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胶回收方法全攻略说到电泳凝胶的片断回收，想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实，一般在各个和分子 生物学沾到一点边儿的实验室里，从琼脂 糖凝胶中回收DNA，仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳 片断回收没有12个小时是搞不定的，每个实验室也有自己的独门秘诀，可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途，不同价钱的快速凝胶回收试剂盒，一下子将 胶回收的时间缩短到10多分钟，操作也大大简化，胶回收就变成“小菜一碟”了。然而，从bbs逛上一圈下来，发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单 的操作而烦恼。到底是什么导致了实验新手，甚至是老手在这个已经发展近40年的常规性实验中卡壳?由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验比 如酶切连接、转化筛选、测序 或者PCR 扩增、标记乃至显微注射等等，为大家搜罗各种产品和方法的优缺点，注意事项，做一个胶回收全攻略篇。一、胶回收的关键参数胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂，最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度)，回收效率，操作方便(速度)，柱子的载量等等。回收产物质量：回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，会强烈抑制后 继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断，产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收，质量还包括了产物的完整与否，如果机械剪切力使得回收产物大小不一致，后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小，对后继实 验同样也有影响，比如连接、标记实验等等就很不爽，往往不得不再浓缩一次，增加了操作的复杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会 对结果产生致命的影响。回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少，电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条 带中的目的片断，提高产物得率，对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片断越大，和固相基质的结 合力越强，就越难洗脱，回收率就低;又比如说，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于 样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的。其他：操作方面，相信大家都会比较喜欢操作简单，快速，应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便 的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量，就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了，因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质，过量的 产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物，大载量就很有优势同一个片断你要用2个柱子，多郁闷啊。二：胶回收方法和分类20世纪70年代是一个奠定现代分子生物学的时代，1973年冷泉港实验室的Joseph Sambrook和Phillip Sharp发明了利用琼脂糖凝胶分离DNA和EB染料观测DNA相结合的技术。现在，琼脂糖和聚丙烯酰胺 凝胶电泳是分离、鉴定和纯化核酸和蛋白质片断的标准方法。生物通将在后面另文讨论聚丙烯酰胺 凝胶电泳片断回收的方法，这里首先介绍的是琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法：1.柱回收试剂盒：可谓目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再 洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧 就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。2.玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒：这个方法比前面的方法更为灵活，可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量， 也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，Buffer溶解，(区别在于这里)加入纯化填料填料吸附混合，快速离心沉淀去上清， 洗涤沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来，离心，取上清，就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回 收，但是操作就较前者复杂一些，涉及到多次离心沉淀和取上清，有可能会误吸了微量的沉淀;另外干燥的程度也有点技巧，干过了不好洗脱，没干透又影响结果。 后来的改进版本有将混合了纯化介质后的凝胶溶解液加入到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层过滤膜，离心过滤后，填料在柱子里，溶液被甩 掉，这样就避免了上述的问题。3.低熔点琼脂糖：传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个 方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现在用的人已经不多了。想当年经费紧张的时候，低熔点琼脂糖贵，不舍得这么浪费的，比较取巧省钱的 法子就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再将那块家伙切出来，就可以非常非 常节约了。除了直接酚抽低熔点琼脂糖凝胶，还有人用琼脂糖酶来消化琼脂糖凝胶，条件也相当温和，只是那酶价格并不便宜(光那酶的成本就少5-6块，还不算 其他的麻烦事)，多数的酶只适合用低熔点琼脂糖，问题是我不用酶也可以直接酚抽，费时间还特长，所以，并不觉得特别好用。后来据说T家的琼脂糖酶可以用于 常规琼脂糖，前提是你有办法在65度把那胶化了。但那需要极好的耐心。我们后面会有介绍。后来有老师从美国回来了，才有机会尝试更好的低熔点琼脂糖 FMC(现在叫做Cambrex了)的GTG级别低熔点琼脂糖!那才是最简单的方法呀!洗的超级干净的电泳槽 灌胶，电泳后，直接将条带切下65度保温融化，就可以直接在融化的琼脂糖DNA混合物中加酶进行后继实验所谓的GTG就是遗传技术级，可以在凝胶中进行各种酶反应的哦!实验条件非常温和，非常适合大片断的回收。4.透析带电洗脱法。烦，简直不堪回首。切下的条带放在充满TAE的透析带中再电泳一段时间，让DNA走出凝胶，走向溶液中，再反向电泳一会儿，将附在透 析带上的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后传统方法酚抽沉淀，那块胶通常还要再染色看看残留。由于绑透析带非常难搞，只有在 万不得已的非常大的片断时才会考虑的。也是丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。后来看到以色列的一个小公司GeBA有出简易透析管(生物通早在02年就 有新技术专栏文章介绍的)，就是将小指管两边各开一小窗，贴上透析膜，把胶块放在管中再电泳。由于不需要绑透析带，使用方便;而且管中溶液体积小，容易处 理;膜的面积也小吸附也少;顿时觉得是救星。后来貌似Pierce也推出了类似的东西，买起来更方便一点。5.DEAE纤维素膜纸片法和其他改良法。早期实验室最常用方法之一。将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的 DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有 DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。曾经常用的另一方法是在电泳胶前挖小槽，加入缓冲液，电泳一小会 儿，手提紫外监视，等条带进入槽中，还没在另一头上岸时停止电泳，吸出溶液酚氯仿抽提(加点甘油可降低DNA在溶液中的移动速度，防止那边还没全部下水， 这边就已经上岸了的情况。当然也可以挖大点的孔或者多吸几次，反正是要沉淀的，体积大些不要紧)。不过这些方法在柱回收试剂盒推出后都渐渐要淘汰了。毕竟 比较麻烦费时间，而且回收的产物纯度也不比试剂盒前者是纯化介质吸附DNA后彻底除去溶液，经过洗涤残留在纯化介质上的杂质，最后洗脱;手工的方法多 是用酚氯仿抽提溶液后乙醇沉淀，由于有些多糖沉淀属性和DNA相似时就容易共沉淀下来。鉴于竞争的日趋激烈,纯化试剂价格逐渐向下,连核酸纯化领域的顶级 名牌Qiagen也开始大幅度的折扣优惠,所以,有条件还是选择试剂盒,比自己慢慢摸索要更能节约宝贵的青春。所以，这里准备将回收片断按照大小不同来分 别介绍不同用途的产品：常规片断级(DNA片段为100bp-10kb)：主流方法是柱回收试剂盒大片段级(DNA片段7kb)：可选方法是玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒，电洗脱小片段级(DNA片段Millipore回收范围：100bp-10kb推荐指数：价格指数：特点：. 时间短：10分钟spin. DNA保存完整. 试剂盒包括做为过滤装置的凝胶喷雾器(nbulizer)、离心瓶和TAE gel extraction buffer使用心得：这一款胶回收试剂盒不同于之前提到的凝胶回收方法Montage利用的是从凝胶中抽取(compression)DNA片段的方法：通过离心力解离凝 胶的结构，驱使琼脂糖在gel nebulizer中穿过小孔，这样形成的胶泥就被甩进样品过滤盖中。因此无需其它多余的操作，直接将切下来的凝胶放进去，经过5000g/10min， 即可得到回收DNA片段(见下)。回收率见下：Typical DNA Recoveries from Agarose GelsDNA Size (bp)Percent DNA Recoveries10078700711000772027474361359416322313029Millipore先进的膜技术使得Millipore纯化系列其实在自动化高通量 领域有相当好的口碑，价格实惠质量可靠。4.经济实惠的国产之选在普通级胶回收中应该提及的是一些国产品牌，毕竟在现今胶回收技术成熟并得到了广泛应用的基础上，一些国产品牌也提供了经济实惠的胶回收试剂盒，比如天 根，杭州维特洁，深圳天地人，等等。低廉的价格，使得平时用起来也挥洒自如不心疼，如果说进口产品打开的实验自由化之门，那么跟进的国产产品则实实在在让 国内科研经费紧张的实验室也能分享简化实验的快乐，穷人的孩子也有春天。在国内，价格还是最有杀伤力的。天为时代已经被Qiagen收购并改名天根，而在 国产品牌中口碑很好的维特洁也被Axygen收购。生物通在这里列举了部分国产产品的对比，当然，要注意参数是厂家提供的，标准有差别的。品牌天根(天为时代)杭州维特洁(已被Axygen收购)深圳天地人Omega产品普通琼脂糖凝胶回收试剂盒AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒小量胶回收试剂盒琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段大小100bp-10kb75bp-10kb50bp-20kb回收率80%(100 bp的DNA片段回收率为50 %以上)6085%(根据长度不同)85%产品描述可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从TAE或TBE琼脂糖凝胶上回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及 寡核苷酸引物等杂质。采用优化的试剂和方便的DNA制备管，适合从各种电泳凝胶(TAE或TBE)中提取多至8 ug线性DNA。独特的缓冲液体系，在保证凝胶完全融化的同时，防止了DNA片段的损坏和降解。纯化后的DNA保持完整的生物活性，适用于多种用途:如连 接、体外转录、PCR、测序、微注射等分子生物学研究。应用: 酶切,连接,PCR等用途样品: 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段时间: 15分钟结合能力:25μg洗脱体积:30-50μ价格50包装270元200包装980元约5元/反应50包装350元250包装1570元约7元/反应50包装160元100包装240元200包装380元500包装750元约3元/反应50包装299200包装1100约6元/反应(Q-spin)大片段级：指的是片段大小超过10kb的DNA片断，由于越长的DNA分子和纯化膜的结合力越强，洗脱力越差，在离心过柱时可能被“扯断”，因此常规的离 心过柱的方法并不适合对付这些大家伙。在凝胶电泳的大片断回收，特别是几十kb的大片断，经典方法是生物通前文提到的电洗脱。此外，低熔点琼脂糖和琼脂糖 酶消化也是常常有人选用的方法，新兴的方法是用玻璃奶或者纯化填料，生物通在此一并介绍。其实无论用什么方法，在回收大片断时一定要牢记你对付的是大片 断，操作时一定要小心注意，粗暴的操作，最后结果也是自己来承受的。这些方法中，速度最快的就是玻璃奶或者纯化填料珠的试剂盒了。毕竟，谁愿意为一个小小 的胶回收浪费2个多小时呢?有那功夫干点别的不好?我最早用的其实是当时的Pharmacia(后来改为Amersham，现在是GE Healthcare Life Science s)的一个玻璃奶(Glassmilk)试剂盒。现在记得Glassmilk的人应该不多了，在当时却是我们眼中的神奇宝贝半个多小时就可以完成本来 要搞2个多小时的活：溶胶液溶胶后，加入10ul混匀的玻璃奶溶液，混匀静置吸附后，离心去上清，再清洗12次，干燥，最后用洗脱液洗脱，离心取上清即 可。1.QIAEX II产地：Qiagen回收范围：40bp-50kb推荐指数：价格指数：(150次反应2,106，500包装4,860，约14元/反应，半价活动开始以来，这个试剂盒的性价比就很高啦)特点：. 通用性高：一般或者低熔点琼脂糖凝胶，TAE或TBE，以及聚丙烯酰胺凝胶. 无NaI干扰后续实验. 大片段DNA保存较好，不会被剪切使用心得：这个试剂盒不同于Qiagen其它的胶回收试剂盒，利用的是配合高离液盐(chaotropic salt)的silica-gelparticles，因此QiaEX可以从盐，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，染料，蛋白以及核苷酸中无需苯酚抽提或者酒 精沉淀即可获得纯化DNA片段。这个试剂盒使用方法和玻璃奶的试剂盒基本一样，区别在于玻璃奶是粉碎的玻璃，因此可能存在大小不一、边缘尖锐等情况，在离 心力下，大小不同的碎片的沉降系数不同而导致在沉淀中分布位置不同，当长片断一头粘附在大片断一头吸附在小片断上，离心产生的剪切力就会导致长片断的断 裂。而QiaEX的纯化填料是人工特制的大小均一的球形小珠(Beads)，能更好的吸附DNA，也不易产生上述的剪切力问题，使得回收的大片断DNA更 为完整。无论是玻璃奶还是纯化填料，比起过柱的方法，优点在于适用于较大范围的DNA回收，从小片断到超级大片断都可以，适用范围广;而且每次反应可以根据估算的 待回收DNA的量来放大或者缩小纯化试剂的量，比较灵活。比如QIAEX说是150反应(每次5ug)，实际上往往可以用200多次或者更多。但是这个方 法的问题有2个，一个是比较麻烦，需要一定操作经验无论是清洗或者是最后的洗脱，离心后要尽量多取上清而不干扰沉淀，多少有点点难度，特别是最后取洗 脱的DNA，要舍得放弃最后那点上清，免得回收产物中混入了纯化介质，在后面的实验中得不偿失。所以，你可以从此想象，由于每次离心沉淀后沉淀是浸在上清 溶液中的，去除始终不彻底，这就注定了这个方法纯化的产物纯度不如离心高，回收率也不如那么高。你看，QIAEX说这个回收产物可用于酶切、连接、标记和 PCR，但是就没有提到显微注射芯片分析等更高要求的实验。另一个问题是干燥的程度如何把握需要一定经验干过头了洗脱困难，没干透就会将酒精带入后继 实验(有人向生物通投诉过纯化产物测OD得到非常奇怪的读数，过去一看操作，果然是没干透就洗脱的结果)要干到沙面雪白而靠管壁的最边缘还有丁点透明 就可以了。当然，这个现象描述起来不着边际，做过的人就心中了了。洗脱体积通常是20ul。操作要领除了前面提到的问题，就是离心充分，离心后取管子动作 轻快，事前调好加样枪，取上清要轻，靠壁、放枪缓，动作利索，不要千万不要来回抽。舍得放弃。QiaEX相关参数：DNA sizeRecovery*44 bp75%75 bp75%500 bp95%7.5 kb85%23.5 kb75%48.5 kb60%Binding capacity:5 μg DNA per 10 μl QIAEX II suspensionRecovery:6095% of DNA fragments (40 bp 50 kb)Elution volume:Elution volume: 20 μl类似方法的产品还包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit2 Agarose Gel DNA Extraction Kit产地：Roche-Applied Science回收范围：0.4kb100kb(单核苷酸20bp)推荐指数：价格指数：(100次/1356，每次反应13元左右)特点：. 标准的或低熔点琼脂糖回收都可. 可以用于克隆连接或者高特异性标记(基本标记或缺口平移primed labelling or nick translation). 0.4kb9.5kb范围内回收率为80%. 通用型试剂盒：大至100kbDNA片段到小到寡核苷酸都可以. 操作简单. 均匀统一的纯化介质珠，减少剪切力，无杂质(比如酶抑制剂)，不会影响后续反应使用心得：Roche的胶回收试剂盒原理也是一样的，可以完成几乎实验室有关DNA胶回收的所有需要，从基因组 大片段DNA到单核苷酸，并且在回收率上也有出彩的表现：0.4-9.5kb，大约80%;10-100kb，大约60%;单核苷酸(20碱 基)，大约65%.其实，生物通前面提到的纯化介质的方法在使用中有一些操作的问题，其实改良起来也并不很困难。只要多提供一个单纯过滤离心柱，原来的问 题看来应该不难解决直接将混合有纯化介质的溶胶液加入柱子中过滤离心，吸附了DNA的纯化介质在膜上，上清彻底离心到管中，不就不用担心会悬浮沉淀、 干沙等等问题了吗?其实Promega就有这样的解决方法，不过由于那试剂盒主要目的是纯化PCR产物或者酶切反应中的DNA，本身不带溶胶液，所以我们 在这里就不具体介绍了。这种方法通常需时半小时左右，算是比较快速省事的。毕竟大片断的操作要格外小心。除了这种方法，再重复介绍一下其他的一些方法。1. 低熔点琼脂糖：如果你手头有Cambrex(原来的FMC，琼脂糖行业标准的制定者)的SeaPlaque GTG琼脂糖，那真是太幸福了。SeaPlaque是世界上第一个低熔点琼脂糖系列，Cambrex的GTG(遗传技术级别)级琼脂糖特别去除了抑制酶反 应的各种杂质，可以在琼脂糖凝胶中进行各种酶切、连接、PCR、转化等等实验。所以，SeaPlaque GTG凝胶电泳后切下的条带就可以在65度融化(20-30度凝固)，直接进行后继的酶切连接PCR等等的反应了，当然，前提是你的电泳槽和Buffer 要足够干净，最好是专用的。这个反应条件实在是足够温和，当然不便宜，25克琼脂糖要1788大元!特别适合分辨200bp25kb的片断。其实，也就 是大小通用的方法。如果只是普通的低熔点琼脂糖也不要紧，切下来的胶块加入缓冲液65度融化后冷却到室温，可以直接用等体积酚抽，也可以用琼脂糖酶来消 化。酚抽时注意不要剧烈振荡以免损伤大片断DNA，两相间的白色物质是琼脂糖，取上清酚氯仿抽提后乙醇沉淀。琼脂糖酶可以消化融化的琼脂糖为低聚糖，随后 用酚氯仿抽提后用乙醇沉淀。New England Biolabs的这种酶50单位价格300多，每200mg 1%凝胶用一个单位酶，42度条件下反应。Takara的这种酶100单位260多，同样体积的凝胶要用2个单位，可以在60度反应，所以也可以用常规琼脂糖。只是常规琼脂糖在65度挺难融，很费时间。2. 电洗脱的原理是将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相，回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。电 洗脱主要的麻烦是在透析带都比较大、两头要绑，没有刚性的袋子使用不方便，中间溶液体积大，膜面积大容易吸附产物。生物通在03年就有文章介绍以色列一家 公司出品的GeBA产品，是在离心指管两边开窗贴上透析膜，这种管子可用于透析或者电洗脱，由于管子有刚性，内容体积固定，膜面积也很小，同时还提供电洗 脱时放在电泳槽中的架子，操作起来十分方便，很大程度上决了这个困扰。电洗脱条件温和，对琼脂糖没有特殊要求，同时还可以用于丙烯酰胺凝胶中的片断回收或 者是蛋白质的回收。GeBA的产品基因有限公司有售，此外Merck旗下的Novagen也引进了类似的产品，价格相当。详细信息参考：从PAGE胶/琼 脂糖凝胶中回收蛋白质/RNA/DNA的新工具。3. 挖槽法。限于个人习惯的一些不入流的小技巧，有时应急(比如定的产品老不到货时)也可以对付一下。无非就是在条带前面挖坑，加入缓冲液，继续电泳半分钟， 手提紫外观察，等条带全“下海”就把坑里的溶液都吸上来。大片断会遇到的问题通常是出胶慢，上对岸倒快，所以应对就要用2手，一个是在坑里缓冲液中加点什 么让泳动速度降下来(低熔点琼脂糖就是其中一个方法)，要不就在对岸堵上孔径特小的膜，等这边条带全部下后反向电泳一下，让被膜阻挡的DNA回头，离开那 膜。然后取溶液纯化DNA。这些方法通常在条带浓，回收率要求不高的时候可以应急，挺磨耐性的，平常还是用Kit的算了。这里提到的老方法，都要特别注 意，切胶的刀要干净锋利，切口平滑，切得不整齐有时DNA出胶很慢，不知道为什么。我们这里写写，算是忆苦思甜好了。讲完大片断，剩下就是小片断的回收了。小于100bp的片断通常在电泳时就比较难观察分辨，需要用分辨率很高的琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶。比如 Cambrex的NuSieve 3:1或者GTG，或者是大名鼎鼎的MetaPh