6第六章 基因的概念及发展.doc

第六章 基因的概念及发展 教学基本要求： 1重点掌握基因的概念及其发展状况 2具体掌握“三位一体”、结构基因、调节基因、启动子与操纵基因；顺反子、重组子、突变子；断裂基因、外显子与内含子；重叠基因；基因的功能，一基因一酶假说的内容。 学时数： 3学时 性状的表现受基因控制，由于基因的分离与减数分裂时染色体的分离同步，因而确定染色体是基因的载体。对遗传物质DNA的研究，把遗传学从细胞水平提高到分子水平，奠定了分子遗传学基础。本章将进一步说明基因的本质是什么，基因的概念及其发展状况。第一节 经典遗传学中基因的概念 1866年，G. J孟德尔在他的豌豆杂交试验中，用大写字母代表显性性状，用小写字母代表隐性性状，提出了遗传因子的概念，但他并没有严格地区别所观察的性状和控制这些性状的遗传因子。 20世纪，孟德尔的工作被重新发现。100多年来人们对基因的认识在不断地变化。 1909年，丹麦遗传学家约翰逊（Johansson. W.L）提出基因这一名词（genepangen geneticsto generate），并提出了基因型和表现型这个术语。 1910年，美国遗传兼胚胎学家T.H.摩尔根（Morgan）在果蝇中发现白色复眼突变型，首先说明(1)基因可以发生突变；(2)证实基因位于染色体上，呈直线排列，象一串珠子一样；(3)非等位基因间可以发生交换。不过直到40年代中期为止，还没有发现过交换发生在一个基因内部的现象。因此当时提出基因是一个功能单位，也是一个突变和交换单位的“三位一体”的概念。把基因看成是不可分割的最小的遗传单位。 摩尔根的主要成就:把基因和染色体联系起来。认为基因是一种物质，是染色体上的一个特定的区段。 第二节 基因与DNA 一、基因的化学本质 1928年，Griffith首先发现了肺炎双球菌的转化现象，1944年，O.T.Avery（埃弗里）等证实肺炎双球菌的转化因子是DNA，才首次证明基因是由DNA构成。 1953年，Watson和Crick（沃森和克里克）提出了DNA的双螺旋结构模型。Crick，1957年提出“中心法则”，1961年，又提出“三联体密码”，从而阐明了DNA的结构、复制和遗传物质如何保持世代连续的问题。从化学本质上看基因是含有特定遗传信息的DNA分子片断，每个基因平均相当于1000(500-6000)对核苷酸的特定序列。估计大肠杆菌含有10007500个基因，人的基因至少有100万个（按分子量算）。 (1)基因的自体复制DNA的复制。 (2)基因决定性状DNAmRNA蛋白质。 (3)基因突变DNA核苷酸的改变。二、基因与基因组 基因组（genome）这个名词最早出现在1922年的遗传学文件中，指的是单倍体细胞中所含有的整套染色体，所以又被译作染色体组。近年来，学界更多地把genome定义为整套染色体所包含的全部基因。原核生物基因组就是原核细胞内构成染色体的一个DNA分子；真核生物的核基因组是指单倍体细胞内整套染色体所含的DNA分子。 基因组测序的结果指出，基因组中不仅包含着整套基因的编码序列，同时还包含着大量非编码序列，这些序列同样包含着遗传指令。因此，基因组应该是整套染色体所包含的DNA分子以及DNA分子所携带的全部遗传指令。 基因组研究的迅猛发展已形成了一个新的学科，即基因组学（Genomics），这是1986年出现的述语。用以表述研究生物体基因和基因组的结构组成、不稳定性及功能性的一门学科。随后又把基因组学分成结构基因组学和功能基因组学（structural genomics and furetional genomics），前者研究基因和基因的结构，各种遗传元件的序列特征，基因组作图和基因定位等；后者着重研究不同的序列结构具有的不同的功能，基因表达的调控，基因和环境（包括基因与基因之间，基因与其他DNA序列之间，基因与蛋白质之间）的相互作用等。 （一）基因组的序列复杂性 1C值悖理： 生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值。 C值悖理：生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位高低无关： (1)显花植物和两栖类动物的基因组最大，软骨鱼硬骨鱼甚至昆虫和软体动物的基因组都大于包括人类在内的哺乳动物的基因组。肺鱼的C值比人类高100倍。 (2)每类生物的最小基因组的大小基本上对应生物在进化上所处的地位的高低。 2序列复杂性 同一类生物中基因组大小相差悬殊，其主要差别在于多余（excess）DNA量的差别。 (1)重复序列 基因组不同序列的总长度称为序列复杂性（sequence complexity）。用bp来表示。序列复杂性的高低反映了序列包括的遗传信息量的多少。 (2)外显子数目的多寡，从进化的角度看，更多的外显子有助于形成更多的外显子组合，对生物在多种环境下生存是有利的。 3. DNA复性协力学 反映基因组内单一序列和重复序列的组成情况。 (1)DNA的变性和复性。 变性（denaturation）：:将双链DNA在中性盐溶液（食盐0.18mol/L、枸橼酸钠0.018mol/L）中加热（100，10分钟）。使两条多核苷酸链互补碱基对间的氢键打开，分成两条单链。 复性（renaturation）或退火（annealing）：变性后成为单链的DNA，在适当的条件下（慢慢冷却10小时以上）又回复成双链DNA。 解链温度（melting temperature，Tm）：使溶液中DNA分子的50%成为单链时，所需的温度。因为DNA分子中，氢键越多越稳定，所以GC含量多，解链温度高，DNA稳定性高。 (2)复性速率（reassociation rate）与重复顺序 DNA复性速率与基因组中碱基顺序的复杂情况和重复程度有关。两种不同复杂性的DNA分子，在总量相同的情况下，复杂性高的序列，复性速度慢，反之亦然。 复性速率可以用下列公式表示 C在时间t时单链DNA浓度，k二级反映常数 解微分方程得： 当复性反应完成一半时，所对应的Cot值定义Cot1/2 可用分光光度计，在260nm波段测量光密度的变化，此外，复性速率也受到反应液中DNA初始浓度的影响。因此，以未复性的单链百分数为纵轴，初始浓度（Co）时间（t）为横轴，作成Cot复性曲线，用来估计重复顺序和单拷贝顺序的相对比例。 E.coli DNA没有重复顺序。它的曲线可以看作是一条理想曲线，小牛DNA的复性速率初期比E.coli快得多。因为小牛基因组中少数基因有大量拷贝数。后期的复性速率大大低于E.coli，因为小牛基因组中单一顺序（unique）远比E.coli复杂。（二）基因组DNA序列的分类 1基因序列和非基因序列： (1)基因序列是指基因组里决定蛋白质（或RNA产物）的DNA序列。ATG开始，终止密码子结束。在分析基因组序列时，当一个DNA序列以ATG开始，随后是一个个密码子，但还未发现其蛋白质产物，此时这种DNA序列称为可读框 (2)非基因序列是基因组中除基因以外的所有DNA序列，主要是两个基因间的插序列。 2.编码序列和非编码序列： (1)编码序列是指编码RNA和蛋白质的DNA序列（不含内含子）。 (2)非编码序列包括内含子序列及居间序列的总和。 3单一序列和重复序列 (1)单一序列（unique）是基因组里只出现一次的DNA序列。（非基因序列中也有单一序列）， 复性时间很慢。 (2)重复序列（repetitive）是在基因组中重复出现的DNA序列。基因组内的重复序列有的是散在分布，有的是成簇存在。重复序列又可分为： A轻度重复序列：一般指个基因组内有2-10个拷贝。但有时2-3个拷贝的DNA也被视作非重复序列，如组蛋白基因和酵母tRNA基因。 B 中度重复序列：一般指10到几百拷贝的DNA序列，复性时间以分计。通常是非编码序列，平均长度300bp，往往构成序列家族，与单一序列相隔排列，分散在基因组中。可能在基因调控中起作用。 C高度重复序列：约为300bp的重复顺序，一个基因组中有几百份甚至几百万份拷贝，复性时间以秒计。既有重复几百分拷贝的基因，如rRNA基因和某些tRNA基因，更多的则是很短的非编码序列。呈头尾衔接的串联重复序列（tandem repeat） 按照基因组的分子量计算，哺乳动物的基因组中极大部分是重复序列。在非重复序列中，编码肽链的基因估计不超过百分之几。重复顺序是真核生物DNA区别于原核生物的一个重要特征。（三）重复序列家族 重复序列家族(sequence family)是指一类核苷酸序列高度相似的重复序列，包括基因和基因以外的序列。 真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因可归为一个基因家族（gene family）。但重复序列主要是基因以外的DNA序列，根据其在基因组中的组织形式，可分为串联重复序列和散在重复序列。多数来源于反转录转座子。 1卫星DNA（satellite DNA） DNA片段在氯化铯密度梯度离心中，按其大小在离心管内，形成不同的条带，根据荧光强度分析，可以看到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带，称卫星DNA，这种DNA的GC含量较少，密度低。卫星DNA按其浮力密度的大小可以分成、四类（1.687， 1.693， 1.700g/cm3），都是由各种不同的重复序列家族组成，通常是串联重复序列. 卫星DNA按其重复单元的多少可分为两类: (1)小卫星DNA(minisatellite DNA)，由几百个核苷酸对的单元重复组成。（又：由11-60个bp的串联重复序列组成）。 (2)微卫星DNA（microsatellite DNA），由2-20bp重复成百上千次组成。（又：1-5bp） DNA指纹（DNA fingerprints）：利用微卫星DNA的某些位置上的这种串联，成簇的重复单位数目不同，在串联重复序列两侧用限制性内切酶酶切后，就会产生重复单位数目不等的片段，具有丰富的多态性。这种多态性亦称VNTR序列（Variable number of tandem repeat可变串联重复序列）。以 VNTRs中的特异序列为探针进行 Southern杂交，杂交带谱具有高度的特异性。 倒位重复序列：这是两个序列的互补拷贝在同条DNA链上的反向排列，如 GCACTTCGAAGTGC CGTGAAGCTTCACG 2散在重复序列 以散在方式分布于基因组内，一般都是中度重复序列。分为 (1)短分散重复序列（short inter spersed nuclear elements）SINEs长度在500bp以下。人类基因组中，重复拷贝数达10万以上。 人类基因组中所有SINE之间的平均距离约为2.2Kb。如Alu序列家族，人类基因组中约有50万-70万拷贝，平均每隔4 Kb就有一个Alu。一个典型的Alu序列长282bp，有一个限制性内切酶Alu的识别序列ACCT。 (2)长散在重复序列（long interspersed nuclear elements， LINEs）重复序列单元长度1000bp。 第三节 基因内部的精细结构 过去一直认为基因是一个功能单位，同时也是一个突变单位，交换单位，即所谓三位一体的概念，认为:交换只能发生在基因之间，而不能在它们之中；突变只能从一个基因变成另一个基因，其内部没有改变变化的更小单位。 20世纪40年代，在果蝇研究中发现，根据表型标准被认为是两个等位基因的突变型却可以发生重组而得到野生型，这种紧密连锁的功能性等位基因，但不是结构性的等位基因称为拟等位基因。 精密的微生物遗传分析证明，基因并不是最小的不可分割的单位。一、顺反子、突变子与重组子 1重组测验 1955年，美国的S.Benzer（本泽）用大肠杆菌T4噬菌体作为材料，研究快速溶菌突变型r的基因精细结构，发现在一个基因内部的许多位点可以发生突变，并可以在这些位点之间发生交换，从而说明一个基因是一个功能单位，但并不是一个突变单位和交换单位，因此，一个基因可以包括许多突变单位和许多重组单位。 2互补测验 Benzer分析了r区域大约2000个（有些不能重组）突变型，知道这些突变分布在308个（能重组）位点上。那么，这308个位点是属于一个基因还是几个基因？为了划分这种功能单位界线，必须进行互补测验。 Benzer用不同的r突变型成对组合去感染大肠杆菌K（）菌株。他发现:r突变型可分成rA和rB两个互补群。所有rA突变型的突变位点都在r区的一头，是一个独立的功能单位；所有rB突变型的突变位点都在r区的另一头，凡是属于rA互补群的突变不能互补，同理属于B互补群的突变也不能互补，只有rA的突变和rB的突变可以互补。 3顺反子、突变子与重组子的概念 （1）顺反子（cistron）：Benzer把在反式构型中不能互补的各个突变型在染色体上所占的一个区域称为一个顺反子。 顺反测验结果表明，顺反子是一个必须保存完整才具胡正常生理功能的遗传物质最小单位。实际上它是基因的同义词。是一个功能水平上的基因。r区内，有两个基因，但可在许多位点发生突变和重组。 （2）突变子（muton）：是指一个顺反子内部能发生突变的最小单位。一个突变子可以小到只有一对碱基。 （3）重组子（recon）是基因内不能由重组分开的遗传单位，即基因内出现重组的最小区间。重组子的单位可以小到核苷酸对。 总结：每个顺反子在染色体（DNA）上的区域称为基因座（locas），而每个基因座上有许多突变位点（site），它是一个顺反子内部能发生突变的最小结构单位，称为突变子；一个突变可以小到一对碱基，我们知道，DNA中每一核苷酸对的改变都可引起肽链中氨基酸的改变，从而影响顺反子的功能，但它本身没有独立的功能，它们之间可以重组，而重组的最小结构单位称为重组子，重组子可以小到邻近碱基对间的重组。由此可见，顺反子既具有功能上的完整性，又具有结构上的可分割性。二、断裂基因 传统的观点认为每个结构基因是一段连续的DNA顺序，到1977年法国的Chambom等和美国的Berget等首次在猴类病毒SV40和腺病毒中发现基因内部以及基因与基因之间存在有间隔顺序（spacer sequence），从而导致隔裂基因的概念。 1、断裂基因：基因的编码顺序由若干非编码区域（间隔序列）隔开，使阅读框不连续，这种基因称为隔裂基因（split gene，interrupted gene隔裂基因）。 通读框（open reading frame），在一条DNA链上，从起始密码开始到终止密码为止的连续核苷酸密码序列。 一个基因由几个互不相邻的段落组成，它们被长达数百乃至数千个核苷酸对的间隔序列所隔开。 在真核类中，几乎所有基因内部都含有不转译的部分。在转录为初级RNA时（或后），这一序列被切除。 图4-8 卵清蛋白基因及其与cDNA的杂交图 目前，已从珠蛋白、卵清蛋白、免疫球蛋白基因、tRNA、rRNA基因中，均发现具有这种间隔顺序的断裂基因。 2、外显子（exon或extron）：基因的转译部分。DNA序列中将被转录为mRNA、tRNA、rRNA的那些序列。 3、内含子（intron）：不转译的部分。在成熟的mRNA、tRNA、rRNA上未反应出来的DNA区段，即被切除的间隔序列。 Gilbert提出基因是被表达的外显子镶嵌在沉默的内含子中的一种嵌合体。而内含子的核苷酸数量可比外显子多5-10倍。 4、RNA剪接 5、断裂基因的意义 (1)有利于储存较多的信息：不同的剪接方式对应不同的mRNA，从而对应不同的多肽。 (2)有利于变异和进化 (3)增加重组机会 (4)可能是基因调控装置：内含子本身、转录水平和转录后水平 第四节 基因空间位置关系 一、重叠基因 传统的观点认为每个基因是由一些密码子组成。而这些密码子是有序地排列在DNA链上，基因在染色体上是一个接一个地排列（线状排列）并不重叠。 1977年F.Sanger（桑格）分析了噬菌体X174 DNA全序后，发现它只有5375个核苷酸，共组成了九个基因，而这九种基因共编码了2000种氨基酸，按三联体密码子的原则应有6000个核苷酸，而实际数与理论数却相差625个核苷酸。Sanger实验室的Barrell等在其核苷酸全序测定以后，发现X174基因组中有些读码是重读的，即一种蛋白质的编码顺序内可以存在着另一种蛋白质的遗传信息。这就是重叠基因（overlapping genes）。 图4-9。X174DNA中D基因和E基因的开始和结尾。说明:核苷酸顺序号从D基因的起始密码算起，E基因从179号开始。其阅读相（reading phase）跟D基因岔开。E基因包含在D内（60%）。D基因与J基因首尾重叠。D的终止点A，即J的开始处。 进一步研究发现基因有各种重叠方式: 1、大基因之内包含小基因 如 ，由于密码读框不同而得到不同的蛋白质。 2、前后基因产首尾重叠 前后重叠1-2个核苷酸。如D与J，A与C 3、三个基因的三重重叠 shaw（1978）G4噬菌体。图示。 4、反向重叠 DNA的双链都转录，方向不同，形成不同的蛋白质，但这种转录相互干扰，一强一弱。 5、重叠操纵子 结构基因与调控序列的重叠，以及调控序列之间的重叠。如大肠杆菌中的frd和ampC两个操纵子。 重叠基因的意义:(1)节约空间；(2)对基因的表达调控起作用。如转译的偶联（translational coupling）；(3)一个碱基的变化将会引起几个基因的变化，从这个基因上说，重叠基因越多，那么适应性越小，在进化中趋于保守。 二、操纵子 大肠杆菌生长在无乳糖的培养基上时，每个细胞中含分解乳糖的酶，如-半乳糖苷酶的分子还不到5个，一旦加入乳糖后2-3分钟，每个细胞中的-半乳糖苷酶的含量可增加上千倍，每个细胞约含该酶分子5000个，而这时若将乳糖去掉，那么，2-3分钟后，细胞中的-半乳糖苷酶的含量又恢复到初始水平。可见，乳糖能诱导相应的酶大量合成，因此，这种底物称为诱导物（inducer），相应的酶称为诱导酶（inducible enzyme）。 1961年，法国分子生物学家F.Jacob（杰柯伯）和J.Monod（莫诺）通过不同的大肠杆菌乳糖代谢突变体来研究基因的作用，从而提出操纵子学说（operon theory），1965年获诺贝尔奖。 一个操纵子（operon）除了同一个转录单位的结构基因(structure gene)外，还有直接参加其转录调控的DNA序列。lacO ， lacP，即乳糖操纵子由5个紧密连锁，但功能不同的DNA区段组成。 图3-4 大肠杆菌乳糖操纵子的基因调控系统。(1)结构基因z ：- 半乳糖苷酶基因 酶催化 乳糖半乳糖+葡萄糖。 (2)结构基因y ：- 半乳糖苷透性酶基因 膜结合蛋白，使乳糖进入细胞。 (3)结构基因a ：编码- 半乳糖转乙酰基酶，该酶可将一个乙酰基从乙酰辅酶A转移至- 半 乳糖上，其在乳糖利用上的生物学意义尚不清楚。 (4)启动基因P ：是RNA多聚酶与DNA结合的启始部位。(initiator) (5)操纵基因O ：是阻遏蛋白结合的部位，它的功能象一个开关。(operator) 调节基因i 产生阻遏蛋白，调节结构基因的活性，与(1)-(5)不相邻。(regulatory gene) 操纵基因与由它操纵的几个结构基因连锁在一起，几个结构基因由一个启动子转录成为一个mRNA分子，然后翻译成几种蛋白质，这样的结构成为一个操纵子(operon)。调节基因通过产生阻遏物来调节操纵基因，进而控制结构基因的功能。这样，这些基因构成了一整套基因功能的调节控制系统。 调节基因和操纵基因都有控制结构基因的作用，它们的差别是：(1)调节基因可以调节不同染色体上的结构基因，而操纵基因则只是操纵同一染色体上的结构基因。(2)后者无基因产物。 操纵子模型进一步丰富了基因概念。三、超基因 超基因(super gene)是指作用于一种性状或作用于一系列相关性状的几个紧密连锁的基因。 人类基因组的超基因如血红蛋白基因簇。图示。 一个基因经过重复(duplication)和变异而产生的一组基因，组成一个基因家族(gene family)，基因家族中的各个成员可以聚集成簇也可以分散在不同的染色体上。 一个共同的祖先基因通过各种各样的变异，产生了结构大致相同但功能却不尽相同的一大批基因，分属于不同的基因家族，但可以总称为一个基因超家族(supfamily). 功能相同或相关的许多基因聚集成簇，就形成一个基因簇。在成簇的基因家族中通过染色体重排而分散到其他位置上的成员，被称为孤独基因(orphan gene).四、染色体外基因 在细胞质遗传中介绍五、可动基因或转座元件 细胞中能改变自身在染色体上位置的一段DNA顺序，叫做转座遗传因子（transposable genetic element），简称转座元件或转座基因（transposable element，TE），可动基因(mobile gene)。 转座(transposition)和易位(translocation)是两个不同的概念。转座是在转座酶的作用下，转座因子或是直接从原来位置切离下来，然后插入染色体的新位置；或是染色体上的DNA序列转录成RNA，RAN反转录成cDNA，插入染色体的新位置，原位置仍保留；转座因子本身既包含了基因，如编码转座酶的基因，又包含了不编码蛋白质的DNA序列。 1、玉米的(As-Ds)控制系统 1932年，美国玉米遗传学家B.McClintock发现玉米籽粒色斑不稳定遗传现象，于1951年，第一次提出转座因子的概念。因为玉米中发现的转座因子除了具有转座的特性外，还具有调节其他基因的作用，又称之为控制因子（Controlling elements）。 其中一个称之为解离因子（DS，dissociation），DS插入色素基因C的近旁或中间时，玉米籽粒不能形成色素，当DS离开C基因后抑制作用被解除。 Ds的解离又受另一控制因子激活因子（Ac，activator）的影响。Ac可位于基因组中任何其他地方。Ac丢失，Ds趋向稳定。Ac的作用是自主的，而Ds行为却依赖于Ac，这是因为Ds和Ac在很大程度上表现出核苷酸序列的同源，特别是两端的序列是相同的。只是Ds基因不同程度的缺失是间序列，如丢失产生转座所需要有关酶转位酶。 2、原核生物中的转座因子 1967年，在大肠杆菌半乳糖操纵子的突变型研究中第一次在细菌中发现了可转移座位的插入序列。 (1)插入序列（insertion sequences，IS） dgal-和dgal+的区别：(a)不能被碱基替换所回复，但又可回复突变；(b)密度梯度离心证明dgal-比重大于dgal+；(c)dgal-和dgal+分子杂交可见杂合双链上出现一个多余的DNA环。 IS1的特点：(a)768核苷酸；(b)本身没有表型效应，只携带转座酶基因；(c)如F因子和大肠杆菌的染色体上有一些相同的插入序列；(d)具有某些共同的结构特征：两端的核苷酸顺序完全相同或相近，但方向相反，称为反向重复序列（inverted repeal(IS)sequences）。含有IS的质粒变性，单链复性。出现颈环结构（哑铃状结构）；(e)IS插入“靶”DNA后，在IS两端出现一小段顺向重复的靶DNA序列 5-11 hp (2)转座子（transposon，Tn） 是一类较大的转座因子，除了含有与转座有关的基因外，还带有抗药基因以及其它基因。如Tn3含有3个基因：(a)编码-内酰胺酶的氨苄青霉素抗性基因（ampk），转座酶基因（tnpA）和编一种阻遏物的调节基因（tnpk）；(b)分子大小200025000np；(c)两端为IR；(d)转座子则赋于宿主细菌一定的表型。 (3)转座噬菌体 1963发现。 Mu（Mutator phage） 3、转座机制 以细菌的转座子为例 (1)切开 转座酶有两种功能(1)识别受体靶点。从5端切开，产生两个粘性末端。(2)识别自身两边的IR。3切开。 (2)接合 成为共合体 共价链齐头相连，形成两个缺口。 (3)复制 DNA多聚酶补上缺口，连接酶连接，形成顺向重复序列。 (4)重组 在特定位点重组。共合体分离成两部分。 转座子是以它的一个复制品转移到另一位置，而在原来位置上仍然保留原有的转座子。 4、转座因子的遗传学效应 (1)引起插入突变。 (2)插入位置上出现新基因。 (3)切离，发生回复突变，或染色体畸变。 (4)造成同源序列整合。 (5)增加新的变异，有利于进化。 第五节 基因的功能与类别 一、基因的功能 1、one gene-one enzyme hypothesis G.W.Beadle（1954）的实验：用X射线得到不同的精氨酸突变型菌株，在培养基上分别添加鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸，其生长情况如表4-3所示， 表4-3 链孢霉精氨酸依赖型的不同菌株对添加的氨基酸的反应 添加的氨基酸 菌株 鸟氨酸 瓜氨酸 精氨酸 I 生长 II 生长 生长 III 生长 生长 生长 比德尔因此提出一个基因一种酶的假说，该假说对基因功能的实质奠定了基础。确认(1)基因的功能是通过酶控制的生化反应，而达到控制生物的性状，从而也说明(2)生物的性状往往是一系列基因所控