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文档简介
1 样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30孵育10分钟后,于4下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4下7000rpm离心5分钟。RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80待用。2 RNA质量检测1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为:A260 稀释倍数 40 ?g/ml。具体计算如下:RNA溶于40 ?l DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495?l的TE中,测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ?l,剩余RNA总量为:35 ?l 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。2)变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60,10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS,pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3?gRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3 样品cDNA合成反应体系序号 反应物 剂量1 逆转录buffer 2l2 上游引物 0.2l3 下游引物 0.2l4 dNTP 0.1l5 逆转录酶MMLV 0.5l6 DEPC水 5l7 RNA模版 2l8 总体积 10l轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5l,37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80待用。4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(-actin)实时定量PCR-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3l按10倍稀释(加水27l并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。反应体系如下:标准品反应体系序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10l2 阳性模板上游引物F 0.5l3 阳性模板下游引物R 0.5l4 dNTP 0.5l5 Taq酶 1l6 阳性模板DNA 5l7 ddH2O 32.5l8 总体积 50l轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。管家基因反应体系:序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10l2 内参照上游引物F 0.5l3 内参照下游引物R 0.5l4 dNTP 0.5l5 Taq酶 1l6 待测样品cDNA 5l7 ddH2O 32.5l8 总体积 50l轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:932分钟,然后93 1分钟,55 2分钟,共40个循环。5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系:序号 反应物 剂量1 10 PCR缓冲液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul3 上游引物F 0.5 ul4 下游引物R 0.5 ul5 dNTP混合液 3 ul6 Taq聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为 25ul轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。35个PCR循环(941分钟;551分钟;721分钟); 72?C延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为11010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量PCR所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下:序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上游引物 1ul3 下游引物 1ul4 dNTP 1ul5 Taq聚合酶 2ul6 待测样品cDNA 5ul7 ddH2O 30ul8 总体积 50 ul轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:932分钟预变性,然后按93 1分钟,551分钟,721分钟,共40做个循环,最后727分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序
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