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蛋白质吸附分离研究进展【摘要 】 本文主要说明蛋白质的分子结构，总结近年来蛋白质的吸附理论及分离技术研究成果。【关键词】 蛋白质；吸附；分离；表面活性剂目前，蛋白质的吸附已成为一个非常重要而活跃的研究领域。随着科技进步，使得新型分离技术的开发，需求迫切。另一方面，由于生物反应过程机理十分复杂，反应较难控制，反应液中杂质含量多，目标产物含量低，也给纯化分离带来了很大困难。本文主要对蛋白质的吸附及分离进行综述。1 蛋白质分子结构蛋白质一般由20种不同的氨基酸组成，氨基酸之间由肽键连接。肽键与一般的酰胺键一样，由于酰胺氦上的孤对电子与相邻羰基之间的共振相互作用(resonance interaction)表现出高稳定性。肽键的实际结构是一个共振杂化体。由于氧原子离域形成了包括肽键的羰基0、羰基C和酰胺N在内的O-CN轨道系统，从而使得肽键的C-N具有部分双键的性质而不能自由旋转。肽键的C、0、N、H和与之相邻的两个a碳原子处于同一个平面，此刚性结构的平面就叫肽平面。肽链主链上的仅碳原子连接的两个键cN键和C-C键能够自由旋转。如果不考虑键长和键角的微小变化，多肽链的所有可能构象都能用P和中这两个二面角来描述。2蛋白质吸附的理论分析21 蛋白质吸附的理论由肽链结构可知，蛋白质属于两性电解质，根据所处溶液pH不同表面净电荷可正可负。研究认为，蛋白质吸附过程中的相互作用包括氢键、静电和疏水等非共价的相互作用2。3种相互作用的本质都与静电作用相关。其中氢键的形成是由于电负性原子与氢形成的基团中氢原子周围分布的电子少，正电荷氢核与另一电负性强的原子之间产生静电吸引，从而形成氢键。疏水相互作用又称为非极性相互作用，发生于非极性基团之间，蛋白质同时含极性和非极性的基团，当蛋白质处于水溶液中时，极性基团之间以及极性基团与水分子之间易发生静电吸引而排开非极性水基团，因此疏水相互作用并非是疏水基团之间有吸引力的缘故，而是非极性基团由于避开水的需要而被迫接近（8）。这些相互作用本身与小分子的吸附没有差别。蛋白质吸附的独特性在于吸附的是大分子，以及吸附过程蛋白质可以发生各种物理(如构象变化)和化学的变化。22材料表面性质对蛋白质吸附的影响当蛋白质吸附在材料的表面，其构象和序列将发生变化，因此蛋白质的构象和序列会影响蛋白质的吸附行为。有研究认为，蛋白质与材料表面的相互作用(包括静电力、范德华力、氢键、疏水作用)，使吸附的蛋白质的构象发生变化而达到稳定吸附的状态（4）。另外是平铺式还是直立式吸附，在材料的表面也会影响蛋白质的吸附量屿（4）。蛋白质的吸附会引起其物理和化学性质的变化。初始的吸附现象是瞬间的，这种瞬间的初始吸附会伴随吸附层的结构重整及再组织化晗。这种结构重整除了会降低系统的吉布斯自由能外，对于吸附层上的蛋白质还会有变性或分子展开的效应，这会使原本被包覆在内部的疏水性氨基显露出来。以不带电的聚甲醛和牛血清蛋白进行研究，观察到蛋白质浓度升高时吸附量也相应升高，当BSA浓度达到06 gL时得到最大吸附值(3mgm2)，之后吸附量不再与蛋白质浓度有关（5）。蛋白质在等电点时具有最大吸附量，并且在等电点附近呈对称分布(1)。造成此现象有2个原因：蛋白质于等电点时具有最小溶解度，此时所需的吸附能最低；静电排斥力在等电点时最小。3蛋白质与表面活性剂的相互作用蛋白质是两性多聚电解质，它的肽链又因形成各种有序结构而形成“亲水区”和“疏水区”，表现出一定的表面活性。它和表面活性剂的相互作用，主要包括电性和疏水性两部分，这就使它们相互作用比较复杂。用疏水柱在FPLC仪上测定了一些蛋白的表面疏水性(2)。发现蛋白质的疏水性与表面性质密切相关，而与蛋白质的分子量、疏水残基总数并不直接相关。从动力学和热力学的角度对表面活性剂和蛋白质的相互作用进行了探讨，从理论上对表面活性剂和蛋白质的相互作用进行了总结（1）。这一领域的研究主要集中于3个方面：表面活性剂一蛋白质复合物结构的研究及蛋白质结构的变化；表面活性剂一蛋白质混合溶液的相行为；表面活性剂一蛋白质混合溶液的界面吸附。用表面张力法研究了SDS和肌酸激酶的相互作用|。在蛋白质溶液中引入带相反电荷的表面活性剂时，因电荷中和，使复合体的净电量减少直至零，并引入了一些疏水基，故复合体的水溶性下降，沉淀析出。当表面活性剂的量进一步增加时，因疏水吸附、表面活性剂大量吸附达149SDSg蛋白质，复合体带净电荷增加，故水溶性增加，沉淀又复溶解。表面活性剂和蛋白质的这种作用可能意味着表面活性剂与蛋白质的相互作用有两个比较明显的作用阶段：电性作用和疏水作用。31 蛋白质与非离子表面活性剂相互作用早期的理论认为非离子型表面活性剂与蛋白质问由于缺乏静电引力而不能发生相互作用。但近来的研究表明，非离子型表面活性剂与蛋白质也存在相互作用，这种作用极大地影响吸附层的性质，对乳液的稳定性尤为重要。研究蛋白质与非离子型表面活性剂在界面的吸附多采用LB膜技术和界面流变学研究方法。采用磺化聚苯乙烯乳胶膜作为表面，运用LB膜技术测定Tween20对B一酪蛋白的置换量及置换过程中吸附层的水化厚度12|。研究表明，随着Tween20质量分数的增加，蛋白质被置换下来，吸附层的水化厚度降低，Tween20的加入降低了以蛋白质为乳化剂的乳液的稳定性。在总结大量实验事实的基础上提出了蛋白质一表面活性剂混合体系界面吸附的2种机理：增溶机理。分散在表面的蛋白质分子与水溶性的表面活性剂形成蛋白质一表面活性剂复合物，使蛋白质分子以复合物的形式进入水相。此时，表面活性剂与被吸附的蛋白质有强烈的相互作用；置换机理。由于表面活性剂与表面的相面上分散的蛋白质被表面活性剂置换下来。此时，表面活性剂必须强烈地吸附于表面。一般离子型表面活性剂与蛋白质混合体系是增溶机理，而非离子型表面活性剂与蛋白质的混合体系主要是置换机理。Levitz对具有长极性链非表面活性剂烷基苯酚聚乙烯已二醇(CNaPENp)的表面作用进行了研究并提出了相应的简化了的热力学模型，聚乙烯链(POE)比离子型表面活性剂的相互排斥力弱，吸附后的形态如同伸展的皇冠状。磷脂和肺部的一种主要亲水蛋白质(sP-A)的相互作用，发现了一种“花束”状吸附结构。并用电镜观测了其微观结构。吸附过程中添加二价离子(如钙离子)，发现蛋白质和磷脂层的结构发生了改变。Ruso等研究了不同表面活性剂一蛋白质比率下全氟表面活性剂与溶菌酶的相互作用16I。动态光散射发现酶的构型基本保持不变，只有二级结构略微变化。氟原子的疏水性很强，但由于C-F键的刚性，阻碍了疏水相互作用，结果导致主要相互作用为静电作用。应用Longrnuir-Blodgett单层技术研究4种表面活性助沉降剂(它们的疏水基团相同)固定化脂肪酶，在一定表面压力下用表面活性剂单层包裹脂肪酶(6)。复合物的订一A(A为分子ilia)曲线趋势与纯表面活性剂有显著不同，说明几种表面活性剂与脂肪酶有相互作用。表面电势能(u)可以用来表征单层分子电偶级的方位，U越大，偶极相互作用力越显著。32蛋白质吸附表面活性剂的测定方法通常，测定蛋白质吸附表面活性剂的方法是“渗透平衡法”。但该法不仅复杂、耗时，而且不精确。李学刚等提出了采用阴、阳离子表顶活性剂互滴定和表面张力2种简单方法测定蛋白质和表面活性剂的结合量，结果颇为近似，说明此2种方法在测定蛋白质对表面活性剂吸附方面是可行的。界面剪切流变测定法可用来研究蛋白质和低分子量表面活性剂之间的相互作用。NMR弛豫技术通过测定亲水基a一碳氘代表面活性剂的旋转弛豫速率表征蛋白质一表面活性剂复合物的微观结构。冷冻蚀刻电镜(CryoTEM)可以在纳米层次上直接观察蛋白质分子、蛋白质一表面活性剂聚集体以及它们在稀溶液中的形貌变化，是一种较NMR更定量的技术(7)。荧光技术作为种传统的研究聚集体的方法，在研究蛋白质结构变化方面又有新的发展。通过使激发波长和入射波长保持固定的波长间距，同步扫描激发和发射单色器，可得到同步荧光光谱。根据发射光谱中波长的改变可判断蛋白质的构象的变化。同步荧光光谱技术已应用于药物与蛋白质的相互作用的研究中。将这种技术应用于蛋白质与表面活性剂相互作用的研究中将会发挥重要的作用。4蛋白质的分离蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。可以用凝胶过滤法、超滤法、盐析法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质进行分离。如顾有方等就是根据蛋白质的这种特性对血液中免疫球蛋白进行提取的。在室温下，采用盐析和等电点沉淀工艺分离除去提取液中的大豆蛋白质脚。翁瑜等的双向凝胶电泳比较3种常用蛋白质提取方法可以看出，双向凝胶电泳的效果更好。仝向荣等通过离子交换、凝胶过滤、亲和层析及反向高效液相色谱操作，提取了棒纹牛蛭体内抗凝血蛋白。磁性高分子纳米颗粒分离蛋白质的原理主要分静电吸附分离和亲和分离。基于静电吸附原理，Bucak等人利用磷脂包裹的磁性纳米颗粒的表面负电性选择性分离出了带有正电荷的蛋白质。Liao等制备了一种离子交换效率高、吸附解离速度快的核壳型(Fe。OJPAA)磁性纳米吸附介质。利用该磁性纳米吸附介质，基于静电吸附原理成功分离了水相中的菠萝蛋白酶。同样是利用这种磁性高分子纳米颗粒基于亲和技术实现了目标蛋白的选择性分离，利用这种水溶性磁性纳米颗粒表面的羧基，共价交联IDA进而固定Cu2+，最后实现组氨酸标记蛋白的捕获嘲。其实验原理和Xu研究小组的类似隗驯，只是将原来的无机磁核首先包被了PAA，这样磁性纳米颗粒的磁响应特性增强，同时壳材料的保护也使得该颗粒能够在生理环境中稳定存在。利用N一异丙基丙烯酰胺包裹磁性纳米颗粒的热敏性，通过改变温度控制吸附或者解离，并成功的应用于牛血清白蛋白的分离。运用磁性纳米微粒经过表面修饰，连接NH。集团作为分离器(NNPNH2)，很容易从生物样品中分离蛋白质。笔者认为蛋白质的磁分离具有快速、高纯度、高收率等优点。5总结蛋白质是构成生物体内具有生物活性的高聚物分子，结构复杂。研究蛋白质在界面上的吸附对于了解蛋白质在界面上的吸附及分离提取蛋白质具有重要意义。蛋白质的吸附研究和分离工作仍是一项艰巨的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把各种蛋白质从复杂的混合物中吸附出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离程序来获取高纯度的制品纯化。不过我们相信在今后科学工作者们一定能够找出更多更好的方法来吸附分离蛋白质，使得对蛋白质有更深入的研究。参考文献【1】沈同，王镜岩生物化学(上)，第二版北京：高等教育出版社，1990【2】李学刚，董佳里，张光先表面张力法研究表面活性剂和肌酸激酶相互作用西南农业大学学报，1997，19：【3】李学刚，董佳里蛋白质吸附表面活性剂的两种测定法研究西南农业大学学报，1997。【4】顾有方，刘