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第八章蛋白质的分离纯化及鉴定技术 蛋白质相对分子质量常用研究方法 1 根据化学组成测定最低相对分子质量2 渗透压法测定相对分子质量3 沉降分析法 离心 4 凝胶过滤法测定相对分子质量5 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 1 根据化学组成测定最低相对分子质量 用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量 推导出蛋白质最低相对分子量 例如 肌红蛋白含铁量为0 335 其最低相对分子质量可按下式算出 注意 最低相对分子量 55 8 0 335 X100 16700 2 渗透压法测定相对分子质量 1 渗透 osmosis 溶剂分子由纯溶剂 或稀溶液 向溶液 或浓溶液 单方向的净移动现象 2 理想溶液中 溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用范托夫公式表示 cRT Mr 渗透压 单位为Pa c溶质的浓度 T绝对温度 K R气体常数 Mr溶质的分子质量 3 沉降分析法 离心 利用超速离心测定蛋白质的相对分子质量 沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关 而且与分子形状 溶液的密度和粘度有关 当分子以恒定速度移动时 净离心力与摩擦力处于平衡状态时 根据斯维得贝格方程 Mr RTS D 1 T是绝对温度 K R是气体常数 S为沉降系数 单位离心场的沉降速度 用10 13秒作为一个单位 D为蛋白质的扩散系数 为溶剂密度 为蛋白质的偏微比容 约为0 74cm3 g 通过测得蛋白质的s值和D值 就可以算出蛋白质的相对分子质量 电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系 logMr a b R 式中Mr为相对分子质量 a b都是常数 R是相对迁移率 R 样品迁移距离 前沿 染料 迁移距离实验测定时 以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其 R值作图 根据待测样品的 R 从标准曲线上查出它的Mr 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度或比活 以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性 比活常以活力单位数 毫克蛋白质表示 分离纯化某一特定蛋白质的一般程序 前处理 粗分级分离 细分级分离 蛋白质分离纯化的一般原则 1 前处理 pretreatment 分离纯化某一蛋白质 首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来 并保持原来的天然状态 不丢失生物活性 1 预处理 动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织 种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染 油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂 2 破碎 然后根据不同的情况 选择适当的方法 将组织和细胞破碎 植物组织和细胞 由于具有细胞壁 一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎 液氮破碎或用纤维素酶处理也能达到目的 细菌细胞的破碎的常用方法有超声波震荡 与砂研磨 高压挤压或溶菌酶处理 分解肽聚糖 等 3 提取 组织和细胞破碎以后 选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来 细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分 如细胞核 染色体 核糖体或可溶性的细胞质等 则可利用差速离心方法将它们分开 如果所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的 则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚 然后用适当的介质提取 2粗分级分离 roughfractionation 目的 当蛋白质提取液获得后 选用一套适当的方法 将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来 这一步的分级分离一般用盐析 等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法 有些蛋白质提取液体积较大 又不适于用沉淀或盐析法浓缩 则可采用超过滤 凝胶过滤 冷冻真空干燥或其他方法 如聚乙二醇浓缩法 进行浓缩 3细分级分离 finefractionation 进一步纯化 一般使用层析法包括凝胶过滤 离子交换层析 吸附层析以及亲和层析等 还可选择电泳法 包括区带电泳 等电聚焦等作为最后的纯化步骤 用于细分级分离的方法一般规模较小 但分辨率很高 4结晶 结晶并不能保证蛋白质一定是均一的 但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶 结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化 蛋白质纯度愈高 溶液愈浓就愈容易结晶 由于结晶中从未发现过变性蛋白质 因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志 也是断定制品处于天然状态的有力指标 结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的 一 蛋白质含量测定 两类方法 利用蛋白质的物理性质 如折射率 比重 紫外吸收等 利用化学方法测定蛋白质含量 如 微量凯氏定氮 双缩脲反应 Folin 酚试剂法 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 1 凯氏定氮法 是经典的标准方法 用浓硫酸消化蛋白质分解出氨 测定氨的含量 除以16 就得出蛋白质的含量 2 双缩脲法 双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液 呈蓝色 由氢氧化钾 硫酸铜和酒石酸钾钠配制 当底物中含有肽键时 多肽 试液中的铜与多肽配位 形成紫红色络合物 常用于需要快速但并不需要十分精确的测定 3 Lowry法 Folin 酚法 Folin 酚试剂 甲试剂 由碳酸钠 氢氧化钠 硫酸铜及酒石酸钾钠组成 相当于双缩脲试剂 可与蛋白质的肽键起反应 乙试剂 是由磷钼酸和磷钨酸 硫酸 溴等组成 在碱性条件下不稳定 易被酚类物质还原而呈蓝色 Lowry法 此法的优点是操作简单 迅速 不需特殊仪器设备 灵敏度高 较紫外吸收法灵敏10 20倍 较双缩脲法灵敏100倍 反应约在15min内有最大显色 并至少可稳定几小时 其不足之处是此反应受多种因素干扰 在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除 4 紫外吸收法 由于蛋白质分子中酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键 因此蛋白质具有吸收紫外线的性质 吸收高峰在280nm波长处 在此波长范围内 蛋白质溶液的光吸收值 A280 与其含量 范围是0 1 1 0mg ml 呈正比关系 可用作定量测定 紫外吸收法的优缺点 优点 简便 不消耗样品 低浓度盐类不干扰测定 因此 在蛋白质和酶的生化制备中 特别是在柱层析分离中 广泛应用 缺点 1 对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质 有一定的误差 2 若样品中含有嘌呤 嘧啶等吸收紫外线的物质 会出现较大的干扰 5 考马斯亮蓝染色法 Bradford法 考马斯亮蓝有G250和R250两种 其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速 常用来作为蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢 但是可以被洗脱下去 所以可以用来对电泳条带染色 考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色 最大光吸收在488nm 当它与蛋白质结合后变为蓝色 蛋白质 色素结合物在595nm波长下有最大光吸收 其光吸收值与蛋白质含量成正比 因此可用于蛋白质的定量测定 蛋白质与考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡 完成反应十分迅速 其结合物在室温下1h内保持稳定 该法是1976年Bradford建立 试剂配制简单 操作简便快捷 反应非常灵敏 灵敏度比Lowry法还高4倍 可测定微克级蛋白质含量 测定蛋白质浓度范围为0 1000 g mL 最小可测2 5 g mL蛋白质 是一种常用的微量蛋白质快速测定方法 6 胶体金测定法 胶体金是由氯金酸在还原剂作用下 聚合成一定大小的金颗粒 并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态 形成带负电的疏水胶溶液 可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合 胶体金遇蛋白质转变为蓝色 颜色改变与蛋白质有定量关系 是几种方法中灵敏度最高的 检测量是ng水平 7 某一特定蛋白质的含量测定 通常要用具有高度特异性的生物学方法 具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量 有些蛋白质虽然没有酶或激素那样特异的生物学活性 但是大多数蛋白质当注入适当的动物血液中时 会产生抗体 因此 利用抗体 抗原反应 也可以测定某一特定蛋白质的含量 二 蛋白质纯度的鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法 1 电泳 目前采用的电泳分析有等电聚集 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 和SDS PAGE 毛细管电泳等 纯的蛋
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