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大豆甙元对去卵巢大鼠雌二醇、维生素D和骨矿沉积的影响首席医学网 2009年07月06日 17:38:22 Monday 82 作者：高美 金邦荃 张祎 汤丹 周耀民 詹巍作者单位：南京师范大学食品科学与营养系，江苏 南京 210097 【摘要】 目的 研究不同剂量大豆甙元对去卵巢大鼠雌二醇(E2)激素水平和骨矿沉积的影响。方法 60只3月龄雌性大鼠分为6组：对照组、模型组、4个去卵巢+大豆甙元组，每日分别灌服10 mg/kg蒸馏水和25、50、75、100 mg/kg大豆甙元；9月龄时处死，分别测定骨灰分、Ca、P、Mg、Zn和血清中E225羟基维生素D(25OHD)及骨钙素(BGP)。结果 服用大豆甙元后，去卵巢大鼠血清E2水平未升高，但25OHD和BGP水平恢复正常，从而增加了骨Mg和Zn沉积。结论 大豆甙元通过调高(25OHD)及BGP水平，帮助骨矿沉积，可获得与雌激素替代疗法(ERT)近似的临床效果，但不诱导雌激素高表达，使用安全性高。 【关键词】 雌激素；维生素D；骨矿沉积；大豆甙元；去卵巢大鼠第一作者：高美(1983)，女，在读硕士，主要从事营养学研究。Effects of daidzein on the expressions of estradiol and 25OHD and bone minerals deposition in ovariectomized ratsGAO Mei, JIN BangQuan, ZHANG Yi, et al.Department of Food Science and Nutrition, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, Jiangsu, China 【Abstract】Objective To evaluate the daidzein on the expressions of estradiol (E2) and 25OHD and bone minerals deposition in ovariectomized (OVX) rats.Methods 60 3monthold female rats were divided into normal control, OVX and four different doses of daidzein (25, 50, 75, 100 mg/kg BW) treatment groups. At the end of trial (age of 9month), all the rats were killed to collect their leg bone and blood as samples to test bone mineral, Ca, P, Mg, Zn in bone by atomic absorption method or Ca, P, E, 2,5OHD and BGP in serum by ELISA. Results The serum E2 level was not changed in OVX rats with or without daidzein. The Mg, Zn deposition in bone were increased because the serum levels of 25OHD and BGP were recovered in daidzein treatment groups. Conclusions Daidzein could improve the bone minerals deposition through upregulating the levels of 25OHD and BGP, which is similar to ERT but more safety because the level of E is not increased. 【Key words】Estradiol; 25OHD; Bone minerals deposition; Daidzein; Ovariectomized rats随着年龄增长及更年期的到来，女性卵巢功能逐渐衰退，卵泡退化导致雌激素(E2)水平陡然下降，内源性E2的匮乏，使中老年女性骨代谢平衡遭到破坏，骨吸收大于骨形成，特别是承重骨出现进行性骨量丢失、骨质疏松，甚至骨折。雌激素替代疗法(ERT)治疗更年期骨质疏松已经得到充分的肯定，但其也具有潜在的副作用13。作为植物雌激素的大豆甙元结构与E2相似，为7,4二羟基异黄酮，是含有芳香环的多酚非类固醇化合物，其能与内源性E2受体结合，主要与E2受体的亚型结合，发挥E2样作用4，5。本实验以成年SD雌性大鼠为研究对象，建立骨质疏松模型，观测去卵巢大鼠服用大豆甙元后，体内E2、25OHD、骨钙素(Bone glitamic acid containing protein，BGP)的变化对骨矿沉积的影响，尤其对Ca、P沉积的影响。1 材料与方法1.1 动物分组与饲养60只3月龄SD雌性大鼠，体重为240310 g，(由中国科学院上海动物中心提供)，分为6组，为对照组、模型组、大豆甙元低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组，每组10只，分别灌服25、50、75和100 mg/kg体重大豆甙元。参照国家大鼠配合饲料标准，设计无大豆颗粒饲料，以避免饲料中大豆成分对实验结果的干扰，其他营养成分满足成年鼠生理需要6。术后大鼠于SPF实验室饲养，室温2025，相对湿度70%75%，自由饮水和摄食。饲养至大鼠9月龄时，宰杀取样，制备待测。1.2 去卵巢大鼠模型的构建50只3月龄清洁级SD大鼠于无菌条件下行背部双侧卵巢切除术，建立去卵巢大鼠模型，模拟绝经后骨质疏松7。用0.8 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，腹位固定在手术台上，剪去腰部的被毛，用碘伏消毒。由距最后一根肋骨1 cm的尾侧开始，在背部正中切开皮肤约1 cm，从切口处向左右两侧钝性分离背皮。在腹侧壁肌上确定卵巢部位，做一切口，完整切除卵巢，彻底止血后分层缝合腹膜、肌肉和皮肤。另外10只对照组大鼠不切除卵巢，只切除少许脂肪。术后青霉素抗感染3 d，自由饮水、摄食，5 d后进入正式实验。1.3 实验药品白色粉末结晶的大豆甙元，纯度98%，蒸馏水配制成灌服液，于每日清晨灌服一次；每周分别称量个体体重，以调整灌服剂量。1.4 组织样品预处理9月龄时，所有大鼠空腹称重，直接股动脉放血处死。收集血液，分离血清，4 000 r/min，离心10 min，保存于-20冰箱待测；分离左侧股骨，剔除骨表面软组织，生理盐水浸泡的湿纱布包裹并密封，置于-20冰箱待测。1.5 检测参数与分析方法1.5.1 血清Ca、P分析血清Ca为偶氮胂法，血清P为钼蓝比色法，均用Olympuls AU640 型全自动生化分析仪测定。1.5.2 股骨重、灰分和4元素分析股骨重：取大鼠左侧股骨，称量鲜重；鼓风式烘箱连续48 h烘干，105烘至恒重后并称量干重8；灰分：将烘干后股骨置于电炉上炭化至无烟，放入550马福炉内灰化68 h，称量骨灰重，计算股骨骨矿物质(即灰分)含量(灰重/干重100%)8； 元素分析：骨灰化后，精确称取0.1 g(精确至0.000 1 g)，11盐酸溶解并定容至50 ml；Ca、Mg分析取1 ml酸解液，双蒸水稀释并定容至1 000 ml，Avanta原子吸收分光光度计测定其含量；Zn分析取1 ml酸解液，双蒸水稀释并定容至100 ml测定其含量9。骨P：钼蓝比色法分析其含量，722分光光度计测定吸光度。1.5.3 25OHD、E2与BGP分析25OHD：英国IDSLTD公司试剂盒，采用ELISA方法，BioTek Elx808 酶标仪测定；E2 和BGP：均为放射性免疫分析法，SN695B型智能放免仪测量仪测定。1.6 统计学处理采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。2 结果2.1 大豆甙元对去卵巢大鼠血清Ca、P水平的影响与对照组比较，模型组Ca含量最低；当服用6个月大豆甙元后，去卵巢且服用大豆甙元组大鼠的Ca含量趋于回升，其中高剂量、极高剂量组Ca含量超过对照组，且极高剂量组达显著升高(P0.05)。血清P含量也呈相似模式(表1)。2.2 大豆甙元对去卵巢大鼠骨矿物质的沉积作用9月龄大鼠骨矿沉积的各项指标显示，去卵巢大鼠无论是否服用大豆甙元，其股骨干重及骨矿含量均低于对照组，其中中剂量组和高剂量组显著性减少(P0.05)；其他4组处于同等水平。9月龄时，6组大鼠股骨灰分中P、Mg沉积量接近，无显著差异。不论是否服用大豆甙元，去卵巢各组股骨灰分中的Ca沉积量显著低于对照组(P0.05，P0.01)。骨灰分中Zn的含量，服用大豆甙元各组，骨Zn沉积得以改善，接近对照组(表2)。2.3 大豆甙元对去卵巢血清E2、25OHD和BGP水平的影响对照组大鼠血清E2 依然表达，去卵巢后，5组大鼠血清E2均低于对照组，即使灌服6个月大豆甙元，依然不能增加血清E2水平(表1)。血清25OHD水平，与对照组相比，模型组血清25OHD显著降低(P0.05)；服用大豆甙元4组非常显著高于模型组(P0.01)。并显著高于对照组(P0.05)。血清BGP，无论是否切除卵巢，9月龄大鼠血清BGP均处于同等水平。但是对照组大鼠血清BGP，处于较高水平；去卵巢各组大鼠血清BGP有下降趋势；而服用中剂量、高剂量组和极高剂量组大鼠血清BGP趋于回升，与对照组十分接近(表1)。表1 大豆甙元对去卵巢大鼠血清指标的影响(略)表2 大豆甙元对去卵巢大鼠骨矿物质水平的影响(略)3 讨论3.1 大豆甙元对去卵巢大鼠骨矿沉积的作用更年期女性随着卵巢功能衰退，E2分泌不足，骨量丢失增加，骨组织处于高转换阶段，即骨吸收大于骨沉积。近十年研究认为骨健康与多种矿物元素有关，除磷酸钙盐外，Mg和Zn也参与构建骨组织，以维系骨健康。当Mg缺乏时会导致成骨细胞活性降低，骨形成受抑制，骨板生长受损，以及骨矿化异常，骨强度降低，骨脆性增加，容易骨折；而微量元素Zn是骨生长因子的启动子，是碱性磷酸酶等多种酶的辅基，影响成骨细胞的表达，改变骨吸收与骨沉积的动态平衡。这些矿物元素共同构建骨组织，当人体对食物中的这些元素吸收利用能力下降时，骨矿沉积减少，骨骼强度下降，容易诱发骨质疏松。 本研究表明，对照组大鼠卵巢功能逐渐退化，但尚能分泌一定的E2，帮助食物的Ca、P吸收，有利于骨矿沉积。去卵巢后，各组大鼠体内无内源性E2分泌，肠道对食物Ca、P吸收能力有所下降，但随着大豆甙元剂量的增加，服用大豆甙元的去卵巢4组大鼠血清Ca、P趋于回升，意味着补充大豆甙元可以改善肠道对食物Ca、P的吸收，甚至达到显著性水平。 然而去除卵巢大鼠，尽管服用6个月的大豆甙元，Ca、P向骨骼中的转运却并无实质性变化，说明补充大豆甙元并不能增加股骨Ca的沉积，这与本实验室前期对同一批老龄大鼠同侧股骨生物力学研究结果相一致，大豆甙元并不是通过增加骨Ca沉积来改善骨强度或抗骨折能力10。实验表明，大豆甙元可以影响Mg、Zn向骨骼中转运，使服用大豆甙元的去卵巢大鼠股骨中Mg、Zn沉积量明显较模型对照组增加，与正常对照组处于相同水平。提示，大豆甙元可能会改善大鼠对食物Mg、Zn的利用。本实验室前期研究也证实，大豆甙元可增强股骨挠度和弹性，推测大豆甙元可改善老龄人群四肢骨的抗应力能力，从而降低骨折发生率11。3.2 大豆甙元对去卵巢大鼠E2、25OHD、BGP的影响 更年期女性骨矿代谢处于高转换期，骨形成小于骨吸收，易出现骨矿丢失和骨质疏松。若采用ERT，可以缓解女性骨密度降低和骨折高发生率。25OHD作为骨代谢的标志性指标，可以直接灵敏的反映机体Ca、P代谢状态。当25OHD水平较低时，肾小管对Ca、P的重吸收水平较低，可能会使骨量丢失增加，骨密度降低。BGP是由43个氨基酸组成的酸性蛋白，参与调节体内Ca、P代谢，反映了成骨细胞活性，间接反映骨吸收，是骨转换的标志性指标之一11，它在血液中的变化与碱性磷酸酶(ALP)的表达相平行。 本研究显示，9月龄对照组大鼠尽管已处于老年，卵巢依然具有一定的功能并分泌E2，但是去卵巢组大鼠，不论是否服用大豆甙元，基本无E2表达。因此在本实验条件下，大豆甙元不增加体内E2的表达，说明在某种程度上，大豆甙元不诱导内源性E2的高表达，长期服用应该是安全的，可能不会出现ERT的乳腺癌高发生率的危险。 大豆甙元参与调节大鼠25OHD和BGP的水平，当服用低剂量大豆甙元时，血清中25OHD立即响应。随着大豆甙元的剂量增加，血清25OHD逐渐升高。然而，血清25OHD升高并不能增加骨矿总量、Ca和P在骨骼中的沉积。说明大豆甙元可以增加血清25OHD，促进小肠对Ca、P的吸收，并不改善肾小管对Ca、P重吸收功能，以增加骨Ca沉积；但是它可能通过调节体内25OHD高表达，经过成骨细胞来调节更年期后骨转换，以达到成骨细胞和破骨细胞新的平衡点，来缓解骨质疏松。 进一步研究表明，去除卵巢可抑制成骨细胞的活性，从而间接抑制破骨细胞骨吸收，使骨代谢处于高转换型；当服用75、100 mg/kg剂量大豆甙元后，可以提高去卵巢大鼠血清BGP水平，有利于成骨细胞的表达，从而减少破骨细胞的吸收。进一步证实服用大豆甙元可以减缓更年期后骨代谢的高转换，帮助成骨细胞和破骨细胞维系Ca、P代谢相对平衡，以改善骨组织、骨骼抗应力能力12。 综上所述，给予去卵巢大鼠灌服一定剂量的大豆甙元，不升高内源性E2的水平，具有较好的使用安全性。可以改善体内25OHD和BGP的水平，有利于机体对食物Ca、P的吸收，使血清Ca、P水平升高，进而增加骨骼Mg和Zn的沉积，促进骨盐形成，利于骨矿沉积。大豆甙元具有与ERT近似的临床治疗效果，其通过对成骨细胞的影响，来降低破骨细胞骨吸收作用，维系成骨细胞和破骨细胞的动态平衡，从而降低骨折危险。【参考文献】 1 吕伶，金邦荃.雌激素和大豆异黄酮在细胞水平上对钙代谢的调节J.中国食品卫生杂志，2006；18(2)：1525.2 Zhang Yi，Tang Dan，Jin Bangquan,et al.Effects of daidzein on bone biomechanics in 9month old ovariectomized ratsJ.ARAHE，2007；14(1):1815.3 Arjmandi BH，Alekel L，Hollis BW，et al.Dietary soybean protein prevents bone loss in an ovariectomized rat model of osteoporosis J.J Nutr，1996；126(1):1617.4 Ishimi Y，Miyaura C，Ohmura M,et al.Selective effect