DNA的粗提取和鉴定.ppt

DNA的粗提取和鉴定 目的要求 1 了解从细胞中提取DNA的基本原理2 初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法3 观察提取出来的DNA 实验思路 1 DNA从哪提取 2 怎样将DNA与细胞中的其他物质分离 3 怎样鉴定我们提取的DNA 实验原理 1 DNA在NaCl溶液中的溶解度 是随着NaCl的浓度的变化而改变的 当NaCl的物质的量浓度为0 14mol L时 DNA的溶解度最低 利用这一原理 可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出 2 DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液 利用这一原理 可以进一步提取出含杂质较少的DNA 3 DNA遇二苯胺 沸水浴 会染成蓝色 因此 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 实验材料和用具 实验材料 1 鸡血细胞液 5 10ml 2 体积分数为95 的冷酒精溶液 实验前置于冰箱内冷却24h 3 蒸馏水 4 质量浓度为0 g ml的柠檬酸钠溶液 抗凝剂 5 物质的量浓度分别为2mol L和0 015mol L的NaCl溶液 6 二苯胺试剂 实验用具 铁架台 铁环 镊子 三角架 酒精灯 石棉网 载玻片 玻璃棒 滤纸 滴管 量筒 100ml 一个 烧杯 100ml 一个 50ml 500ml各二个 试管 20ml 二个 漏斗 试管夹 纱布 二 DNA的粗提取与鉴定的实验设计 一 实验材料的选取 材料 新鲜的鸡血 注意 本实验中 要往鸡血中加入抗凝剂 柠檬酸钠溶液 原则上只要含DNA的生物材料都可以 但是选取DNA含量相对较高的生物组织 成功率更大 1 先将新鲜的鸡血离心 获得鸡血细胞 2 在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水 同时用玻璃棒搅拌 过滤后收集滤液即可 二 破碎细胞 获取含DNA的滤液 1 破碎细胞 讨论 为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂 利用了什么原理 2 过滤 获取含DNA的滤液 三 去除滤液中的杂质 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论 此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分 答 可能含有核蛋白和RNA等杂质 讨论 为什么反复地溶解与析出DNA 能够去除杂质 答 用高盐浓度的溶液溶解DNA 能除去在高盐中不能溶解的杂质 用低盐浓度使DNA析出 能除去溶解在低盐溶液中的杂质 因此 通过反复溶解与析出DNA 就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质 四 DNA的析出与鉴定 DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液 体积分数为95 静置2 3min 溶液中会出现白色丝状物 这就是粗提取DNA 用玻璃棒沿一个方向搅拌 卷起丝状物 并用滤纸吸取上面的水 1 DNA的析出 2 DNA的鉴定 鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol L的NaCl溶液5ml于两只试管中 其中一只加入DNA丝状物 各加入二苯胺4ml试剂 混合均匀后 将试管置于沸水中加热5min 待试管冷却后 比较两只试管中溶液颜色的变化 看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色 一 案例一 以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取 三 实验案例 用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心 对设备要求较高 操作繁琐 历时较长 1 鸡血细胞做实验材料的原因 鸡血细胞核的DNA含量丰富 材料易得 4 课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为0 1g ml的柠檬酸纳溶液 抗凝剂 100ml 置于500ml烧杯中 注入新鲜的鸡血 约180ml 同时用玻璃棒搅拌 使血液与柠檬酸纳溶液充分混合 以免凝血 将烧杯中的血液置于冰箱内 精置一天 使血细胞自行沉淀 也可以将血液倒入离心管内 用1000r min 转每分 的离心机离心2min 血细胞沉淀于离心管底部 实验时 用吸管除去离心管上部的澄清液 就可以得到鸡血细胞液 过程 柠檬酸钠作用 防止血液凝固 作用机理 柠檬酸钠能与血浆中的Ca2 发生反应 生成柠檬酸钙络合物 血浆中游离的Ca2 大大减少 血液就不会凝固 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA 容易被玻璃容器吸附 所以在提取过程中为了减少DNA的损失 最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液 注意事项 讨论 提取鸡血中的DNA时 为什么除去血液中的上清液 答 血液分为两部分 一部分是血浆 一部分是血细胞 离心后除去的上清液是血浆 5 方法步骤 将制备好的鸡血细胞液5mL 10mL 注入到50mL烧杯中 向烧杯中加入蒸馏水20mL 同时用玻璃棒充分搅拌5min 使血细胞加速破裂 然后 用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL 取其滤液 提取鸡血细胞的细胞核物质 讨论 答 让细胞内浓度大于周围溶液的浓度 细胞会吸水以至胀破 1 为什么要加入蒸馏水 加入蒸馏水后细胞会有什么变化 2 用玻璃棒搅拌有什么意义 答 用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂 注意应沿一个方向快速搅拌 但也不能太快太猛 防止打碎DNA 3 滤去的是什么物质 得到的是什么 答 过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质 得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA 溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为2mol的溶40mL加入到滤液中 并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min 使其混合均匀 这时DNA在溶液中呈溶解状态 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水 同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌 这时烧杯中有丝状物出现 注意观察丝状物呈什么颜色 继续加入蒸馏水 溶液中出现的粘稠物会越来越多 当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水 这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0 14mol L 析出含DNA的粘稠物 讨论 加入蒸馏水的目的 降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点 使DNA从NaCl溶液中析出 将溶液中的DNA与其他杂质分离 这一步骤是实验成败的关键 实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水 并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌 以利于DNA分子的附着和缠绕 注意事项 滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗 过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中 含DNA的粘稠物被留在纱布上 将DNA的粘稠物再溶解 取1个50mL烧杯 向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol L的溶液20mL 用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中 用玻璃择不停地搅拌 使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中 过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100mL烧杯 用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液 取其滤液 DNA溶于滤液中 提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中 加入冷却的 酒精的体积分数为95 的溶液50mL 使用冷却的酒精 对DNA的凝集效果较佳 并用玻璃棒搅拌 溶液中会出现含杂质较少的丝状物 用玻璃棒将丝状物卷起 并用滤纸吸取上面的水分 这种丝状物的主要成分就是DNA 答 因为DNA不溶于冷酒精 而其他物质可以溶解在酒精中 使含杂质较少的DNA丝状物可以析出 悬浮于溶液中 讨论 2 观察丝状物呈什么颜色 答 白色 1 为什么要加50mL的冷酒精 取两支20mL的试管 各加入氯化钠的物质的量浓度为0 015mol L的溶液5mL 将丝状物放入其中一支试管中 用玻璃棒搅拌 使丝状物溶解 然后 向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂 混合均匀后 将试管置于沸水中加热5min 待试管冷却后 观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化 DNA的鉴定 讨论 答 有丝状物的试管变成蓝色 另一试管还是原来颜色 2 这一鉴定结果说明什么问题 1 比较两个试管中溶液的颜色有什么不同 答 提取出的丝状物是DNA 3 DNA的直径约为20 10 10m 实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小 答 DNA分子直径只有2nm 丝状物是多个DNA子聚在一起形成的 答 整个实验共 两次蒸馏水 三次过滤 两次析出 六次搅拌 6 讨论 两次蒸馏水 第一次 细胞吸水胀破第一步第二次 使DNA黏稠物析出第三步 1 此实验过程中有几次使用蒸馏水 几次过滤 几次析出 几次搅拌 分别在哪一步 过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关 第二次要用其滤出的黏稠物有关 所以要使用多层纱布 第一次和第三次均要用其滤液 使用的纱布为1 2层 三次过滤 第一次 DNA存在于滤液里第一步第二次 DNA被留在纱布上第四步第三次 DNA存在于滤液里第六步 两次析出 第一次 用0 14mol L的NaCI溶液含杂质多 第三步 第二次 用冷却的95 的酒精 第七步 六次搅拌 第一 二 三 五 七步 其中除第八步外 其余均要朝一个方向搅拌 在第三 五步搅动还要轻缓 玻璃棒不要直插烧杯底部 这样才能保证得到完整的DNA 讨论 方案二与方案三的原理有什么不同 答 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白 从而使提取的DNA与蛋白质分开 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同 从而使蛋白质变性 与DNA分离方案二利用了酶的专一性 方案三利用了DNA的稳定性 5分鐘內做出自己的DNA 材料 萃取出DNA的材料 人 含有SDS的清潔劑 幾乎大部分都有 食鹽水嫩精 木瓜酵素papain 筷子吸管透明杯子95 酒精 5分鐘內做出自己的DNA 方法 1 95 酒精放在冰箱備用 2 緩衝液 120ml的水 1又1 4茶匙