色谱的运用.doc

【摘要】本文阐述了高效液相色谱技术、高速逆流色谱技术、红外光谱技术、色谱-质谱联用技术、色谱指纹图谱、气相色谱法、薄层层析及薄层扫描法、超临界流体萃取-超临界流体色谱法等八种技术在中药复方中的最新应用状况，并且提出了较有价值的未来发展建议及规划。【关键词】色谱；中药复方；应用进展中药是一个非常复杂的体系，中药复方提取物是一个较复杂的混合物。为提高中药质量，改变传统中药剂型“大、黑、粗”的状态，让中药步入国际市场，一些现代高新工程技术正被不断地运用到中药生产中，使中药生产不但更加符合传统的中医药理论，也更加确保了中药复方制剂的质量，还提高了现有中草药资源的利用率。中药复方制剂现代化是目前我国医药科研人员和产业化所面临的重大任务。中药复方制剂现代化过程中一项很重要的任务就是利用现代医学、化学、药学、计算机信息学等各项现代自然科学的最新方法和技术，从微观分子水平认识和发展中医药理论，研制出现代中药复方新药。随着科学技术的高速发展，越来越多的高新技术将会运用到中药复方制剂有效成分的研究上。这些高新技术具有传统方法无法比拟的优点，对提高中药制剂质量、减少服用剂量、提高生产效率、降低环境污染等方面起到积极的推动作用。本文对八种高新技术在中药复方研究中的应用进展作了简要综述。1高效液相色谱技术1.1中药复方制剂质量测检方面的应用1中药复方制剂质量控制和质量标准的制定势在必行，但由于中药复方制剂成分的复杂性，给这方面的工作造成很大困难。HPLC技术在这方面有很大优势，甘草复方制剂质量评价常以甘草酸作为指标。用RP-HPLC以浅性回归法测定甘草酸的结果表明其含量随产地、药材粗细、质地、断面颜色的不同而异，断面越黄，质地硬脆，折断性大者甘草酸含量高，为评价甘草复方制剂品质提供了科学依据。1.2中药配伍中的应用1中药汤剂多为复方，每种生药又含有多种化学成分。临床共煎过程中可能产生挥发、分解、助溶、吸附、水解、取代、中和、沉淀等一系列十分复杂的化学物理变化，这些变化直接影响到制剂的疗效和毒副作用。用反相高效液相色谱法测定川芎单煎剂，川芎、丹参合煎剂，川芎、当归合煎剂及改味四物汤中阿魏酸的含量时发现各组汤剂中阿魏酸的含量差异有统计学意义，配伍熟地对阿魏酸的溶出具有助溶作用。2高速逆流色谱技术2高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC）技术是一种不用任何固态载体或支撑体的液液分配色谱技术，分离效率高，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和沾染，具有制备量大和溶剂消耗少等优点。至20世纪70年代末期，美国FDA和世界卫生组织（WHO）开始利用此项技术作为分离抗生素成分进行检定。目前，已开发出生产型、分析型两大类高速逆流色谱仪，分别用于中草药复方制剂成分的分离制备和定量分析。进样量可从毫克级到克级，进样体积可从数毫升到几百毫升，不仅适用于非极性化合物的分离也适用于极性化合物的分离，还可用于中药粗提取物中各组分的分离，也可用于进一步精制。1994年HSCCC技术得到进一步发展，其进样量大大增加，能方便快速地分离克量级样品，更有利于中药复方制剂的分离制备。该技术有望成为中药有效成分质量标准研究、分析的一种新方法，也将成为中药生产的一种新型分离技术。3红外光谱技术3红外光谱快速检测中药复方制剂时分三级鉴定，即对于差异较大的（如不同种类、不同炮制品等）中药复方，仅需一般红外光谱图就可以做出判定，称其为一级鉴定；差异性较小的（如不同产地、不同年限等）中药复方可采用红外光谱图和二阶导数谱图相结合的方法对其并作出判定，此称为二级鉴定；当红外光谱图和二阶导数谱图差异较小时，则可凭借二维相关红外光谱加以判定，此为三级鉴定。这三级鉴定也是相互支持、相互佐证的，这样下来可以基本锁定中药复方制剂的“全貌”便于鉴定其真伪、优劣及炮制差异等。样品的无损处理指既不破坏单味中药的整体性（四气五味、升降沉浮、性味归经等的整体统一），又不破坏方剂配伍性（君臣佐使、相须相使等的整体统一）。在中药复方制剂现代化的进程中，利用红外光谱技术快速、有效、易行可控、产业化程度高的检测能力，可为生产过程的在线、现时检测和药检部门建立快速质检反应机制提供了新的手段，对企业生产的在线监控和药材市场质量监控有重要意义。4色谱-质谱联用技术4.1色谱-质谱联用技术应用4色谱和质谱的联用是目前最受重视的手段。应用高效毛细管气相色谱不仅能进行上百个成分的分离，同时还能对其进行质谱测定。目前，利用标准质谱库再加以匹配、识别和定性已很普遍，但色谱-质谱联用必须注意解决好来自于色谱和质谱两方面的问题，主要包括液相色谱液体流动相的去除，质谱灵敏度、稳定性的提高和质谱体积、成本的降低。去除液相流动相的最常用方法是将其挥发去除，因此当液相色谱流动相含水量较高、含有缓冲盐和流速较高时，液相色谱与质谱联用技术的接口就变成技术的关键。目前，最广泛使用的接口类型：最初电喷雾设计、加热金属毛细管、Turbo离子喷雾、Z型喷雾、正交喷雾、AQa等。目前，将四极杆质谱与飞行时间质谱组成串联质谱，结合最新发展的毛细管液相色谱技术组成的CapLC-Q-Tof-MS-MS，将集成高效毛细管液相色谱、四级质谱与飞行时间质谱的优点成为当前解决中药复方制剂样品分离分析的最尖端工具之一。4.2大川芎方色谱-质谱联用技术实例4大川芎方由川芎和天麻两味药组成，主要成分包括有机酸、生物碱、内酯、挥发油、苷类、多糖等。为了深入对其化学成分进行研究，还需进行其化学成分的系统分离分析研究。对于大川芎方中大量有效成分（阿魏酸、盐酸川芎嗪、天麻苷等）还必须采用液相色谱-质谱进行分析。对于大川芎的提取物，采用微柱液相色谱（2.1 mm内径柱）和大气压下电喷雾质谱同时在正负离子模式下进行了扫描分析，得到基峰色谱图。从质谱图的分子离子峰和其与醋酸的加合离子峰可以判断天麻苷峰和阿魏酸峰，进一步用标样验证保留时间和质谱图均十分吻合。5色谱指纹图谱5中医理论指导下的中药，尤其是复方制剂，任何一种活性成分均不能反映中医用药所体现的整体疗效，这是中药与化学合成药品质量标准的根本区别。所以宏观地综合分析成为必然的发展趋势，综合分析与整体分析成为分析化学发展的必然的反映。在寻求综合评价中药质量的过程中，值得注意的趋势是色谱指纹图（chromatographic fingerprint）的应用。国外植物药（复方制剂）色谱指纹图谱的应用：美国FDA允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图鉴别资料6。此外，WHO在1996年草药评价指导原则中也有规定，如在“Plant preparations”及“Finished product”的章节中都提到“如果不可能鉴别有效成分，则鉴别1种或几种特征成分（如色谱指纹图谱）以保证制剂和产品质量的一致”7。欧共体在草药质量指南的注释8中提到“草药的质量稳定性单靠测定已知的有效成分是不够的，因为草药及其制剂是以其整体作为有效物质。因此，应该通过色谱指纹图谱显示其所含的各种成分在草药及其制剂中是稳定的，其含量比例能保持恒定。例如欧山楂（花叶）的薄层色谱指纹图谱所显示的结果。”中药色谱指纹图谱（图像）的实验研究难度较大是不言而喻的，涉及的技术问题较多，需要通过更多的实践和共同努力逐步解决。6气相色谱法（GC）6GC是一种较为传统的色谱方法，具有高柱效、高选择性、高灵敏度、分析速度快、应用广等优点。在中药研究方面GC最大的弱点在于其受样品蒸汽压的限制，对于挥发性小的或热不稳定成分需采用衍生化法或裂解法以增加其挥发性，但也由此增加了操作的复杂性。在中药研究方面GC主要用于挥发性成分的研究，如：蒎烯、龙脑、芳樟醇、柠檬烯等，涉及的中药分属唇形科、伞形科、姜科、五加科、菊科等，如干姜、淫羊藿、西洋参、砂仁等；GC亦可用于中药中的其他成分的研究及测定，例如：对独角莲、哈士膜卵油的分析。因此，可以看出GC在中药复方研究中的应用尚有开发空间。7薄层层析（TLC）及薄层扫描法（TLCS）6薄层层析及薄层扫描法是较早应用于中药分析的一种色谱法，由于其操作简便、色谱结果直观、显色方式可选性大，兼具分离鉴定双重功能且所涉及的设备价格较为低廉，故应用广泛。对于成分复杂不明，或含无挥发性、低UV吸收成分的中药，TLC及TLCS有其应用前景。例如对川芎等药材，应用TLCS可测定银杏叶制剂中萜类内酯之含量9。但TLC和TLCS因其色谱结果易受铺板、点样温湿度影响，有时难以重复；显色又受显色的均匀性、灵敏度等因素影响，因此，其测定结果偏差较大。8超临界流体萃取-超临界流体色谱法（SFE-SFC）6SFE-SFC具有省时、省力、取样量少、萃取效率高等优点，特别适用于中药的预处理。而SFC兼有GC、HPLC之优点，能分离分析难挥发、热不稳定、HPLC难检测的物质。SFC在中药分析中的应用已有报道，如：三七及云南白药中人参二醇、三醇之测定，马蓝、菘蓝中靛玉红之测定10。SFE、SFC现已逐渐由单用发展为联用，其在中药分析中具有一定使用价值。【关键词】 HPLC,中药质量【摘要】 为了更好地制定中药现代化的质量标准，探讨高效液相色谱（HPLC）在中药质量控制中的应用，发现HPLC在中药质量控制中正发挥着积极作用，其样品提取，色谱条件选择等都有独特的特点;并且发现正相高效液相色谱，反相高效液相色谱等多种色谱在中药质量控制中发挥着不同作用。关键词 HPLC 中药质量由于国际知识产权，药品专利的保护，复关等一系列经济、政治因素，中药走向世界面临新的机遇和挑战。一方面，由于气候、环境、社会、饮食等因素的影响，疾病谱发生了很大的变化，加之药源性疾病、营养性疾病、老年人疾病的增加，而化学药物疗效的欠佳或影响;某些药物的毒副作用与耐药性表现很突出，人们在“回归大自然”的热浪下，掀起了“中医中药热”。另一方面由于中药成份复杂，缺乏明确的有效成份含量标准和制药标准等原因，使中药一直没有得到合法地位。中药产品多以保健品、增补剂或食物添加剂等在市场流通，中医药在新的热浪冲击下，如何面对严峻的挑战。求生存、求发展，参与国际竞争是国人应该引起重视的研究课题 1 。 建立与现代化科学技术相适应的中药质量控制方法，是实现中药生产现代化非常关键的一环，多年以来，在这方面已对它们进行了大量的工作，并已取得明显的成绩，但至今仍有不少中药没有质量控制方法或方法不够理想。近年来HPLC分析法发展很快，应用日益普遍，它具有灵敏度高，分离效率高，易于操作和重复性好等特点，是对中药进行成分分析的一种极有价值的分析技术。在中药成分的含量测定、物种鉴别、药材加工炮制、采收和储存等方面已有大量的工作报道，因此成为中药质量控制的重要手段之一。如今HPLC在中药质量控制方面，正处于全面开花阶段，大量文献争先报道，除了正相色谱外，反相色谱也得到广泛应用，并且出现了离子对高效液相色谱、智能多柱高效液相色谱和络合高效液相色谱的应用。 1 高效液相色谱在中药质量控制中的应用 高效液相色谱在中药研究方面，早期主要用于中药化合物化学成分的分析。例如1978年贺贤国等从中华五味子中分离得到五味子甲、五味子乙、五味子丙，解决了薄层层析检查只有一个斑点，但药理实验毒性不稳定的问题 2 。1983年张红、贺贤国等对早期HPLC在中药研究中的应用作了一定的概述 3 。 由于HPLC具有适用范围广，分离效率高，流动相和分析柱使用方式及填料选择方便等特点，与其它传统的分析分离手段和仪器检测相比具有突出的优越性。使HPLC在中药质量控制方面出现了繁荣景象。1999年1月10月有关文献报道达100多篇，并引起许多大型研究机构的关注。中国医学科学院、协和医科大学药物研究所与日本大正制药株式会社合作开展了中药高效液相色谱分析与质量评价的系列研究，完成了80个中草药的高效液相色谱分析及质量考查工作 4 。为HPLC在中药的质量控制发挥积极作用提供了依据，开拓了广阔空间。在中国药典中，HPLC在质量控制中也发挥越来越重要的作用，表1是高效液相色谱在历版药典中的应用 5 。表1 HPLC在历版药典中含量测量方法的统计比较 略其中在中药应用方面相对落后，1995版中国药典中398个中药制剂中仅有小儿消炎栓、护肝片、愈风定心片等少数品种应用HPLC 6 ，但在2000年版药典中，明显增大了HPLC的应用力度。有92个中药品种利用HPLC测定含量，其中药材47个，中药制剂45个。 HPLC在中药质量控制中主要用于有效成份含量测定。其常用程序和方法如下:（1）试样的提取:药材及中药制剂在测定前应根据其剂型和待测成分的理化性质，选择适当的溶剂和提取方法，将待测成分从剂型中提取出来。方剂:小丸和冲剂研成细粉;药材粉末，散剂直接取样，准确称取适量，选择适当溶媒。常用甲醇或乙醇，浸泡一定时间，超声波振荡后提取或加热回流提取。口服液:常用有机溶媒萃取，或者取适量口服液拌入适量硅藻土，混匀，干燥后用超声波振荡提取或索氏提取。蜜丸:先剪碎，称取一定量，拌入适量硅藻土研匀，干燥，再根据待测成分选择适当溶剂提取。 （2）试样纯化:过大孔树脂柱，可除去糖的干扰。用聚酰胺柱纯化黄酮类成分。生物碱类，先调pH值至碱性，再用氯仿提取。过氧化铝和活性炭混合柱，可除去试样中少量杂质及色素。用滤膜过滤或过PT系列色谱预处理小粒。 （3）色谱条件的选择:色谱柱:常用YWK、YBK、C18。流动相:常用甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、甲醇-正已烷等。检测器:多为紫外检测器，根据组分的吸收度，选择最佳波长。 （4）定量方法:定量方法为内标法和外标法，由于中药制剂成分复杂，出峰多且密，故多采用外标法。以试样的标准品作对照物质，相对比较以求得试样的含量，常用工作曲线法和外标一点法。 2 反相高效液相色谱法在中药质量控制中的应用 反相高效液相色谱法是HPLC应用最广的一个分支。反相键合相色谱，又称极性键合相色谱。键合相表面都是极性很小的烃基，如十八烷基硅烷键合硅胶（ODS或C18）而洗脱液大多采用强极性溶剂或无机盐缓冲液。在这种键合相色谱中，洗脱顺序恰好与正相色谱相反，即极性大的化合物先洗脱，极性小的化合物不易洗脱。因为键合相表面的官能团不易流失，溶剂的极性可以很大范围内调整，因此应用范围很宽，加之由其派生的反相离子对色谱法与离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱和盐等离子化合物，扩大应用范围 7 。近年来反相高效液相色谱在中药质量控制方面得到广泛应用。考查19981999年100篇HPLC应用于中药含量测定的文章中有29个用的是反相高效液相色谱。反相高效液相色谱柱:常用C18柱，柱长1530cm，填料粒度510m。流动相:甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸盐，乙腈-硫酸盐。可适当调节组分的配比和流动相的pH，个别流动相中添加离子对试剂。检测器多为紫外检测器。定量方法有内标法和外标法。 3 其它高效液相色谱在中药质量控制中的应用 3.1 智能多柱高效液相色谱 智能多柱高效液相色谱是在多柱切换高效液相色谱及智能化技术的基础上提出的新概念，根据分析样品成分繁多、性质复杂等特点，利用切换技术的模块或分离性能，把样品分块地切换进不