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荧光实时定量PCR 结果分析问题荧光实时定量PCR结果分析问题2010-01-22 13：08Line Gene实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响目的探讨实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响。方法用Line Gene FQD 33A型荧光定量PCR检测系统检测本院门诊和病房乙肝病人血清HBV DNA 77份，分别用最大二阶导数法和样点拟合法进行结果分析。结果发现两种分析方法的总体相关性较好(r=0.978)。但HBV DNA拷贝数含量105时，两种模式的相关性差(r=0.706)，此时，最大二阶导数法得出的数值要比样点拟合法低(t=2.61,P0.05)，且易出现假阴性结果。结论虽然样点拟合法步骤较多，但其结果更可靠，因此进行结果分析时，建议使用样点拟合法。而且当样本中HBV DNA拷贝数105时只能使用样点拟合法进行结果分析。实时荧光定量；聚合酶链反应；质量控制7.数据分析：(1)相对定量：使用Ct法计算目的基因在不同组间的表达差异。(2)绝对定量：将样品的Ct值代入标准曲线，以对目的基因进行定量。(3)熔解曲线分析：确定产物特异性。主要实验步骤：1.设计并合成Real time PCR引物。2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR Green)的PCR反应优化。3.客户样品RNA抽提。a.实验对象为组织样品，取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，匀浆后抽提RNA。b.实验对象为细胞样品，每份样品取11061107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，裂解后抽提RNA。4.RNA质量检测a.紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。b.使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。5.使用逆转录酶(Promega)进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。6.制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。7.标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司)，进行RealTime PCR扩增和检测。8.检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。9.提供实验报告，包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表。操作程序：1.客户提供待定量mRNA或DNA的相关资料，共同探讨服务的可能性和技术路线。2.签订技术服务合同，商定服务收费、任务期限等。客户需要预付实验总费用的100%作为实验预付款。由客户提供实验所需的足够量的样品(100mg组织块或107个细胞)，本公司不接受您提供的RNA/DNA样品，除非您有足够证据证明所提供的RNA/DNA样品质量。根据客户提供的待检测基因序列设计、合成荧光探针。3.进行RNA的抽提、RNA定量、反转录、荧光定量PCR反应。提供实验报告、定量结果及彩图等(我们提供的均为客观的原始数据，不对这些数据的意义做统计分析)。收费标准根据样本数量和检测基因数量协商，工作内容包括引物和探针的设计、合成，标准品的制备，参照样品的选择和实验条件的摸索等。其后的检测费用根据样品数的多少，样品的状态(如是组织标本还是cDNA)不同再具体协商确定。1.实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。2.内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方。Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。一是标准曲线法。在内参基因和目标基因扩增效率不一致的情况下，每次实验都带上两个基因的标准曲线，根据标准曲线推断扩增的量。二是delta delta Ct法。如果内参基因和目标基因扩增效率一致，那么对于一个sample1，用(X1=目标基因Ct值-内参基因Ct值)进行标准化。比较不同sample时，用标准化后的值，即Xi间的差值进行比较，如(Y=X1-X2)。最后转化成RNA水平实际变化倍数时(sample1相对于sample2)，只要N=2Y就可以了。delta delta Ct的原理。Livak,K.J.and T.D.Schmittgen,Analy