氨基酸的纸层析.doc

_氨基酸的纸层析一、 实验目的1、 了解纸层析法的使用原理。2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 二、 实验原理1、 纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团，滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。2、 所有的氨基酸的碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（COOH）与氨基（NH2），唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用脯氨酸、甘氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。 分配系数K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度3、 Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。4、 显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。三、 试剂1. 酸性层析液：正丁醇：88% 甲酸：水=15：3：22. 显色储备液：0.4mol/L茚三酮异丙醇：甲酸：水=20：1：53. 标准氨基酸溶液（6mg/ml，苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His）4. 未知样品液：上述四种氨基酸中的一种或几种混合液（每组任选一样品）四、 实验仪器样品管 毛细吸管层析缸 100ml量筒50ml烧杯 胶头滴管 移液管 滤纸：15cm*15cm *1 铅笔 直尺 保鲜膜 细玻璃棒 电吹风 薄膜手套五、 操作步骤 （一）展层剂和平衡溶剂的配制 1在100ml烧杯中按照体积比 正丁醇：88%甲酸：蒸馏水=15：3：2的比例配制展层剂，建议为45ml：9ml：6ml。 2取1ml显色贮备液混于展层剂中 3将混合好的液体放于层析缸中，混匀密闭，静置（展层缸洗净后应除去多余的水，否则会影响展层溶剂的比例而影响展层。 （二）点样（点样操作应戴上手套，防止样品和滤纸受污染）1实验台上铺好保鲜膜，保鲜膜下面可以蘸少量水，使得保鲜膜能与实验台面紧密贴合，此后所有操作都在保鲜膜上进行，不再赘述。2在距平行于15cm长的边2cm处用铅笔轻轻描出一条直线，此为展层起点线，在直线中间每隔2.53cm用铅笔轻轻点一个点，共点6个点。 3将毛细管的一端在酒精灯外焰上灼烧36s，毛细管管口变细即可。 4用毛细管分别蘸取四个氨基酸标准液和待测液，点样于展层起点线的六个点上。点完一次后，用电吹风冷风吹干，再点第二次样。每次点样均要求斑点半径（一般直径不超过5mm）。 5在标准样下面用铅笔做好标记，记录该点的氨基酸名称。（三）平衡及展层 1将点好样的滤纸两侧边缘对齐但不接触，卷成筒形，并用订书机订34次，将圆筒固定。 2将圆筒竖直放入层析缸中，滤纸勿与缸壁接触，盖上盖子（点样点的一端在下，展层剂液面需低于点样线1cm左右） 3待溶剂前沿线距滤纸末端12cm（展层长度10cm，约2小时）时取出滤纸（需戴上手套）用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹干（通风橱进行），即可见层析斑点。 （四）显色及Rf值计算 1取出烘完的滤纸，估计出斑点的重心，并用铅笔轻轻点出。 2用直尺测量出斑点中心到展层起点线的距离以及展层液跑出的距离，计算Rfx=（x=1，26）3将混合样分离出的斑点的Rf值与标准样的进行对比，从而认清各斑点的氨基酸种类，并在滤纸上标明。 六、 注意事项1. 实验全程戴一次性薄膜手套，全套实验在铺在实验台上的薄膜上进行。原因：人的皮肤上含有含氮化合物，而实验台上可能未洗干净残留其他氨基酸，会沾染到滤纸上，对实验产生影响；保鲜膜可以与钟罩边缘进行更紧密的结合，是平衡效果更好。2. 用毛细吸管进行点样时，为保证点样半径足够小，应使毛细管内的液体高度低于1cm，迅速的点在滤纸上。若管内液体过高，可以先将毛细管的液体点一部分于干净的卫生纸上，降低管内液体高度。3. 在通过移液管添加展层剂时，液体应缓慢放出，避免溅射到滤纸上，移液管拿出时也应该注意不要碰触滤纸。4. 展层开始时不要使样品浸入展层剂中。5. 吹风机吹干时切记用冷风吹干，以免温度过高使氨基酸变性。七实验结果 样品号：A06Rf（Pro）=4.1/9.90.414Rf（Phe）=6.45/10=0.645Rf（Gly）=2.40/10.10.237Rf（His）=1.60/10.40.154Rf（6上）=7.20/10.60.679Rf（6中）=4.70/10.60.443Rf（6下）=2.60/10.60.245Rf（7上）=7.30/10.50.695Rf（7中）=4.70/10.50.447Rf（7下）=2.80/10.50.267样品中含有的成分是脯氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸误差分析： 此次实验中，各氨基酸和样品的大致Rf值差距不大，但是样品中的