DNA的重组.ppt

第35章DNA的重组 一 引言1 概念 DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合 称为遗传重组 geneticrecombination 或者基因重排 generearrangement 重组产物为重组体DNA recombinantDNA 2 意义 DNA重组对生物进化起着关键的作用它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制某些生物的基因表达受DNA重组的调节 3 类型 同源重组 homologousrecombination 位点专一性重组 site specificrecombination 转座重组 transpositionrecombination 二 同源重组 同源重组又称一般性重组 同源重组发生在DNA的同源序列之间 通过配对 链的断裂和再连接 而产生片断交换的过程 真核生物非姊妹染色单体的交换 细菌及某些低等真核生物的转化 细菌的转导 接合等都属于这一类型 一 Holliday模型 RobinHolliday于1964年提出四个关键步骤有 两个同源染色体DNA排列整齐 一个DNA的一条链裂断并与另一个DNA对应的链连接 形成的连接分子 jointmolecule 称为Holliday中间体 intermediate 通过分支移动 branchmigration 产生异源双链 heteroduplex DNA Holliday中间体切开并修复 形成两个双链重组体DNA 片段重组体patchrecombinant 拼接重组体 splicerecombinant Holliday模型存在的问题 很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂 Meselson和Radding对此提出了修正意见 他们认为同源DNA分子中只有一个分子发生单链断裂 现在认为 同源重组是减数分裂的原因 而不是减数分裂的结果 DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换 藉以将同源染色体分配到子代细胞中去 因此 双链断裂启动重组 也启动了减数分裂 二 细菌的基因转移与重组 细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移 并通过基因重组以适应随时改变的环境 这种遗传信息的流动不仅发生在种内 也发生在种间 甚至与高等动植物细胞之间也存在横向遗传传递 horizontalgenetictransmission 细菌的基因转移主要有四种机制 接合 conjugation 转化 transformation 转导 transduction 细胞融合 cellfusion 1 细菌的接合作用 细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞 称为接合作用 供体细胞被定义为雄性 受体细胞为雌性 通过接合而转移DNA的能力是由接合质粒 conjugativeplasmid 提供的 与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码 能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子 fertilityfactor 简称为性因子或F因子 F质粒性质 双链闭环的大质粒 总长约100kb 复制起点为oriV 可以在细胞内游离存在 也可以整合到宿主染色体内 因此属于附加体 与转移有关的基因 tra 占据质粒的三分之一 33kb 称为转移区 包括编码F性菌毛 Fpilus 稳定接合配对 转移的起始和调节等 总共约40个基因 细菌的结合作用 traS和traT基因编码表面排斥蛋白 阻止F 细胞之间的转移 F 细胞的性菌毛与F 细胞结合后收缩 使二者靠近 TraD蛋白构成转移的通道 TraI在TraY的帮助下结合到转移起点oriT上 切开一条链 使其5 端进入受体细胞 并合成其互补链 使F 细胞转化为F 细胞 给体细胞中的单链也可以合成互补链 TraA基因编码的亚基蛋白聚合成中空管 2 3 cell 在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开 可以确定基因在染色体上的位置 F质粒DNA可以通过重组整合到受体的染色体中 使受体菌成为高频重组 Hfr 菌株 若F质粒的DNA未能完整地进入受体菌 则受体菌不能转化为F F质粒的DNA可以被切割出来 有时可携带宿主菌的染色体DNA 称作F 因子 F 因子携带的基因可在受体菌表达 2 细菌的遗传转化 遗传转化 genetictransformation 是指细菌品系由于吸收了外源DNA 转化因子 而发生遗传性状的改变现象 具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞 competentcell 很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能力 有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低 但在实验室中可以人工促使转化 例如大肠杆菌 用高浓度Ca2 处理 可诱导细胞成为感受态 重组质粒得以高效转化 转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能 如 感受态因子 与膜结合的DNA结合蛋白 自溶素 多种核酸酶等 感受态因子诱导与感受态有关的蛋白质表达 自溶素使与膜结合的DNA结合蛋白和使核酸酶裸露出来 当游离DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后 核酸酶使其中一条链降解 另一条链被吸收 与染色体DNA重组 3 细菌的转导 转导 transduction 是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程 转导有两种类型普遍性转导 generalizedtransduction 是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌 局限性转导 specializedtransduction 某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA 4 细菌的细胞融合 在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组 在实验室中 用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖 使之成为原生质体 可人工促进原生质体的融合 由此使两菌株的DNA发生广泛的重组 三 重组有关的酶 大肠杆菌重组有关的酶 RecA 诱发SOS反应 促进DNA单链的同化RecF O R 调节RecA纤丝的装配与拆卸RecB C D 产生参与重组的DNA单链RuvA B C 产生促进异源双链的形成和切开Holliday联结体其中RecA蛋白参与重组是最关键步骤 DNA单链的同化 assimilation 是指单链与同源双链分子发生链的交换 从而使重组过程中DNA配对 Holliday中间体的形成 分支移动等步骤得以产生 RecA蛋白的丝状聚合体与DNA的相互作用 RecA蛋白的带状图 MW 38kD RecA蛋白的丝状聚合体 每一圈螺旋由6个RecA蛋白单体构成 其中一个单体由红色标出 RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链主要途径 RecBCD酶具有三种酶活性 依赖于ATP的核酸外切酶活性 可被ATP增强的核酸内切酶活性 ATP依赖的解螺旋酶活性 当DNA断裂时 它结合在其游离端 使其解旋并降解 直至酶移动到chi位点 GCTGGTGG 在其3 侧4 6核苷酸处将链切断 产生3 游离单链 随后单链与RecA结合 开始同源区重组 在大肠杆菌中由RuvA RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组 左 RuvA四聚体蛋白能够识别Holliday联结体 junction 的交叉点结合到Holliday位点 中 RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面 DNA穿过其中心 RuvB是一种解螺旋酶 通过水解ATP而推动分支移动 右 RuvC是一种核酸内切酶 结合到Holliday位点 切断核酸链 它识别不对称的四核苷酸ATTG 此序列因而成为切开Holliday联结体的热点 并决定结果是片段重组还是拼接重组 即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子 二 特异位点重组 特异位点重组广泛存在于各类细胞中 起着十分特殊的作用 包括 某些基因表达的调节发育过程中程序性DNA重排病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等 此过程往往发生在一个特定的短的 20 200bp DNA序列内 重组位点 并且有特异的酶 重组酶 和辅助因子对其识别和作用 特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向 重组位点以白箭头表示 A 重组位点反方向位于同一DNA分子 重组结果发生倒位 B 重组位点同方向位于同一DNA分子 重组发生切除 位于不同分子 重组发生整合 1 噬菌体的整合与切除 噬菌体侵入大肠杆菌细胞后 面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择 其DNA在不同生活型之间的转换 包括两种状态 进入溶源状态需要 DNA整合 integrate 进宿主DNA 噬菌体DNA是细菌染色体的整合部分由溶源状态进入裂解状态需要 DNA从宿主DNA上切除 excise 下来 DNA在宿主细菌中以环状分子独立存在 两种周期取决于CI和Cro两种蛋白质的拮抗结果 噬菌体的位点专一性重组 2 细菌的特异位点重组 IgG的分子结构 3 免疫球蛋白的基因重排 Kappa链基因族 小鼠6号染色体 人2号染色体 Lambda链基因族 小鼠16号染色体 人22号染色体 小鼠重链基因族 12号染色体 人重链基因族 14号染色体 小鼠 Vk 250Jk4人 Vk76Jk5 小鼠 Vl2JlCl3人 Vl 300JlCl6 250 1000 300 种系免疫球蛋白基因族片断的排列 免疫球蛋白基因族片断的重排有严格的顺序性 第一次重排在前B细胞中 首先是重链重排 称V D J连接 D J V D J 随机的 接下来是轻链重排 形成V J复合体 先k 富含A 回文结构 免疫球蛋白基因重组的模型 1 重组酶 RAG1 RAG2 复合体与重组信号序列结合 2 复合体使编码序列与重组信号序列之间的双连断裂 编码序列先成3 OH和5 PO4 末端再形成发夹结构 3重组信号序列结合形成环状结构 9碱基序列 7碱基序列 三 转座重组 转座因子 transposableelement 是一种可以由染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子 也就是一段可以发生转座 transposition 的DNA 又称为转座子 transposon 转座的结果 宿主序列删除 倒位或易位位于不同位点的两个拷贝转座子之间可以发生交互重组 从而造成基因组不同形式的重排 因此转座子被称为是自私的DNA selfishDNA 一 细菌的转座因子 细菌的转座因子有两类 一类为插入序列 IS 是简单的转座子 除转座所需基因外不携带任何标记基因 它的存在只能借助插入位点有关基因的失活来判断 或者通过分子杂交和测序来检测 另一类是复杂转座子 Tn 除转座酶 transposase 基因外还携带各种标记基因 因而易于检测其存在 1 插入序列 插入序列是最小的转座因子 所有插入序列的两端都有反向重复 invertedrepeats 为转座酶识别所需 通常重复序列长度为15 25bp 重复序列有时只是类似 并非完全相同 2 转座子 按其结构分为两类 组合因子 compositeelement 由个别模件组合而成 通常包括两个插入序列作为两臂 中间为标记基因 复合因子 complexelement 含有转座酶基因 解离酶 resolvase 基因以及标记基因 两端为反向重复 无插入序列 组合转座子的结构 IR IR 中心区 IR IR IR IR IR 中心区 IR IR IR 两臂正向两臂反向 3转座过程与效应 过程 转座酶能够识别转座子的末端反向重复序列并且在其3 端切开 同时在靶部位交错切开单链 它的5 突出末端与转座子的3 末端连接 形成Shapiro中间体 按转座过程是否发生复制 可分为 非复制转座 nonreplicativetransposition 复制转座 replicativetransposition 非复制转座与复制转座的基本过程 所有转座因子都有在基因组中增加其拷贝数的能力 此过程可以借助两种方式来完成 一是通过转座过程的复制 复制转座 另一是从染色体已完成复制的部位转到尚未复制的部位 然后随着染色体而复制 非复制转座的转座因子只能借后一种方式来扩增 共整合体含有两个拷贝的转座子 故可通过同源重组将连接的两部分分开 但是借助RecA蛋白拆分效率较低 转座子编码的解离酶可在解离区 res 进行重组 可极大提高解离效率 解离酶是一种重组酶 它所催化DNA链的断开和再连接并不需要供给能量 当它在res位点断开两条链时 解离酶以共价键连在键的5 末端 转座因子首先因其可导致突变而被认识 它插入基因后 使基因突变失活 这是转座作用最直接的效应 效应 引起宿主染色体DNA重组造成染色体断裂重复缺失倒位易位通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或转座因子本身的作用而影响邻近基因的表达 二 真核生物的转座因子 最早发现能转移的遗传因子是玉米转座子 它对染色体基因有不稳定的诱变效应 因而影响某些遗传性状 故称为控制因子 其后发现真核生物广泛存在各种转座因子 真核生物 原核生物转座因子相似点 转座依赖于转座酶转座因子的两端反向重复序列靶位点交错切开 插入转座因子后经修复形成两侧正向重复序列 差别点 真核生物细胞内只要存在转座酶 任何序列片段具有该酶识别的反向重复末端均可发生转移 而无需由被转移序列自身编码这些酶 原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子 表现出顺式显性 cisdominance 真核生物则无此特性 这也是二者最明显的差别 1玉米的控制因子系统激活 解离系统 activator dissociationsystem Ac Ds Ac编码转座酶 自主因子 Ds 非自主因子 是Ac不同程度的缺失中间序列形成的 无转座酶活性 可通过反式作用产生转座 抑制 促进 增变系统 suppressor promotor mutator Smp Smp和En enh