长方式和类型 粘附型细胞 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞 如 成纤维细胞 心肌与平滑肌细胞 表皮细胞 骨与软骨细胞 肿瘤细胞悬浮型细胞 不必附着于固相支持物表面 而在悬浮状态下即可生长的细胞 如 血 脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞 46 学习资料 粘附型 贴壁型 细胞 粘附 是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式细胞在体内 外的粘附方式存在差异体内 粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 体外 细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同 47 学习资料 粘附型细胞 48 学习资料 成纤维型细胞 上皮型细胞 49 学习资料 游走型细胞 多形型细胞 50 学习资料 成纤维型细胞 来源 中胚层间充质组织起源的细胞 如 成纤维细胞 心肌 平滑肌 成骨细胞 血管内皮细胞 形态 类似体内成纤维细胞的形态 胞体呈梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2 3个长短不等的突起 中央有卵圆形核 生长特点 排列成放射状 漩涡状生长 51 学习资料 上皮型细胞 来源 起源于内 外胚层的细胞 如 皮肤及其衍生物 消化道 乳腺 肺泡 上皮性肿瘤等 形态 类似体内的上皮细胞 呈扁平 不规则 多角形 中有圆形核 生长特点 细胞紧密相连成单层膜相靠 紧密相连 成薄层 铺石状 52 学习资料 培养细胞的形态不稳定 可因各种因素而发生改变 如pH 细胞密度 污染等因素 HeLa细胞 血清高血清 成纤维样细胞低血清 上皮样细胞pH标准pH 上皮样细胞太酸或太碱 成纤维样细胞细胞密度低密度 成纤维样细胞高密度 上皮样细胞转化与否未转化 成纤维样细胞转化后 上皮样细胞 粘附型细胞 53 学习资料 54 学习资料 55 学习资料 悬浮型细胞 概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源 取自血液 脾或骨髓 尤以血中白细胞肿瘤细胞为主 特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形 呈单个或小细胞团 56 学习资料 优点 生存空间大 提供数量大传代方便 不需消化 易于收获可获得稳定状态缺点 观察不方便很多细胞不能悬浮生长 尤以正常细胞 悬浮型细胞 57 学习资料 58 学习资料 培养细胞的生长特点 粘附并伸展是大多数体外培养细胞的基本生长特点 细胞在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着 与支持物形成一些接触点 接着细胞逐渐呈扁平或放射状伸展 逐渐形成上皮型或成纤维型或其他类型生长 密度依赖性细胞接种密度过高或过低都会影响细胞的生长 增殖 当细胞粘附生长 融合成单层时 细胞变得较为拥挤 而扁平形状的程度减少 与培养基的接触面减少 同时 培养基中的营养物逐渐消耗 细胞分裂减弱 增殖减慢 59 学习资料 二 培养细胞的生长增殖过程 单个细胞的细胞周期 cellcycle 细胞系的生长过程培养细胞传代的生存期 60 学习资料 单个细胞的细胞周期 cellcycle 生长增殖过程 61 学习资料 组织培养细胞生命期 原代培养期传代期衰退期 62 学习资料 原代培养期 又称初代培养期 primaryculture 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段 一般持续1 4周 此期细胞呈活跃的移动 可见细胞分裂 但不旺盛 细胞形态相似 细胞群是异质的 也即各细胞的遗传性状互不相同 细胞相互依存性强 63 学习资料 传代培养期初代培养期一经传代后便改称做细胞系cellline 此期为三期中最长 可维持二倍体核型 二倍体细胞系 当传代30 50代后 细胞增殖逐渐缓慢 以致完全停止 衰退期细胞仍然生存 但增殖很慢或不增殖 细胞形态轮廓增强 最后衰退凋亡 64 学习资料 体外培养细胞一代增殖生长过程 65 学习资料 第3代BMSCs的分裂指数曲线 66 学习资料 接触抑制 contactinhibition 贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合 相互接触后便停止了分裂增殖 不再进入S期 也不会出现交叉重叠生长 恶性细胞无接触抑制现象 所以可将其作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一 密度抑制 densityinhibition 培养液营养成分减少 代谢产物增多时 细胞因营养的枯竭和代谢物的影响 发生密度抑制 导致细胞分裂停止 培养细胞生长过程中的特点 67 学习资料 传代细胞可连续传7 10代 细胞形状基本相同 但随着传代次数增多 细胞逐渐呈老化现象 表现为 细胞增殖速度明显减慢 胞浆中出现空泡及颗粒样物质 细胞碎片增多 细胞形态变为扁平 失去贴壁能力 从培养瓶底脱落 68 学习资料 三 细胞培养的条件 水 高度纯化糖 葡萄糖氨基酸 12种维生素无机离子和微量元素促生长因子 69 学习资料 各种培养基 70 学习资料 71 学习资料 72 学习资料 血清 血清的种类血清的主要成分及主要作用血清的使用与储存影响血清的各种因素细胞培养中使用血清的缺点 73 学习资料 1 血清的种类胎牛血清 剖腹产的胎牛牛血清新生牛血清 出生24h之内的新生牛小牛血清 出生10 30d的小牛 人血清 马血清 羊血清 2 血清的主要成分及主要作用血清是由血浆去除纤维蛋白而形成 血清中含有各种血浆蛋白 多肽 脂肪 碳水化合物 生长因子 激素 无机物等 这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的 74 学习资料 75 学习资料 76 学习资料 血清的主要作用 提供基本营养物质提供贴壁和扩展因子 FN LN 提供激素及各种生长因子 FGF EGF PDGF 提供结合蛋白 中和代谢产物及蛋白分解酶等细胞障碍因素 对培养中的细胞提供某些保护作用注意点 血清型号 种类不同 所含营养因素有差别 不可忽视 在需要观察细胞某种特性时 血清使问题变复杂 要除去 77 学习资料 血清的使用与储存 使用前的处理56 灭活30min 去除补体成分 趋势 大部分细胞培养不需灭活 需要灭活的 巨噬细胞 肥大细胞 血小板 淋巴细胞等 储存条件灭活后分装成小包装 10mL 20mL 50mL 20 储存 使用前4 融化 使用浓度一般为5 20 最常用的是10 78 学习资料 影响血清的各种因素 年龄 较老动物的血清对细胞生长有抑制作用血型 AB型血清比A型和O型血清对细胞生长有利血色素胆红质脂肪酸血清在培养液中的浓度并非越高越好 79 学习资料 细胞培养中使用血清的缺点 使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态 如 血清可以促进成纤维细胞的生长 同时会抑制表皮角质细胞的生长 血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用 如 多胺氧化酶每批血清之间都有差别 其成分不能保持一致 取材过程中有可能带入支原体 病毒 对培养细胞产生影响 80 学习资料 影响细胞生长的因素 温度渗透压气体环境和pH无毒和有毒辐射线和超声波细胞接种密度容器转动速度和悬浮搅动速度 81 学习资料 温度 一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度37 38 温度过高或过低都会影响到细胞的生长 温度对细胞生长的影响 82 学习资料 低温 在低温下 细胞的代谢活力及核分裂降低 温度不低于0 时 虽影响细胞代谢 但并无伤害作用 再把细胞置于25 35 时 细胞仍能生存和生长 但速度减慢 若温度过低 在降到冰点以下时 细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡 若向培养液中加入甘油或二甲基亚砜等 封入冻存管 置于液氮中 细胞可耐受 70 以下温度 能长期储存 解冻后细胞复苏 仍能继续生长增殖 生物性状不受影响 83 学习资料 高温 细胞在40 数小时后 再置回37 培养 细胞仍能继续生长 但如果在40 下暴露时间太长 对细胞生长不利 甚至变圆脱离瓶底 细胞在39 40 培养1h 能受到一定损伤 但仍有可能恢复 但不能忍受温度再升高2 持续数小时 即在41 42 中培养1h 细胞损伤严重 温度至43 以上时细胞多数被杀死 高温主要引起酶的灭活 类脂质破坏 核分裂的破坏 产生凝固酶使细胞发生凝固 另外使蛋白质变性 84 学习资料 气体环境和pH 氧 O2 参加细胞的三羧酸循环 产生能量以供给细胞生长 增殖和合成各种所需成分 采用开放式培养时 碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养 一般要把细胞置于95 空气加5 二氧化碳的混合气体环境中 85 学习资料 二氧化碳 CO2 CO2既是细胞的代谢产物 又是细胞生长所必需的成分 并与维持培养液的pH有关 大多数细胞适于在pH7 2 7 4条件下生长 低于pH6 8或高于pH7 6对细胞有害 甚至造成细胞退化或死亡 细胞对碱性不如对酸性的变化耐受 偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利 随细胞数量的增多 代谢加强 释放CO2增多 使pH降低 为了维持培养基恒定的pH 多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂 羟乙基哌嗪乙硫磺酸 Hepes 对细胞无毒性 也不起缓冲作用 主要作用是防止pH迅速变动 在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值 86 学习资料 无污染及无毒 直接或间接接触的器皿 材料污染 细菌等微生物 细胞间 有害物质 87 学习资料 本章小结 培养细胞的生长方式和类型培养细胞的生长特点和生长增殖过程细胞培养的条件及影响因素 88 学习资料 细胞培养室的设置 设备和准备工作 89 学习资料 一 细胞培养的必备设施 无菌实验室超净工作台恒温培养箱其他设备 电热干燥箱 冰箱 水纯化装置 普通光学显微镜 倒置显微镜 细胞液氮储存器 离心机 恒温水域锅 消毒器 抽滤装置等 90 学习资料 无菌实验室 设计原则 防治微生物污染和有害因素影响 要求工作环境清洁 空气清新