生物制品学实验指导.doc

生物制品学实验指导目录：实验一：细菌的划线分离与纯培养实验二：动物的免疫与接种实验三：灭活疫苗的制备 实验四：凝集抗原的制备实验五：平板凝集试验实验六：病料的采集与鸡胚接种实验七：病毒的收集及效价的测定实验八：抗原及疫苗的制备实验九：动物的免疫与接种实验十：抗体水平的检测实验一：细菌的划线分离与纯培养实验二：动物的免疫与接种一：目的与要求：1熟悉细菌划线分离的方法及纯培养的意义。2掌握动物的保定与接种方法。二：实验内容与步骤：1种子繁殖：（1） 将冻干菌种接种于普通肉汤培养；（略）（2） 取种子液接种于普通琼脂平板。点燃酒精灯后，在火焰上方，左手持皿，底朝下盖在上，以无名指和小指托底，拇指、食指和中指将皿盖揭开20的角度，角度不要过大，以防空气进入污染培养基；但角度过小又不便于操作，且易造成皿盖边缘与接种环接触，导致杂菌污染；右手持接种环，在火焰上灼烧后，取少许菌料或细菌培养物涂于培养基边缘，将接种环上多余的菌料在火焰上烧掉，选择图1所示划线法中的一种进行划线，然后将平皿盖好，倒置于恒温培养箱中培养，37条件下培养24h。图1 细菌分离培养的划线法2免疫接种：1）小白鼠皮下接种-颈背部、腹侧或后腿内侧，0.1ml/只用右手抓住小白鼠的尾巴上提，使两后肢悬空，让其两前肢的爪抓住饲养罐的铁丝网盖，然后用左手的拇指和食指抓住小白鼠颈部的皮肤并翻转，使其腹部朝上，将鼠尾巴夹在左手中指与无名指之间，右后腿夹在小手指与手掌之中。右手持注射器，用注射针头轻轻挑起皮肤并刺入皮下，注入接种液时见注射部位微微隆起，注射完拔出针头后，应以酒精棉球按压针孔并稍加按摩。注射量0.1ml/只。2）兔子肌肉接种-后腿内侧， 0.5ml/只用左手轻轻压住兔子的头颈部，以拇指夹住兔子的有前肢，食指和中指夹住左前肢，右手紧握腹部和两后肢，使兔子的腹部朝上，由另一人进行接种注射。注射部位选择动物的股内侧或股外侧，经局部消毒后，将注射针头刺入肌肉深部并推接种液。注射量0.5ml/只。注：菌苗于下次实验制备准备名称 班组 数量 总计 备注100ml菌液 1瓶1ml注射器 5 2 10琼脂平板 5 2 10小白鼠 5 2 10家兔 2 2实验三：灭活疫苗的制备 实验四：凝集抗原的制备一：目的与要求：1了解比浊法2掌握凝集抗原及灭活菌苗的制备。二：实验内容1凝集抗原的制备：用接种环刮下菌苔，用0.4%甲醛灭菌盐水冲洗，并吸入离心管以2500rpm离心10min后，弃上清液，将下沉菌体用0.4%甲醛灭菌盐水悬浮，然后用标准比浊管标定浓度，配制成130亿的灭活菌液，置37温箱24h，并加入结晶紫用于诊断抗原。2铝胶苗的制备（示教）（1）氢氧化铝胶的制备： 硫酸铝钾与蒸馏水按1：10混合，60加热溶解浓氨水与蒸馏水1：5混合，将 缓慢加入中，并不断搅拌，加至PH 7.07.2，静置弃上清，用蒸馏水洗34次，每次均静置弃上清，测定PH，分装，高压后备用。 （2）将灭活后的菌液与氢氧化铝胶按5：1混合，并分装。取样做安检（接种普通琼脂培养基，37，12d ；或接种小白鼠）。准备名称 班组 数量 总计 备注接种环、酒精灯、灭菌滴管、灭菌盐水、0.4%甲醛灭菌盐水离心机、离心管、比浊管、硫酸铝钾、氢氧化铝胶、结晶紫实验五 平板凝集实验一 目的与要求1掌握实验动物采血的基本方法 2掌握平板凝集试验的操作方法与结果判定二：实验内容1家兔的耳缘静脉或心脏采血（略）2练习小白鼠尾静脉及眼眶静脉采血法并分离血清 3血清平板凝集试验与结果判定取洁净玻片一快，用玻璃铅笔划成小格，并做记号。将待检血清12滴滴于洁净玻片上，取已知平板凝聚抗原，加入其中并混合均匀，数分钟后若有可见的凝集现象即为阳性反应。此法简单迅速，常用于细菌鉴定或畜禽传染病的诊断，如布氏杆菌及鸡白痢等。准备名称 班组 数量 总计 备注微量移液器 5 1 5 枪头小白鼠 5 2 10玻片 5 1 5标准阳性对照抗原、镊子、 实验六：病料的采集与鸡胚接种一 目的与要求1 了解病料的采集与病毒的分离。2 掌握鸡胚接种的方法。二：实验内容1病料的处理：用无菌盐水清洗表面的血渍，灭菌剪刀剪碎以1：10稀释后盛入无菌瓶内并加入双抗反复冻融四次。（示教）2鸡胚接种：照蛋、划气室、尿囊腔接种0.10.15ml/胚准备名称 班组 数量 总计 备注鸡胚 5 6 30照蛋器、酒精棉球、碘酊、铅笔、蜡、酒精灯、镊子1ml注射器脏器、剪刀、盐水、100ml盐水瓶、双抗种毒实验七：病毒的收集及效价的测定实验八：动物的免疫与接种一 目的与要求1了解尿囊液的收获。2掌握血凝试验的基本操作与结果判定。二实验内容1收集尿囊液之前先吸出少量置微量平板内，而后每组将剩余的吸入一个盐水瓶中。2效价（毒力）的测定：a加入50ul生理盐水于一排或一列（8或12孔）b吸取50ul尿囊液于第一孔并做倍比稀释至倒数第二孔c向每孔加入50ul的红细胞悬液，振荡混匀后置室温或37度温箱20mind观察结果：能使红细胞刚好凝集的最大稀释倍数即为病毒的效价。3鸡的免疫接种（略）准备名称 班组 数量 总计 备注96孔微型板 微量移液器 枪头 振荡器红细胞悬液 生理盐水（PBS）液滴管 盐水瓶实验九：抗原及疫苗的制备实验十：抗体水平的检测一 目的与要求1 了解油乳剂苗的制备过程2 掌握HI试验的操作及结果判定。二实验内容1油乳剂苗的制备（示教）：a抗原灭活：于收获的鸡胚尿囊液中加入0.1%甲醛，充分摇匀后于37温箱灭活16h。b油相的制备：取94%的白油，加入6%司本-80，混合后加入2%硬脂酸铝，121高压30min。c抗原水相的制备：向灭活抗原中加入4%吐温-80，充分溶解后备用。d乳化：油相与抗原水相按2：13：1的比例 ，先后将油相和抗原水相加入搅拌器，高速搅拌3min。e安检后分装。24单位8单位抗原的制备：经HI试验测得的尿囊液凝集价，而后倍比稀释。3红细胞悬液的制备：翼下采血（20%抗凝剂），清洗红细胞，配成0。75%-1%的红细胞悬液。4抗体检测：a加入50ul生理盐水于一排或一列（8或12孔）b吸取50ul待检血清于第一孔并做倍比稀释至倒数第三孔c加入4单位抗原至倒数第二孔，振荡混匀后置室温或37度温箱10mind向每孔加入50ul的红细胞悬液，振荡混匀后置室温或37度温箱20mine观察结果：能与抗原结合从而抑制红细胞凝集的抗体的最大稀释