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第十章 紫外-可见分光光度法教学目的、要求：掌握：紫外-可见分光光度法的基本原理和概念；比尔朖伯定律；紫外-可见分光光度计；外-可见吸收光谱法的定性分析和定量分析方法及其应用；紫外吸收光谱与有机分子结构的关系。熟悉：吸收带及与分子结构的关系；吸光系数的概念及物理意义；紫外-可见分光光度计的类型。了解：吸收带的影响因素；紫外-可见分光光度计的光学性能；光电比色法Beer-lambert定律。教学重点及难点：重点：紫外-可见分光光度法的基本原理和概念。难点：吸收带及与分子结构的关系。Beer-lambert定律。第一节紫外-可见分光光度法的基本原理和概念 一、光谱法简介 1分类 根据物质发射的电磁辐射或与辐射的相互作用建立起来的一类仪器分析方法，统称光学分析法。光学分析法根据物质与辐射能作用的性质不同，可分为光谱法和非光谱法。当物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁，记录由能级跃迁所产生的辐射能随波长的变化所得的图谱称为光谱。利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法，简称光谱法。如紫外-可见吸收光谱法和红外吸收光谱法等。利用物质受辐射线照射时，改变电磁波的传播方向、速度等物理性质所建立起来的分析方法称为非光谱法，如折射分析法、旋光分析法等。 按物质与辐射能的转换方向（能级跃迁方向），可分为吸收光谱法与发射光谱法。如紫外-可见分光光度法，红外分光光度法和原子吸收分光光度法等。常见的发射光谱法有原子发射光谱法、原子荧光光谱法、分子荧光光谱法和磷光光谱法等。按作用物质是分子或原子，可分为原子光谱法与分子光谱法。原子光谱法是以测量气态原子或离子外层电子能级跃迁所产生的原子光谱为基础的成分分析方法。分子光谱法是以测量分子中原子的振动能级（包括分子转动能级）、 分子转动能级和分子电子能级（包括振-转能级）跃迁所产生的分子光谱为基础的定性、定量和物质结构分析方法。按辐射源的波长，可分为X-射线光谱法、紫外光谱法、红外光谱法等。 2光的性质与波长范围 光是一种电磁波，又称电磁辐射，是能量在空间高速传播的一种形式。光具有波粒二象性。C是光在真空中的传播速度，所有电磁辐射在真空中的传播速度相同，C=2.9979251010cm/s 光的微粒性用每个光子具有的能量描述，光子被认为是辐射能的最小单位。光子的能量与、和的关系为：式中，E是光子的能量，单位常用焦耳（J）和电子伏特（eV）；h是普朗克（Plank）常数，其值为6.626210-34Js。由上式可知，光子具有的能量与频率成正比而波长成反比。从射线至无线电波都是电磁辐射，光是电磁辐射的一部分，它们在性质上是完全相同的，仅是波长或频率不同，即光子具有的能量不同。若把电磁辐射按波长大小顺序排列起来，称为电磁波谱。光学区域从红外线到X射线（表3-1），包括：X射线、远紫外区（100200nm）与近紫外区（200400nm）、可见区（400760nm）、近红外区（0.762.5m）、中红外区（2.550m）与远红外区（50500m）。通常所说的紫外吸收光谱指近紫外光谱，红外吸收光谱指中红外光谱。 3光谱分析仪器 研究吸收或发射的电磁辐射强度和波长关系的仪器称为分光光度计（spectrophotometer），如荧光分光光度计、紫外-可见分光光度计等。这一类仪器都有三个最基本的组成部分：辐射源，即光源；把光源辐射分解为“单色”组分的单色器；检测器和显示器。（二）紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法是根据物质分子对紫外-可见光的吸收特性所建立起来的一种 定性、定量和结构分析方法。紫外-可见光的波长范围为200760nm。该法操作简单、准确度高、重现性好，在药物分析工作中普遍应用。目前应用紫外-可见分光光度法，在定性上不仅可以鉴别不同官能团和化学结构不同 的化合物，而且可以鉴别结构相似的不同化合物；在定量上，可以进行单一组分的测定，也可以对多种混合组分不经分离而进行同时测定。此外，还可以根据吸收光谱的特性，与其他分析方法配合，用以推断有机化合物的分子结构。二、基本概念（一）跃迁类型 紫外-可见吸收光谱是讨论分子中价电子在不同的分子轨道之间跃迁的能量关系。分子中的价电子有处于轨道的电子，轨道上的电子和未参与成键而仍处于原子道中的n电子（亦称p电子）。电子围绕分子或原子运动的几率分布叫做轨道。轨道不同，电子所具有的能量亦不同。当两个原子靠近而结合成分子时，两原子的原子轨道可线性组合成两个分子轨道。其中一分子轨道具有低较能量称为成键轨道，另个分子轨道具有较高能量称为反键轨道。如图11-1所示，两个自旋方向相反的氢原子的s电子结合并以键组成氢分子，分子轨道具有成键轨道和反键轨道。同样两个原子的p轨道平行地重叠起来，组成两个分子轨道时，该分子轨道称成键轨道和反键轨道。键的电子重叠比键的电子重叠少，键能弱，跃迁所需的能量低。分子中n电子的能级，基本上保持原子状态的能级，称非键轨道。它比成键轨道所处能级高，比反键轨道能级低。由上所述，分子中不同轨道的价电子具有不同能量，处于低能级的价电子吸收一定能量后，就会跃迁到较高能级。 在紫外和可见光区范围内，有机化合物的吸收光谱主要有n、n、1跃迁 处于成键轨道上的电子吸收光能后跃迁到反键轨道。分子中键较为牢固，故跃迁需要较大的能量，吸收峰在远紫外区。如乙烷的max在135nm。饱和烃类吸收峰一般都小于150nm，在200400nm范围内没有吸收。2跃迁 处于成键轨道上的电子跃迁到反键轨道上，所需的能量小于跃迁所需的能量，孤立的跃迁一般在200nm左右，其特征是吸收光系数很大，一般10，为强吸收。例如CH2 = CH2的吸收峰在165nm，为10。具有共轭双键的化合物，相间的键与键相互形成离域键，电子容易激发，使跃迁所需能量减少，如丁二烯max在217nm（为21000）。共轭键愈长跃迁所需能量愈小。 3n跃迁 含有杂原子不饱和基团，如C = O、C = S、-N = N-等化合物，其非键轨道中孤对电子吸收能量后，向反键轨道跃迁，这种跃迁一般在近紫外区（200400nm）。吸收强度弱，小，约在10100之间。例如丙酮的max279nm，即属此种跃迁，为1030。4n跃迁 如含-OH，-NH2，-X，-S等基团化合物，其杂原子孤对电子吸收能量后向反键轨道跃迁，这种跃迁可以吸收的波长在200nm左右。二、紫外-可见光谱中一些常用术语1吸收光谱 又称吸收曲线，是以波长（nm）为横坐标，以吸收度A为纵坐标所描绘的曲线。吸收光谱的纵坐标，也可用透光率、吸收系数（E或）来表示。因此，紫外-可见吸收光谱反映分子的电子结构特征，为结构研究提供重要信息。同一物质相同浓度的吸收曲线，应能相互重合。2吸收峰 吸收曲线上吸收最大的地方，它所对应的波长称最大吸收波长(max)。3谷 峰与峰之间的部位叫谷，该处的波长称最小吸收波长(min)。4肩峰 在一个吸收峰旁边产生的一个曲折，称为肩峰。5末端吸收 在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分称为末端吸收。6生色团有机化合物分子结构中含有或n跃迁的基团，如CC、C=O、-N=N-、-NO2、-C=S等，能在紫外可见光范围内产生吸收的原子团。7助色团 助色团是指含有非键电子的杂原子饱和基团，如-OH、-NH2、-OR、-SH、-Cl、-Br、-I等。当它们与生色团或饱和烃相连时，能使该生色团或饱和烃的吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加的基团。 8红移 亦称长移，由于化合物的结构变化改变，如发生共轭作用，引入助色团以及溶剂改变等，而使吸收峰向长波方向移动。9蓝（紫）移 亦称短移，当化合物的结构改变或受溶剂影响而使吸收峰向短波方向移动。10增色效应和减色效应 由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度增加称增色效应或浓色效应。使吸收强度减弱称减色效应或淡色效应。11强带和弱带 化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数max值大于104的吸收峰称为强带；凡小于max 100的吸收峰称为弱带。（一）Beer-lambert定律Beer-lambert定律是吸收光度法的基本定律，是说明物质对单色光的吸收强弱与吸光物质的浓度和厚度关系的定律。Beer定律说明吸光度与浓度的关系；lambert定律说明吸光度与厚度间的关系。定律如下： AlgT 或 T1010式中E吸光系数；A吸光度；C溶液浓度；液层厚度；T透光率。（二）吸光系数与吸收光谱 吸光系数的物理意义是吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度。在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数是物质的特征常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力。不同物质对同一波长的单色光有不同的吸光系数，吸光系数愈大，表明该物质的吸光能力愈强，灵敏度愈高，所以吸光系数是定性和定量的依据。 1摩尔吸光系数 是指在一定波长下，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm时的吸光度，用表示。 2百分吸光系数（比吸光系数） 是指在一定波长下，溶液浓度为1（g/l00ml），厚度为1时的吸光度，用表示。 3两种吸光系数之间的关系 同一物质在同一波长时，摩尔吸光系数与百分吸光系数可以按下式进行换算。 M/10 式中，M吸光物质的摩尔质量。摩尔吸收系数一般不超过10数量级，通常在1010之间为强吸收，小于10为弱吸收，介于两者之间称中强吸收。吸收系数或不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测得吸收度换算而得到。如果溶液中同时存在两种或两种以上吸光物质时，只要共存物质不互相影响性质，即不因共存物质而改变本身的吸光系数，则总吸光度是各共存物吸收度的和，而各组分的吸 光度由各自的浓度与吸光系数所决定。吸光度的这种加合性质是计算分光光度法测定混合 组分的依据。 四、影响Beer定律的因素按照Beer定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过原点的直线，在实际测定过程中，往往容易偏离直线而引入误差，从而影响测定的准确度。1化学因素 化学因素的影响主要表现为测定组分的表观浓度与真实浓度的差异，导致偏离Beer定律。物质在溶解配成溶液的过程中可能发生离解、缔合和与溶剂间的作用等，使测定组分的表现浓度与真实浓度不相符合，导致测定误差。化学因素的影响，一般可通过控制条件，在一定程度加以控制和消除。2光学因素（1）非单色光：Beer定律的一个重要前提是单色光，事实上，即使现代高精度的分光光度计也难以获得纯净的单色光，般只能得到接近单色光的狭窄谱带，因此会影响物质的吸收系数值和吸收光谱形状，单色光的纯度由单色器决定，是分光光度计的重要性能指标。（2）杂散光：与所需波长相隔较远的光称为杂散光，可使光谱变形变值。它是由仪器制造工艺、使用和保养不善、光路系统的不洁、损伤和霉变等造成的。（3）散射光和反射光：吸光质点对入射光有散射作用，入射光在吸收池内外界面之间通过时又有反射作用。散射光和反射光，都是入射光谱带宽度内的光，对透射光强度有直接影响。（4）非平行光：通过吸收池的光，一般都不是真正的平行光，倾斜光通过吸收池的实 际光程比平行光的光程长，使实际厚度l增大而影响吸光度值。此外，温度等环境的变化会影响波长的准确度和重复性，应定期或在测定前对仪器进行校正和检定。第二节紫外-可见分光光度计 将复合光分解为单色光的仪器称为单色器或分光器，测量光强的仪器称为光度计，兼有这两种性能的仪器称为分光光度计。紫外-可见分光光度计是在紫外-可见光区可选择一定波长的光，测定吸光度的仪器。仪器的类型很多，但基本原理与结构相似。主要部件及光路简示如下：光源单色器吸收池检测器讯号处理和显示器。 （一）主要部件 1光源 分光光度计要求有能发射足够强度、稳定的、具有连续光谱且发光面积小的光源。对分子吸收测定来说，通常希望能连续改变测量波长进行扫描测定，故要求光源可以发射连续光谱。常用光源如下： （1）钨灯或卤钨灯：为可见区光源。钨灯是固体炽热发光的光源，又称白炽灯。发射光能的波长覆盖较宽（3202500nm），但紫外区很弱。通常取其波长大于350nm的光为可见区光源。卤钨灯的灯泡内含碘或溴的低压蒸气，与钨灯比，具有更高的发光强度，更长的使用寿命。在近代紫外-可见分光光度计中，作为可见区光源。 （2）氢灯或氘灯：为紫外区光源。氢灯和氘灯均是气体放电发光的光源，发射自185nm至约400nm的连续光谱。氢灯是最初的光源，目前已被氘灯替代，因为氘灯的发光强度和使用寿命比氢灯大35倍。由于玻璃吸收紫外光，故光源必须具有石英窗或用石英灯管制成。气体放电发光需先激发，同时应控制稳定的电流，所以都配有专用的电源装置。2单色器 单色器的作用是将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带。单色器由进口狭缝、准直镜、色散元件、聚焦透镜和出口狭缝组成。3吸收池 用光学玻璃制成的吸收池，只能用于可见光区。用熔融石英（氧化硅）制的吸收池，适用于紫外光区，也可用于可见光区。用作盛空白溶液的吸收池与盛试样溶液的吸收池应互相匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。在测定吸收系数或利用吸收系数进行定量测定时，还要求吸收池有准确的厚度（光程）或用同一只吸收池。吸收池两光面易损蚀，应注意保护。 4检测器 作为紫外-可见光区的辐射检测器，一般常用光电效应检测器，它是将接收到的辐射功率变成电流的转换器，如光电池和光电管。近几年来采用了光多道检测器。（1）光电池：光电池有硒光电池和硅光电池。硒光电池只能用于可见光区。硅光电池能同时适用于紫外区和可见区。光电池是种光敏半导体，当光照时就产生光电流，在一定范围内光电流大小与照射光强成正比，可直接用微电流计测量。光电池内阻小，电流不易放大，当光强度弱时，不能测量。光电池只能用于谱带宽度较大的低级仪器。（2）光电管：光电管是由一个阳极和一个光敏阴极组成的真空（或充少量惰性气体）二极管，阴极表面镀有碱金属或碱金属氧化物等光敏材料，当它被有足够能量的光照射时，能够发射出电子。当在两极间有电位差时，发射出的电子就向阳极移动而产生电流，电流大小决定于照射光的强度。光电管有很高内阻，所以产生的电流很容易放大。目前国产光电管有紫敏光电管，为铯阴极，适用于200625nm；红敏光电管为氧化铯阴极，用于6251000nm波长。（3）光电倍增管：光电倍增管的原理和光电管相似，结构上的差别是在光敏金属的阴极和阳极之间还有几个倍增极（一般是九个）。 阴极遇光发射电子，此电子被高于阴极90V的第一倍增极加速吸引，当电子打击此倍增极时，每个电子使倍增极发射出几个额外电子。然后电子再被电压高于第一倍增极90V的第二倍增极加速吸引，每个电子又使倍增极发射出多个新的电子。这个过程直重复到第九个倍增极。从第九个倍增极发射出的电子已比第倍增极发射出的电子数大大增加，然后被阳极收集，产生较强的电流，再经放大，由指示器显示或用记录器记录下来。光电倍增管检测器大大提高了仪器的灵敏度。（4）光二极管阵列检测器：近几年光学多道检测器（如光二极管阵列检测器）已经被装配到分光光度计中。光二极管阵列是在晶体硅上紧密排列一系列光二极管检测管，例如HP8452A型二极管阵列，在190820nm范围内，由316个二极管组成。当光透过晶体硅时，二极管输出的电讯号强度与光强度成正比。每一个二极管相当于一个单色仪的出口狭缝。两个二极管中心距离的波长单位称为采样间隔，因此二极管阵列分光光度计中，二极管数目愈多，分辨率愈高。HP8452A型二极管阵列中，每一个二极管，可在1/10s内，每隔2nm测定一次，并采用同时并行数据采集方法，那么HP8452A型二极管阵列可同时并行测得316个数据，在极短时间内，就可获得全光光谱。 5讯号处理和显示器 光电管输出的讯号很弱，需经过放大才能以某种方式将测量结果显示出来，讯号处理过程也会包含一些数学运算，如对数函数、浓度因素等运算乃至微分、积分等处理。显示器可有电表表示、数字显示、荧光屏显示、结果打印及曲线扫描等。显示方式，一般都有透光率与吸收度，有的还可转换成浓度、吸收系数等显示。（二）紫外-可见分光光度计紫外-可见分光光度计的光路系统一般可分为单光束、双光束、双波长和双重单色器。1单光束紫外-可见分光光度计 单光束分光光度计，用钨灯或氢灯做光源，从光源到检测器只有一束单色光。仪器的结构比较简单，对光源发光强度的要求较高。国产751和7530型仪器都是单光束分光光度计。2双光束紫外-可见分光光度计 双光束光路是被普遍采用的光路，图3-6表示其光路原理。从单色器射出的单色光，用一个旋转扇面镜（又称斩光器）将它分成两束交替断续的单色光束，分别通过空白溶液和样品溶液后，再用一同步扇面镜将两束光交替地投射于光电倍增管，使光电管产生一个交变脉冲讯号，经过比较放大后，由显示器显示出透光率、吸收度、浓度或进行波长扫描，记录吸收光谱。扇面镜以每秒几十转至几百转的速度匀速旋转，使单色光能在很短时间内交替通过空白与试样溶液，可以减免因光源强度不稳而引人的误差。测量中不需要移动吸收池，可在随意改变波长的同时记录所测量的光度值，便于描绘吸收光谱。（三）分光光度计的校正和检查由于温度变化对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面校正和检查外，还应于测定前校正波长和吸光度的准确度，并进行杂散光的检查。具体操作参见中国药典（2005年版）附录A紫外分光光度法。第三节 紫外-可见分光光度分析方法一定性分析 （一）依据：物质的吸收光谱：A，如同酸碱性或氧化性，是物质性质表征。（二）要求：1.仪器的波长准确度：仪器显示的波长数值与单色光实际波长值之间的误差，0.5nm。波长准确度的检查通过指定的物质来进行，常用的是镨钕玻璃，这部分内容放在实验课中介绍。2.样品的纯度：主成分含量98%这么知道样品纯度达到要求了呢？进行纯度检测（杂质检查）主要方法有：（1）主成分在某波长处无吸收，杂质有吸收，通过吸光度测量判断杂质的存在或多寡。用以检测有吸收的杂质。（2）主成分在某波长处有吸收：杂质无吸收或有强吸收时，可通过测量主成分在此波长的吸收系数判断杂质的存在或多寡。主成分强吸收，杂质无吸收 与纯品比较，E杂质强吸收 主成分吸收与纯品比较，E。（三）定性分析方法：1 比较最大吸收波长max及吸收系数Emax的一致性倘若两化合物的max和Emax都分别一致，可初步认为是同一物质；不一致肯定不是同一物质。2 比较吸收度比值的一致性 对于一些在吸收光谱上存在多个吸收峰的物质，可规定在几个吸收峰处吸收度或吸收系数的比值作为该物质的鉴定标准。例如：2005.7.1开始执行的最新版本2005版中国药典对维生素B12的鉴别方法是：利用维生素B12在稀HAc溶液中存在三个吸收峰，分别位于278nm、361nm、550nm，吸收度比值为： A361/A2781.70-1.88, A361/A5503.15-3.45 如果是VitB2，测量结果的比值应符合上述要求。3 比较吸收光谱的一致性 若两个化合物相同，其吸收光谱应完全一致。用紫外光谱进行定性有一定的局限性，因为紫外光谱是物质分子外层价电子吸收辐射产生的图谱，只与分子中特定的电子跃迁类型有关，换句话说，只与分子中特定官能团有关，不能表征整个分子的结构。在对物质进行鉴别时，否定结论的意义大于肯定。小结：在相同的测定条件下，相同的化合物应该具有相同的光谱。不同的光谱来自不同的化合物；相同的光谱并非肯定来自同一个化合物。故有人称之为否定性鉴别。二定量分析方法（一）单组分定量 对于单组分无干扰的体系，在定量前通常先测定该组分的吸收光谱，选定max作为测定波长，配制合适的浓度，据以下方法定量。1 对照法 与标准品的已知浓度比较 标准品AsECsL 样品 AxECxL CxAx/AsCs2 吸收系数法（绝对测量法） 在手册或文献中查出吸收系数，在同样条件下测出A，据Beer定律算出C。或者测出A由所配浓度算出Ex，按下式算出样品的百分含量： 对照法和吸收系数法均要求测量体系严格符合Beer定律。3标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液，测定A值，作A曲线或建立回归方程： 然后在同样条件下测样品溶液的，求得。该法适用于单色光纯度不高或溶液不完全符合Beer定律的情况。（二）多组分的定量 有两种或多种吸光组分共存时，可根据各组分吸收光谱相互重叠的程度分别考虑测定方法。现以两组分共存的情况为例加以说明。若两种吸光组分共存，可以有以下三种情况：第1种情况 最大吸收互不重叠，可按