水产品中有机锡化合物的检测方法研究.doc

水产品中有机锡化合物的检测方法研究一、研究背景21.1有机锡化合物的性质21.2有机锡化合物的危害2二、研究进展31 气相色谱法42 液相色谱法53 联用技术53.1 气相色谱联用技术53.2 液相色谱联用技术63.2.1 液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)63.2.2 质谱条件的优化74 毛细管电泳(CE)7小结8启发8参考文献8摘 要：有机锡化合物具有脂溶性，易进入生物体内，通过食物链产生生物富集，对人和动物具有一定毒性。因此研究食品中有机锡化合物的分析方法研究，对保障食品安全，促进人体健康意义重大。本文概述近年来国内外水产品中有机锡化合物分析方法的研究现状，包括气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法等.关键词：水产品；有机锡；分析方法；研究进展一、研究背景1.1有机锡化合物的性质有机锡化合物是指在化学结构中至少含有一个Sn-C键的化合物。有机锡化合物可以用以下通式表示：RnSnX4-n(n=1-4) 式中的R可以是甲基、乙基、丁基、苯基、环已基和其他一些取代的烷基等；X可以是氢、氧、卤素、巯醇基、羟基、羧基或其他一些复杂的官能团。这些复杂官能团与Rn-Sn-结合,构成有机锡的衍生物。根据有机锡化合物中所含Sn-C键数目的不同，可以把有机锡化合物分为四类：四有机锡化合物(R4Sn),三有机锡化合物(R3SnX),二有机锡化合物(R2SnX2)和单有机锡化合物(RSnX3)。这四类化合物性质各异。就毒性而言，四有机锡和单有机锡化合物毒性最低，三有机锡化合物生物活性最高，具有很强的杀生作用。二有机锡在常温下，对水和空气中的氧都很稳定，尤其是具有热稳定性，在减压下蒸馏数小时几乎不分解，所以二有机锡可以用作塑料工业中的稳定剂。大多数的有机锡为液体或固体能溶解于一般的有机溶剂中，只有少数化合物显示出明显的不溶性，如二有机锡氧化物和少部分的有机锡氟化物1。1.2有机锡化合物的危害由于有机锡化合物在各个行业的广泛应用，导致其在环境中的含量得到了大量的累积，这对人类的健康而言是一种潜在的危害。有机锡能干扰牡蛎中钙的代谢，使贝壳加厚，可食用部分减少，还可导致腹足类动物由雌性向雄性转变，通过改变其雌雄比例进而影响其种群繁2。目前，已有多篇报道3-8证实世界各地的海岸港口检测到了有机锡的存在。TMT是工业上制作塑料过程中产生的副产物，它的来源是甲基硫醇锡，塑料制作中因其加入可以使PVC9获得较好的热稳定性、透明性和延展性，表现出了较好的印刷性能，得到的成品在我们日常生活中随处可见，比如水桶、水管及包装袋等等10。TBT主要用于防污涂料以及木材防腐剂中，可以有效抑制细菌和微生物的繁殖。同样地，其经过一系列的代谢作用后，可以得到DBT和MBT11。目前有关有机锡与人体健康的研究大多为体外研究。Heidrich 通过对TBT 影响人类细胞色素P450芳香酶活性的研究发现, TBT 通过降低芳香酶对雌甾酮的亲和力而可能对人体性激素的代谢有影响12。Whalen 研究了丁基锡对人类淋巴细胞的免疫毒性, 试验是取志愿者淋巴细胞在体外接触TBT 、MBT 和DBT 。结果发现丁基锡能够明显抑制淋巴细胞的功能, 即抑制淋巴细胞的抗肿瘤作用13。丁基锡抑制淋巴细胞的抗肿瘤作用, 可能是因为丁基锡快速降低淋巴细胞CAMP 的水平, 从而降低了淋巴细胞的细胞毒功能14。有机锡化合物具有免疫毒性, 大多数研究集中在T 淋巴细胞, 研究发现有机锡化合物也能作用于人类B淋巴细胞, 降低B 淋巴细胞在体外的成活及增生15。20世纪80年代中期以来，相继在世界各地多种样本如海水，海洋底泥，海洋生物，雨水，河水及底泥及城市污水中证实了有机锡化合物的存在。比如埃及16从亚历山大海岸带的底泥中发现了甲基锡和丁基锡。英国17证实某些海湾中的成年和幼牡蛎体内有有机锡的积累。瑞士18在苏黎士污水处理厂的市政污水和活性污泥中发现了甲基锡和丁基锡并研究了他们随污水处理过程的变化。在西地中海海19岸封闭海域也有三丁基锡和三苯基锡的存在。我国有机锡污染问题相当严重，特别是近海、港湾和内河港口。目前，在北方的许多水域都发现了有机锡及其降解产物的污染。有机锡污染可能是造成水生生物污染的主要来源，在个别严重污染区域甚至存在着引起突发性公害事件的潜在危险性。对大连、天津、青岛、北海等地港口水域的采样测定发现，几个采样点毫无例外地存在着有机锡污染，其中三丁基锡(TBT)及其降解产物二丁基(DBT) 和一丁基锡(MBT)的浓度范围平均达到151ng/L20。1999年，江桂斌21等对我国部分内陆水域由于使用丁基锡作为船舶防污涂料而带来的水污染现状进行了研究，运用气相色谱，表面发射火焰光度检测方法对所采样品进行了测定，在我国多处内陆水域发现了丁基锡污染。2001年-2002年，黄长江22对我国东南沿海厦门、汕头和惠阳3港口进行有机锡污染的调查，在水样、底泥和生物样中都检测到有机锡，我国沿海有机锡污染比较普遍和严重，已对生态系统产生实质性的负面生态效应二、研究进展有机锡化合物（organotin compounds，OTC）在工农业等领域应用广泛，例如用作生产塑料稳定剂23，24、农用杀虫剂25及船体防污涂料26等。近 20 年来，环境中有机锡的分析技术发展很快。由于有机锡既含有金属元素，又具有有机物的性质，因此，将有机物分离技术如气相(GC)27、高效液相28(HPLC)、毛细管电泳(CE)与某些特征检测技术，如原子吸收29(AAS)、原子发射30(AES)、质谱(MS)31等相结合的联用技术是目前发展的趋势。1 气相色谱法气相色谱能分析在操作温度下能气化而不分解的物质，而有机锡化合物大多不易挥发，因此采用气相色谱分析此类化合物时，往往要进行衍生化，使其转化为易挥发的物质。目前，有机锡化合物的衍生化反应有3 种方式：1 ) 氢化衍生法：在酸性条件下，利用氢化反应将有机锡化合物转变为相应的氢化物，常用的衍生化试剂有NaBH4 与KBH4。由于有机锡氢化衍生物不稳定、易挥发，该方法目前应用的很少；2 ) 采用格氏试剂32、33进行衍生反应，用格氏试剂衍生时必须在绝对无水的有机溶剂中进行，而且这种方式在衍生反应过程中会产生有害气体，且衍生反应完成后还须将多余的衍生试剂分解后才能用有机溶剂提取，条件较为苛刻，操作也较为繁琐；3)应用四乙基硼酸钠进行衍生反应34、35，在水溶液中加入四乙基硼酸钠直接进行乙基化衍生的方法得到越来越多的应用，这种方式优点是衍生和萃取可一步完成，无需分解过量的衍生试剂，大大简化了反应过程，节省了分析时间，并且形成的衍生物很稳定。Camilla 等34对贝类样品中的丁基锡化合物进行分析，比较了两种衍生化试剂的衍生化效率，一种方法采用格林试剂，另一方法采用四乙基硼酸钠，通过实验对比发现，四乙基硼酸钠能获得更低的检测限，尤其是对TBT。Magi 等36探讨了NaBEt4 浓度、pH 值、缓冲液的浓度对衍生化效率的影响，在超声条件下，用Methanol-tropolone 萃取牡贻类样品中的MB T 、DB T 、TB T 。萃取液经离心、NaBEt 4 衍生化后，用固相萃取进行样品净化，在最佳实验条件下，用GC-MS 进行有机锡分析。结果发现：MBT、DBT、TBT 的LOD 为1118ng Sn/g，LOQ 为1221ng Sn/g，一天内测样的RSD 为1%7%，日间的RSD 为4%11%。在质谱基础上发展起来的串联质谱(MS-MS)具有比质谱还高的分辨力。串联质谱的图谱背景低，从而提高了仪器和方法的检测限，在有机锡分析方面有很大的发展潜力。用气相色谱进行有机锡分析时，样品要经过提取、衍生、净化，再用合适的检测器与色谱联用进行分析，其检测器有多种类型，包括质谱(MS)、火焰光度法、脉冲火焰光度检测器(PFPD)等。GC-MS 在有机锡的形态分析中的应用非常广泛，随着质谱技术的发展，GC-MS 分析有机锡，检测限可以达到p g 级，其灵敏度高、定量准确、重现性好，适合于有机锡化合物的测定2 液相色谱法在使用气相色谱分离有机锡化合物的同时，液相色谱也被用于有机锡化合物的分离。气相色谱对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难，致使其应用受到一定程度的限制。而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子质量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，因此用液相色谱对有机锡化合物进行分析时，不需要衍生化等，只需将有机锡从样品基质中释放出来，简化了样品前处理步骤，节省了分析时间，所以液相色谱建立的方法更加简便、快速。尽管液相色谱对有机锡进行分析时不需要进行衍生化处理，但是能与液相色谱联用的灵敏检测器较少，从而限制了液相色谱的发展37。3 联用技术有机锡化合物组分复杂、浓度低，单一的分离检测方法往往难以满足复杂样品分析检测的要求。分离与检测技术的联用可以发挥各自的优势，满足分析的要求。GC-AES、GC-ICP-MS、HPLC-ICP-MS 等利用色谱的高分离效能与检测器的高灵敏度结合，能满足仪器分析要求的高准确度和灵敏度，可以很好地应用于食品中微量有机锡的检测。3.1 气相色谱联用技术气相色谱- 电感耦合等离子体质谱(GC-ICP-MS)ICP-MS 是利用电感耦合等离子体作为离子源，产生的样品离子经质量分析器和检测器后得到质谱图，利用质谱图对样品所含元素进行定性、定量分析。电感耦合等离子体质谱具有高灵敏度、分析速度快、很宽的线性范围，能够执行元素的分析。由于这些特点，GC-ICP -MS38、39、40联用技术已用于生物样品中有机锡的分析。但ICP-MS 仪器耗费与维修费用高，与气相色谱仪连接接口复杂，且商品化的GC-ICP-MS 传输线不是很多，这些原因限GC-ICP-MS 的应用。Qin 等38向样品中加入HCl-methanol，超声30min，离心，上清液衍生化后，用顶空微萃取HS-SDME 与气相色谱- 电感耦合等离子体质谱GC-ICP-MS 结合测定贝类样品中的丁基锡。实验中对衍生化试剂NaBEt4、NaBH4 的衍生化效率进行比较，发现NaBEt4 衍生化效率更好，所得到的MBT、DBT、TBT 检测限更低，其检测限分别为1.4、1.8、0.8ng/L，相对标准偏差为1.1%5.3%。3.2 液相色谱联用技术HPLC 本身所带检测器对有机锡化合物进行分析时，其灵敏度不高，通过接口技术HPLC 可实现与一些元素特征性检测器联用，这种连接须满足两个条件：1)色谱柱的流量等参数与所用检测器相匹配的问题；2)检测器须控制由此带来的稀释效应以达到最高的灵敏度。3.2.1 液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)HPLC 与ICP-MS 联用作为微量元素分析有效的途径，它融合HPLC 高效分离特点及ICP-MS低检出限、宽动态线形范围及能跟踪多元素同位素信号变化等优点。液相色谱与电感耦合等离子体质谱联测定有机锡时，灵敏度高、检测限低，它是食品中有机锡常用的分析技术。ICP 经过的高温过量的氧气对采样锥造成损害，因此需要适当控制氧气的加入量。Yu 等41利用HPLC-ICP-MS 分析贝类样品中的TMT、DBT、TBT、DPhT、TPhT。采用AgilentTC-C18 色谱柱，CH3CN、H2O、CH3COOH 流动相体积比65:23:12，0.05% TEA，pH3 对菲律宾蛤及毛蛤样品进行超声萃取及高速离心后，用上述方法进行了分析。结果表明：海产品含有4 种有机锡，其中TBT 和TPhT 的含量最高为14.38104.7g/L (干质量)。TMT、TBT 和TPhT 的加标回收率均大于80%。Leng等42利用Eclipse PlusC18反相色谱柱对水产品中7种有机锡化合物进行分离，利用电感耦合等离子体质谱对锡元素进行检测，外标法定量测定水产品中7种有机锡化合物的含量。在leng的文章里，因为文献多采用TC-C18阴离子交换柱43-47或300-SCX阳离子交换柱44分析有机锡化合物。而leng研究旨在同时检测7种有机锡化合物，考察了7种有机锡化合物混合标准溶液在ZORBAX 300-SCX色谱柱的分离情况。ZORBAX 300-SCX离子交换柱能较好的分离DPhT、DBT、TPhT、TBT、TMT等5种有机锡化合物，却对MBT和MPhT无法进行有效分离（图1下），且目前也未见相关文献报道使用该色谱柱对MBT和MPhT化合物进行分离。由图1b可知，采用ZORBAX SB C18分离7种有机锡化合物，在30min内只检测到TBT和DBT ，这可能与SB C18色谱柱采用空间位阻较大的二异丁基侧链基团作为键合相有关，影响了有机锡化合物与键合相的相互作用，导致分离效果不理想。由图1c和1d可知，采用XDB-C18色谱柱能同时有效地分离TMT、MBT、DPhT、DBT、TPhT、TBT等六种有机锡化合物，而使用Plus C18色谱柱则能使TMT、MPhT、MBT、DPhT、DBT、TPhT、TBT等7种有机锡化合物在30min内得到有效地分离。相比SB C18色谱柱，采用二甲基侧链基团作为键合相的XDB C18和Plus C18色谱柱对有机锡化合物的分离颇为有效，两种色谱柱的差别仅在于填料的孔径和比表面积的差异。具有较小孔径和较大比表面积填料的XDB C18分离能力略逊于大孔径小比表面积的PlusC18色谱柱。3.2.2 质谱条件的优化从ICP经过的高温过量的氧气对采样锥造成损害，因此需要适当控制氧气的加入量44。对于质谱条件的优化，由于流动相中有机相的比例较大，很可能导致ICP熄火，因此需要加一路选择气(O2:Ar)合适比例，这样可以减少碳在锥体表面的堆积，避免熄火，然而通入氧氩混合气会明显降低仪器的灵敏度，因此需要平衡好两者的关系，要采用合适配比的氧氩混合气，从而可以最大化的改善仪器熄火的现象，并且达到较高的灵敏度。4 毛细管电泳(CE)毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)是20 世纪80 年代后期分析化学、特别是生物分析化学领域取得的重大研究进展，也是90 年代最有影响力的分离手段之一。毛细管电泳是指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类技术，具有快速、高效、高灵敏度、重现性好及自动化等优点。对同一元素的不同形态，只要有结构或电荷上的差别，即可用CE进行分离48目前毛细管电泳已进入一个新的发展阶段，用毛细管电泳和间接紫外检测器或间接荧光分离有机锡是种较新的方法。小结目前有机锡分析存在两大问题：一是有机锡分析的样品种类少。目前研究主要关注环境中有机锡对人体造成的危害，水产品中有机锡测定的文献相对较少，而食品是人类生存的必需品，必须加强这方面的研究，揭示其对人体健康的危害；二是有机锡分析技术的限制。有机锡的主要分析技术是气相色谱、液相色谱。GC 对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。用气相色谱分析有机锡时，必须进行衍生化步骤，有机锡衍生化是烦琐的、费时的，还会影响有机锡的萃取效率。HPLC 不涉及有机锡的衍生化，分析对象也要广泛得多，可以分离通常以离子或中性形式存在的绝大部分有机锡化合物，适用范围颇为广泛。但是与HPLC 联用的灵敏检测器有限，与GC 和HPLC 相比，毛细管电泳法有很大的应用潜力，越来越受到人们的重视。综上所述，在有机锡化合物研究中，要进一步加大样本检测数量，优化样品前处理条件，尽可能排除各种共存物质的干扰。启发在第十八次论文年会中的讲座中，关于在仪器分析的试验中，得到很多启发，例如分析结果的准确率受很多因素的影响，可以考虑因素，探究最佳实验条件，得到更低的检出限，因此，我考虑了以下几个因素：1、通过调整色谱条件（色谱柱、流动相类型和配比、流速等）、ICP-MS条件，建立有机锡化合物定性定量的分析方法。2、通过溶剂提取、超声、萃取、固相分离等手段，对样品进行处理，获得较稳定的、提取率较高、基质干扰小的处理方法。参考文献1 胡冠九，徐明华有机锡化合物的性质,环境污染来源及测定方法环境监测管理与技术，2000(B12): 14-16,30.。2 CUIYan-Jie, KANG Tian-Fang, CHAO Jing-Bo.20093 Fent K, Mueller M D. Environ.Sci. Technol, 1991, 25:4894934 Ebdon L, Evans K, Hill S. The science of the total environment,1989, 80:63685 Dahab OA.Air and soil pollution, 1988, 40:43344l6 Terry L,Wade. Chemosphere, 1990, 20(6):6476627 IANG Gui-Bin. Journal of hygiene research.2001, 30(1):l38 ZHAO Dong-Mei,WANG Xin-Hong, MA Jian-Qiang, HONG Hua-Sheng. Journal of tropical oceanography. , 2007, 26(4):7683 9 Sadiki AI, Williams DT, Carrier R, et al. Plot study on the contamination ofdrinking water by organotin compounds from PVC materials J .Chemosphere, 1996,32: 2389-2398 10 代佼，王正虹，李林.三甲基氯化锡的毒性及危害研究进展.现代预防医,2011,Vol.38,NO.811 Muhammad Bachri Amran, A. Sentosa Panggabean, Buchari Buchari.Ion-pair reversed-phase chromatography for speciation of organotin compoundsAnn Toxicol Anal. 2010; 22(3): 129-134 12 Heidrich D D, Steckelbroedk S, Klingmuller D.Inhibition of human cytochrome P450 aromatase activity by buty ltins J .Steroids , 2001 , 66(10):763 769. 13 Whalen M M, Loganathan B G , Kannan K.Immunotoxicity of environmentally relevant concentrations of butyltins on human natural killer cells in vitro J .Environ Res, 1999, 81 (2):108 116 . 14 Whalen M M, Loganathan G B.Butyltin exposure causes a rapid decrease in cyclic AMP levels in human lymphocytes J .Toxicol Appl Pharmacol , 2001, 171(3):141 148. 15 De Santiage A, Aguilar-Santelises M .Organotin compounds decrease in vitro survival , proliferation and differentiation of normal human B lymphocytes J .Hum Exp Toxicol, 1999 , 18(10):619 624.16 Dahab,O.A. Water, air and soil pollution, 1988,40,433-44117 Ebdon,L., Evans,K. Hill S., The science of the total encironment,1989,80:63-6818 Fent,K, Muller,M.R. Environ, Sci. Techno., 1991,25,489-49319 Wade,T.L.,et al. chemosphere,1990,20(6),647-66220 江桂斌，徐福正有机锡化合物测定方法研究进展海洋环境科学，1999,(3):61-68.21 江桂斌，刘稷燕我国部分内陆水域有机锡污染现状初探环境科学学报，2000（5）: 636-638. 22 黄长江， 董巧香，等.我国东南沿海 3 港口有机锡污染的调查海洋学报,2005（1）: 57-63. 23 江桂斌国内外有机锡污染研究现状卫生研究，2001，30(1)：1324 石孝洪，魏世强，李 军有机锡化合物的环境化学行为及效应重庆大学学报，2003，26(7)：10410725 王永芳有机锡化合物的污染及其毒性中国食品卫生杂志，2003，15(3)：24424726 Vinas, P., Lopez-Garcia, I., Merino-Merono, B., Campillo, N.,Hernandez-Cordoba, M. Journal of Environmental Monitoring. 2004, 6(4):26226627 Minganti, V., Capelli, R., Depellegrini, R. Fresenius Journal of Analytical Chemistry. 1995, 351(4-5): 47147728 Munoz, J., Gallego, M., Valcarcel, M. Analytica Chimica Acta.2005,548(1-2):667229 Munoz, J., Gallego, M., Valcarcel, M., Analytical Chemistry. 2005,77(16):5389539530 Xu Fuzheng，Jiang Guibin，Han Hengbin. Chinese J. Anal. Chem. 1995，23(11)：1308131231 Raimund Wahlen, Tim Catterick. Journal of Chromatography B. 2003,783:22122932 GUERIN T, SIROT V, VOLATIER J L, et al. Organotin levels in seafood and its implications for health risk in high-seafood consumersJ.Science of the Total Enviorment, 2007, 388: 66-77.33 JIANGGuibin, ZHOUQunfang.Direct grignard pentylation of organotin contaminated lard samples followed by capillary gas chromatography with flame photometric detectionJ. Journal ofChromatography A, 2000,886: 197-20534 CAMILLA L, MARINA D C, EMANUELE M. Comparison of two analytical methods for the determination of organotin compounds in marine organismsJ. Comptes Rendus Chimie, 2009, 12(8): 831-840.35 沈海涛, 马冰洁, 高筱萍, 等. 气相色谱 - 质谱法测定水产品中的有机锡J. 中国卫生检验杂志, 2008, 18(1): 69-70.36 MAGI E, LISCIO C, di CARRO M. Multivariate optimization approach for the analysis of butyltin compounds in mussel tissues by gas chromatography-mass spectrometryJ. Journal of Chromatography A, 2008, 1210(1): 99-107.37 柳英霞，李娟，等食品中有机锡化合物分析方法研究进展J，食品科学2010, Vol. 31, No. 19 43538 QIN Xiao, HU Bin, HE Man. Speciation of butyltin compounds in environmental and biological samples using headspace single drop microextraction coupled with gas chromatography-inductively coupled plasmamass spectrometryJ. Journal of Chromatography A, 2008, 1211:135-141.39 俞是聃, 肖毓铨, 陈晓秋, 等. 气相色谱与电感耦合等离子体质谱联用测定海产品中有机锡的研究J. 福建分析测试, 2008, 17(1): 40-43.40 UVEGESM, RODRIGUEZ-GONZALEZ P, GARCIA ALONSO J I, etal. Isoto