实时荧光定量PCR具体实验步骤.doc

1 样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30孵育10分钟后，于4下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4下7000rpm离心5分钟。RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80待用。2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 稀释倍数 40 ?g/ml。具体计算如下：RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60，10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3?gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3 样品cDNA合成反应体系序号 反应物 剂量1 逆转录buffer 2l2 上游引物 0.2l3 下游引物 0.2l4 dNTP 0.1l5 逆转录酶MMLV 0.5l6 DEPC水 5l7 RNA模版 2l8 总体积 10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5l，37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（-actin）实时定量PCR-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3l按10倍稀释（加水27l并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。反应体系如下：标准品反应体系序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10l2 阳性模板上游引物F 0.5l3 阳性模板下游引物R 0.5l4 dNTP 0.5l5 Taq酶 1l6 阳性模板DNA 5l7 ddH2O 32.5l8 总体积 50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10l2 内参照上游引物F 0.5l3 内参照下游引物R 0.5l4 dNTP 0.5l5 Taq酶 1l6 待测样品cDNA 5l7 ddH2O 32.5l8 总体积 50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后93 1分钟，55 2分钟，共40个循环。5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号 反应物 剂量1 10 PCR缓冲液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul3 上游引物F 0.5 ul4 下游引物R 0.5 ul5 dNTP混合液 3 ul6 Taq聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为 25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（941分钟；551分钟；721分钟）； 72?C延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为11010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量PCR所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上游引物 1ul3 下游引物 1ul4 dNTP 1ul5 Taq聚合酶 2ul6 待测样品cDNA 5ul7 ddH2O 30ul8 总体积 50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：932分钟预变性，然后按93 1分钟，551分钟，721分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序