(电大复习)生物药物分析(吉林大学自考)

1 药物分析学 第一章 绪 论 一、 学习要点 1、掌握生物药物的定义 2、掌握生物药物检验工作的基本程序与方法 3、熟悉生物药物的分类 4、熟悉药品质量标准以及药典有关规定 5、了解生物药物分析的任务 二、名词解释 1、生物药物：是利用生物体、生物组织或器官等成分，综合应用多门学科的如生物学、生物化学等的原理和方法，特别是采用现代生物技术，进行加工、制造而形成的天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物，用于预防、治疗以及诊断疾病。 2、生化药物：从动物、植物及微生物等生物体分离纯化 得到的生化活性物质，或者用化学合成、微生物合成及现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物、大分子的结构修饰物等，以及来自生物体或构成生物体的一些基本成分。 3、生物技术药物：用现代生物技术研制的药物。 4、生物制品：一般指的是用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、原虫、动物毒素、人或动物的血液或组织等直接加工制成，或用现代生物技术方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂，包括各种疫苗、抗血清（免疫血清）、抗毒素、类毒素、免疫制剂（如胸腺肽、免疫核酸等 ）、诊断试剂等。 5、药典：记载着各种药品的标准，是一个国家关于药品标准的法典，是国家管理药品生产与质量的依据，一般由国家卫生执行部门主持编纂、颁布实施。药典和其他法令一样具有约束力。 6、标准物质（标准品）：需要在进行测定的同时，用一已知效价的制品作为对照来校正试验结果，这种对照品就是标准品。在国际上将标准品分为两类：国际标准品和国际生物参考试剂。 国内分为，国家标准品和国家参考品。 7、药物分析学科：一门研究与发展药物质量控制的方法学科，是整个药学科学领域中一个重要组成部分。药物分析的基本任务是检验药品质 量，保障人们用药安全、合理、有效。 三、应掌握的知识点 1、生物药物主要包括生化药物、生物技术药物和生物制品等。 2、在生物药物的生产过程中要对各个环节严加控制，还要有严格的质量管理规范，以确保生物药物的均一性、有效性、和稳定性。 3、中国生物制品规程是我国生物制品的国家标准和技术法规。生物制品规程包括生产规程和检定规程两方面的内容。 4、药品质量标准是药品现代化生产和质量管理的重要组成部分，是药品生产、供应、使用和监督管理部门共同遵循的法定技术依据，也是药品生产和临床用药水平的重要标志。 5、对药品质 量控制的全过程起指导作用的法令性文件有 GLP、 GMP、 GSP、GCP 四个科学管理规范。 6、中国药典的内容：凡例，正文，附录，索引。 7、生物药物检验的基本程序一般为取样、鉴别、检查、含量（效价）测定、写出检验报告等。 8、国际上将标准品分为两类：国际标准品和国际生物参考试剂。国内将标准物质也分为两类：国家标准品和国家参考品。 9、药物分析的基本任务是检验药品质量，保障人们用药安全、合理、有效。 10、生物制品一般指是用微生物（包括细菌，噬菌体，立克次氏体，病毒等），微生物代谢产物，原虫，动物毒素，人或动物 的血液或组织等直接加工制成，或用现代生物技术方法制成，作为预防，治疗。诊断特定传染病或其他相关疾病的免疫制剂，包括各种疫苗，抗血清（免疫血清），抗毒素，类毒素，免疫制剂（如胸腺肽，免疫核酸等，诊断试剂等。如，乙肝疫苗，卡介苗，白喉类毒素，狂犬病免疫球蛋白，白蛋白，结核菌素等。 11、生物药物的用途：（ 1）作为治疗药物（ 2）作为预防药物（ 3）作为诊断药物 四、重点与难点 1、生物药物检验的基本程序： （ 1）药物的取样 （ 2）药物的鉴别试验 （ 3）药物的杂质检查 （ 4）药物的安全性检查 （ 5）药物的含 量（效价）测定 （ 6）检验报告的书写 2、生物药物的性质： （ 1）在化学构成上，生物药物十分接近于体内的正常生理物质，进入体内后也更易为机体所吸收利用和参与人体的正常代谢与调节。 （ 2）在药理学上，生物药物具有更高的生化机制合理性和特异治疗的有效性。 （ 3）在治疗上，生物药物具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小、疗效可靠及营养价值高等特点。 （ 4）生物药物的有效成分在生物材料中浓度都很低，杂志的含量相对比较高。 （ 5）生物药物常常是一些生物大分子，它们不仅分子量大，组成、结构复杂，而且具有 严格的空间构象，以维持其稳定的生理功能。 （ 6）生物药物对热、酸、碱、重金属及 pH 变化均比较敏感，各种理化因素的变化易对生物活性产生影响。 3、生物药物分析与检验的特点： （ 1）需要进行相对分子质量的测定 （ 2）需检查生物活性 （ 3）需做安全性检查 （ 4）需做效价测定 （ 5）要用生化法确证结构 第二章 酶分析法 一、学习要点 1、掌握酶活力测定的原理、方法和药物分析实例 2、掌握酶法分析的原理、检测方法和药物分析实例 3、熟悉酶活力测定中应注意的主要问题 4、了解酶及酶分析法在生物药物分析 中的应用 二、名词 1、酶活力： 指在一定条件下，酶所催化的反应速度。 2、酶反应速度：用单位时间内反应底物的减少或产物的增加来表示 3、酶的活性单位（国际单位为 U）：是指在 25下，以最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的 pH 值诸条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。酶的比活性即定位一毫克酶的活性单位。 4、取样测定法：是在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别，选用适当的检测方法进行定量分析，求得单 位时间内酶促反应变化量的方法。 5、酶偶联测定法：用过量、高度专一的“偶联工具酶”使被测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。 6、酶法分析：是一种以酶为分析工具或试剂的分析方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至是酶的抑制剂。包括终点测定法和反应速度法。 7、酶活力测定：以酶作为分析对象，也就是根据需要对样品进行酶含量或活力的测定。 三、应掌握的知识点 1、酶分析法包括酶活力测定法和酶法分析。 2、酶的反应速度可以用单位时间内反应底物的减少或产物的增加来表示，酶的反应速度愈快 所表示的酶活力愈高。 3、测定酶活力，可用物理法、化学法或酶分析法等方法。 4、酶的比活性定为一毫克酶的活性单位。 5、酶促反应的基本要求是：所有待测定的酶分子都应该能够正常发挥它的作用。确定 酶促反应 反应条件时应考虑以下因素：底物， pH 值，温度，辅助因子，空白和对照。 6、一般选用底物的浓度 S=100Km，因为在这种情况下反应速度可达最大速度的 99%。 7、一般而言，温度变化 1，酶反应速度可能相差 5%左右。因此，试剂酶促反应中，温度变动应控制在 +0.1以内。酶反应温度通常选用 25、 30、 37。 8、酶活力的测定方法按取样和检测的方式有取样测定法和连续测定法。 9、取样测定法常用的检测方法有紫外 -可见分光光度计法，荧光分析法等。 10、 酶分析法中 连续测定法常用的检测方法有紫外 -可见分光光度计法，荧光分析法、旋光度法、酶偶联测定法以及电化学测定法和放射化学法。 11、荧光分析法的原理是如果酶反应的底物与产物之一具有荧光，那么荧光变化的速度可代表酶反应速度。 12、酶的反应速度可以用单位时间内底物的减少或者产物的增加来表示，但以分析产物为好，因为产物从无到有，只要测定方法灵敏，准确度可以很高。 13、 酶反应进程曲线：在反应最初阶段，底物或产物的变化量一般随反应时间而线性增加，反应速度恒定；但是随着反应时间延长，曲线会逐渐弯曲下来，斜率改变，反应速度下降。 14、真正能代表酶催化活性的是反应初始阶段的速度，即反应初速度。 15、终点测定发一般采用：分光光度法，测压量气法，滴定法，同位素跟踪测定法。 四、重点与难点 1、酶活力测定与酶法分析的异同 （ 1）酶法分析是以酶作为分析工具或分析试剂，用以测定样品中一般化学方法难于检测的物质，这些物质可以是酶的底物，也可以是酶的抑制剂或是酶的辅助因子； （ 2）酶活 力测定法是以酶作为分析对象，也就是根据需要对样品进行酶含量或活力的测定。 这两类酶分析从原理到操作等基本相同，但是酶法分析中，被检测化合物应该是反应的限制因素，而在酶活力测定中，使用的底物应该过量。 2、酶促反应的条件 选择反应条件的基本要求是：所有待测定的酶分子都应该能够正常发挥它的作用。 确定反应条件时应考虑以下因素：（ 1）底物：一般选用底物的浓度 S=100Km，因为在这种情况下反应速度可达最大速度的 99%；（ 2） pH 值：氢离子浓度能对酶反应差生多种影响，酶反应通常借助缓冲系统来控制 pH 值；（ 3）温 度：酶反应对温度十分敏感，温度变化 1，酶反应速度可能相差 5%左右。因此，试剂酶促反应中，温度变动应控制在 +0.1以内。酶反应温度通常选用 25、 30、 37。（ 4）辅助因子：有些酶需要金属离子，有些酶则需要相应的辅助物质。（ 5）空白和对照：空白是指杂质反应和自发反应引起的变化量，空白可不加酶或不加底物，或二者都加但是酶需要预先经过失效处理。对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果。 3、按取样及检测方法可将酶活力的测定方法分为取样测定法和连续测定法： （ 1）取样测定法：该方法中停止酶反应通常采用添加酶的 变性剂的方法，常用的检测方法有紫外 -可见分光光度计法，荧光分析法等。 （ 2）连续测定法：紫外 -可见分光光度计法，是根据产物和底物在某一波长或波段上，有明显特征吸收差别而建立起来的连续监测方法；荧光分析法，原理是如果酶反应的底物与产物之一具有荧光，那么荧光变化的速度可代表酶反应速度；旋光度法，某些酶反应过程常伴随着旋光变化，在没有其他更好的方法可用时，可考虑用旋光度发；酶偶联测定法，加入的偶联工具酶应该高度纯净、专一而且 2 过量。 4、酶法分析中终点测定法原理、条件、种类 （ 1）原理：先借助酶反应使被测物质定 量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量，因此成为终点测定法。 （ 2）条件： 酶的底物特异性（专一性）； 反应的平衡，酶反应若平衡时分偏向进行方向，则可方便地用终点测定法检测； 反应液中的酶量，要使酶反应在短时间内完成，只有使用对底物亲和性很大的酶即 Km 要小，酶用量必须大才能达到此点。 反应产物抑制，如果产物对反应本身有抑制作用，则会妨碍反应进行，在这种情况下可采取将该产物出去或者和再生系统偶联等办法解决。 （ 3）种类： 单酶反应定量法：测定底物减少，产物增加和辅酶变化量。 指示酶反应偶联的定量法：以脱氢酶为指示剂和以脱氢酶以外的酶作指示剂。 5、 D-葡萄糖的定量测定 2222 OHDOOHD G O D 葡萄糖醛酸葡萄糖DOHDHOH 2222 2过氧化物酶在葡萄糖氧化酶（ GOD）反应中，葡萄糖被氧化、同时形成 H2O2，如果再和过氧化物酶反应偶联，可使还原型色素（ DH2）转变为氧化型色素 D，氧化型色素 D在 270 420nm 处有吸收值，因此可以借助分光光度法测定，以此进行葡萄糖的定量分析。 6、尿酸的定量测定 222222 OHCOOOH 尿囊素尿酸 尿酸酶 利用尿酸在 293nm 或 297nm 处具有的特征吸收性质，通过尿酸酶反应，根据它的吸收度的减少就可计算出尿酸量。 7、胃蛋白酶的活力测定 在实验条件下，胃蛋白酶催化血红蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸，利用水解产物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有紫外吸收，用紫外分光光度法直接测定，并计算出本品的酶活力。每 1g 检品中含蛋白酶活力不得少于3800 单位。 （ 1）对照品溶液的制备：精密称取经 105干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液（取 1mol/L 盐酸溶液 65mL， 加水至 1000mL）制成每 1mL 含 0.5mg 的溶液。 （ 2）供试品溶液的制备：取本品适量，精密称定，用上述盐酸溶液制成每 1mL约含 0.2 0.4 单位的溶液。 （ 3）测定法：取试管支，其中支各精密加入对照品溶液 1mL，另 3 支各精密加入供试品溶液 1mL，置（ 37 0.5）水浴中，保温 5min，精密加入预热至（ 37 0.5）的血红蛋白试液 5mL，摇匀，并精密计时，在（ 37 0.5）水浴中反应 10min，立即精密加入 5%三氯醋酸溶液 5mL，摇匀，虑过，取续滤液备用。另取试管 2 支，各精密加入血红蛋白试液 5mL，置（ 37 0.5）水浴中保温 10min，再精密加入 5%三氯醋酸溶液 5mL，其中 1 支加供试品溶液 1mL，另 1 支加上述盐酸溶液 1mL，摇匀，虑过，取续滤液，分别作为供试品和对照品 的空白对照，采用紫外 -可见分光光度法，在 275nm的波长处测定吸收度，算出平均值 A 和SA,按下式计算： 1 8 1 . 1 910 n1g WA WAS S含蛋白酶活力（单位）每式中， WS 为 1mL 对照品溶液中含酪氨酸的量， g； W 为供试品取样量， g； n为供试品的稀释倍数； SA ， A 分别为对照品溶液及供试品溶液吸收度的平均值； 181.19 为酪氨酸的相对分子质量； 10 为反应时间， min。 在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生产 1 mol 酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力单位。 8、酶法测定肝素 酶法测定肝素的原理是根据核糖核酸酶水解核糖核苷时，在 300nm 波长处吸收度下降的速率被肝素抑制的特点（即肝素能专一地抑制核糖核酸酶），用已知肝素对其抑制程度进行定量测 定，制得标准曲线，从而测得未知量的肝素含量。 此法简单快捷，一次能测定多个样品，特别适用于大批量样品的测定工作，可以作为生产过程中的质量监控。 具体方法为：取配成 5U/mL 的标准肝素溶液，按梯度吸取不同量分别加入试管中，每管加重蒸水至总体积为 2mL，再加核糖核酸溶液 核糖核酸 0.2g 溶于 100mL乙酸缓冲液（ 0.2mol/L， pH5.0） 1mL，测定前逐管加入湖塘核酸酶溶液（ 5mg 核糖核酸酶溶于 100mL 重蒸水） 1mL，混匀，立即测定。对照组以重蒸水代替肝素溶液同样进行。待测样品组以待测样品液代替标准肝素 溶液进行测定。 取加有标准肝素溶液和试剂的各管，测定其在 300nm 波长处吸收值每下降 0.04单位所需时间（ t1），以及未含肝素组（对照）所需时间（ t），以 t1/ t为 Y 轴，肝素含 量为 X 轴，制得标准曲线，进而得到回归方程（标准曲线使用的检测范围在 4U 活性以下）。根据待测样品在相同条件下测得的所需时间（ t 测 ），可求出肝素的量。 第三章 免疫分析法 一、学习要点 1、掌握抗体、抗原的概念特性及应用 2、掌握免疫分析法的概念与方法 3、掌握放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫分析法、克隆酶给予体免疫分析法、免疫扩散法的基本原理、操作过程和应用 4、熟悉免疫分析技术的实际操作步骤和在实践中的应用 5、熟 悉半抗原和载体的选择原则 二、名词 1、免疫分析法：以特异性抗原 -抗体反应为基础的分析方法 2、抗原：指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。 3、全抗原：同时具有免疫原性和抗原特异性的物质。 4、半抗原：只能与特异抗体作用但不能引起机体免疫应答的简单物质。 5、抗体：是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。 6、免疫原：是人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反应的物质。 7、单克隆抗体：建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的，针对某一特殊抗 原决定簇的抗体。 8、效价：又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需要的量 9、 免疫扩散法：根据抗原和抗体在琼脂介质中扩散的结果，对其性质进行分析的一种方法。这里琼脂介质是指琼脂凝胶 ，绝大多数的抗原抗体的相对分子量都在 20 万以下，能够在琼脂凝胶中自由扩散，其扩散运动服从气体自由扩散定律，在扩散过程中，凝胶中形成扩散物的浓度梯度，在抗原 /抗体最适比例处，形成肉眼可见的免疫沉淀；由于不同抗原物质扩散系数不同，扩散速度就不同，这样就可以达到分离的目的。 10、克隆酶给予体免疫分析（ CEDIA）：是利用 重组 DNA 技术，合成B-galactosidase 的两个独立存在时无酶活性的蛋白质片段，但两者结合时则显示出酶活性的原理。 三、应掌握的知识点 1、通常物质的抗原性指免疫原性和抗原特异性。 2、大多药物分子，相对分子量较小，通常被认为是半抗原。 3、半抗原的选择：半抗原结构中最好含有芳香结构，选择半抗原时应考虑抗原-抗体反应的微环境，合理地利用分子类似物间的交叉反应。 4、合成抗原通常以蛋白质为载体。 5、合成抗原的测定：定性测定方法包括光谱分析和热分析；定量测定方法包括相对含量测定和绝对含量测定。 6、抗 体具有高度特异性，在免疫分析中 IgG 是最常用的抗体。 7、免疫分析中，常用到的两类抗体为抗血清和单克隆抗体。抗血清由抗原直接免疫动物得到，而单克隆抗体需将预先免疫过的小鼠细胞与体外培养的骨髓瘤细胞经细胞融合技术产生杂交瘤细胞，再筛选而得。 8、抗血清的制备分为以下几个步骤：免疫原的制备，动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清分析鉴定。 9、常用的免疫原有水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。 10、免疫分析中用于制备抗血清的动物通常为家兔和羊，而家兔是首选的免疫动物。 11、通常利用合成抗原制备兔抗半抗原免疫血清 时常采用常量免疫法。 12、效价测定方法有双向免疫扩散法、单向免疫扩散法、对流电泳法、被动血凝法和 ELISA 法。 13、对提纯单克隆抗体的含量测定方法通常采用紫外吸收法。 14、均相免疫分析方法是基于竞争结合原理来测定体液中药物浓度。 15、氯胺 T 法式目前最成熟采用最多的放射性标记法，主要用于对蛋白质、多肽激素和含碘氨基酸的标记。 16、分离结合或游离的放射性物质常用以下几种方法：柱层析法和电泳法、吸附法、沉淀法、抗抗体法、微孔滤膜法、固相法。 17、用紫外光照射蛋白质，可诱导蛋白质产生荧光，色氨酸是产生荧 光的主要成分。 18、经典的酶联免疫分析法实验步骤可概括为包被、洗涤、与特异性抗体反应、与酶联抗抗体反应、显色和测定。 19、 ELISA 实验技术主要包括直接法和夹心法两种。 20、 ELISA 使用的微孔板通常为聚苯乙烯板，它和蛋白类抗原有较强的相互作用。 21、半抗原通常以半抗原 -载体结合物的形式包被。 22、免疫扩散包括单向简单扩散、简单辐射扩散、单向双扩散和两向双扩散。 23、 四、重点与难点 1、 免疫分析法的应用主要集中在以下几个方面：（ 1）在实验药物动力学和临床药物学中测定生物利用度和药物代谢动力学参 数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄的情况；（ 2）在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物的血药浓度进行检测； (3)在药物生产中从发酵液或细胞培养液中快速测定有效成分的含量，以实现对生产过程的在线监测（ 4）对药品中是否存在特定的数量有害杂质进行评价。 2、 免疫分析法的定义及种类 免疫分析法是以特异性抗原 -抗体反应为基础的分析方法。 基于竞争结合原理的均相免疫分析法有以下几种：（ 1）放射免疫分析法 RIA，是最早建 立的经典免疫分析法，反射免疫分析中常用的标记物采用最多的是 125I标记物和氚标记物。分离结合或游离的放射性物质进而进行测定是放射免疫分析的关键。（ 2）荧光免疫分析法 FIA：包括荧光淬灭法，荧光增强法，荧光偏振法，时间分辨荧光免疫分析法等。（ 3）克隆酶给予体免疫分析法：是利用重组 DNA 技术，合成 B-galactosidase 的两个独立存在时无酶活性的蛋白质片段，但两者结合时则显示出酶活性的原理。 液 -固免疫分析体系：利用各种理化方法，实现抗原或抗体与不溶性介质如聚苯乙烯微孔板、各类凝胶载体、膜的连接，并利用高 灵敏的检测手段来测定抗原 -抗体反应，进而实现对抗体或抗原的分析。主要有酶联免疫分析法。 3 3、抗体的效价及测定方法 与一定的抗原能发生反应的抗体的最大稀释度。 常用的测定方法包括免疫扩散法、间接血凝法和 ELISA。 4、酶联免疫分析法的基本原理和方法步骤 基本原理： ELISA 是一种固相免疫测定技术，它先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结 合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度（ A）值的发小进行定性或定量分析的方法。 （ 1）双抗体夹心法：首先，将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；其次，加受检标本，形成固相抗原复合物；再次，加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合；最后，加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 （ 2）间接法：首先，将特异性抗原与固相载体连接形成固相抗原；其次，加稀释的受检血清；再次，加酶标抗抗体；最后加底物显色。 （ 3）竞争法：首先，用已知特异性抗体宝贝固相载体；其次测 定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体结合，对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体 直 接结合；最后加底物显色。 5、蛇毒的酶联免疫测定法 蛇毒是从各种毒蛇蛇头毒腺 (相当于唾液腺 )中分泌的一类物质，其成分比较复杂，蛋白质约占干重的 90%，约含 20 30 种蛋白质组分，其中包括 5 15 种酶、3 12 种非酶活性蛋白质或多肽，例如神经毒素、膜活性肽、舒缓激肽增强肽、肌肉毒素、出血因子等。利用酶联免疫测定法测定蛇毒的方法步骤如下。 （ 1）方法：双抗夹体心型 ELISA，聚苯乙烯微量反应板法。 （ 2）原 理：固相的抗蛇毒抗体和蛇毒、酶标记的抗蛇毒抗体依次反应形成结合物，最后使底物显色。 （ 3）材料： 蛇毒精制品 兔抗蛇毒血清 碱性磷酸酯酶 戊二醛 0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH9.6)缓冲液 0.01mol/LPBS-0.05%吐温 20（ pH7.4）（ PBS-吐温） 底物缓冲液（ pH9.8）： 0.05mol/L；碳酸盐缓冲液内含 10-3mol/LMgCl2、1mg/mL4-硝基酚磷酸盐 待测血清标本、正常人血清 （ 4）操作步骤 按戊二醛一 步法制得碱性磷酸酯酶和兔抗蛇毒抗血清的结合物 兔抗蛇毒抗血清用 0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（ pH9.6）以 1:300 稀释，在聚苯乙烯微量反应 板的每个孔内加入 0.3mL。 37 孵育 5h 后。用 PBS-吐温洗涤三次，每次 3min。 蛇毒精制品用健康人血清以 1 1000ng/mL 浓度分别稀释后，再用 PBS-吐温以 1:200 稀释；待测的血清同样用 PBS-吐温以 1： 200 稀释。 已包被的孔内加入上述样品或血清标本 0.3mL， 4 过夜后同上洗涤。 酶结合物用 PBS-吐温以 1:100 稀释，每孔内加入 0.3mL， 37 孵育 3h 后，同上洗涤。 每孔内加入底物溶液 0.3mL，室温下静止 30min 后用 3mol/LNaOH 溶液 50L终止反应。 判定结果可用目测法或分 光光度计测定吸光度值（ A400nm）。 根据蛇毒 精制品的测定结果可绘制成剂量 -反应曲线，对待测血清中的蛇毒加以定量。 6、载体的选择原则 （ 1）实验设计中应考虑载体对检测系统的影响。在免疫过程中，合成抗原免疫动物，不仅可以产生抗半抗原抗体，也会产生大量的抗载体蛋白抗体。因此选择载体蛋白是应考虑载体对检测系统的影响。这通常包括两方面 ：其一为选择的载体应和检验体系不发生交叉反应。 其二，为在进行酶联免疫吸附测定（ ELISA）等免疫分析时，常将包被合成 抗原用作竞争抗原或作为阳性对照，此时用于包被的合成抗原的载体应和用于免疫动物产生抗体的合成抗原的载体蛋白不同。（ 2）免疫过程中应考虑载体相应的影响。在人工抗原诱导的免疫反应中，抗体的特异性依赖于半抗原分子结构中的免疫决定区，但整个载体蛋白大分子对于抗体反应的性质和量也有影响。常见的载体有牛血清百蛋白（），卵清蛋白（），破伤风类毒素（）和钥孔蛋白（ KLH）。 第四章 电泳分析法 一、学习要点 1、掌握电泳分析的概念及基本原理 2、掌握各类重要电泳分析技术的基本操作 3、掌握影响电泳分离的因素 4、了解电泳的分类和发展 二、名词 1、电泳法：是指带电荷的供试品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。 2、电渗现象：液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动 。 3、免疫电泳技术：将琼脂电泳与免疫扩散结合起来，也就是说利用电场作用下带电蛋白质在琼脂凝胶中具有不同的迁移率，以及相同的蛋白质具有完整的抗原性的特点，用于分析抗原或抗体性质的一种技术。 三、应掌握的知识点 1、电泳法可分为三类： 自由界面电泳、区带电泳、高效毛细管电泳。其中区带电泳是目前应用最广泛的电泳技术。 2、影响迁移率的主要因素有：带电颗粒的性质；电场强度；缓冲液的性质；电渗作用；溶液的温度和黏度；分子筛效应。 3、电泳按支持介质不同可分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖凝胶电泳；，聚丙烯酰胺凝胶电泳， SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4、毛细管电泳 CE 也称高效毛细管电泳 HPCE，是近十几年迅速发展起来的一种新的分离方法。 5、免疫电泳包括简单免疫电泳、对流免疫电泳、“火箭”免疫电泳和双向免疫电泳。 四、重点与难点 1、电泳分析 法的基本原理 不同带电颗粒，因其所带电荷性质和多少以及形状和大小等差异，使其在同一电场强度、相同的支持介质和缓冲液的条件下，各自的泳动速度不同，从而使各种带电颗粒如蛋白质、核酸等生物大分子得以分离。 2、影响迁移率的因素 带电颗粒的性质包括大小、形状及所带电荷量；缓冲液的性质包括 pH 值和离子强度；电场强度，保持稳定的电场强度是电泳成败的重要条件；溶液的温度和黏度；电渗作用；分子筛效应。 3、电泳分析法的分类 （ 1）按支持介质不同可分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖凝胶电泳；，聚丙烯酰胺凝胶电泳， SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 （ 2）按用途不同可分为：分析电泳，制备电泳，定量免疫电泳，连续制备电泳。 4、 HPCE 较 HPLC 的优点 （ 1） HPCE 较 HPLC 分析时间短； （ 2） HPCE 较 HPLC 柱效高很多； （ 3） HPCE 较 HPLC 流动相用量少很多； （ 4） HPCE 可做微量制备。 二者都是高效的分离技术，也都有多种分离模式，仪器操作均可自动化。但是 HPCE分离速度更快，使用样品量更少（ pg 量级）效率更高，可分离的范围更广（从离子到大分子化合物），但是维持费用则更低。因此具有更明显的优势。但是， HPCE目前只能实现微量制备，不能取代 HPLC。 5、琼脂糖凝胶电泳法对肝素钠的鉴别 肝素钠是从猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐，属黏多糖类物质，具有延长血凝时间的作用。利用电泳法可以对肝素钠进行鉴别。 （ 1）溶液的制备及制胶 醋酸 -锂盐缓冲液（ pH3.0）。取冰醋酸 50mL，加水 800mL 混匀后，用氢氧化锂调节 pH 值至 3.0，再加水至 1000mL。 苯甲胺蓝溶液。取苯甲胺蓝 0.1g，加水 100mL 使溶解。 制胶。取琼脂糖约 0.2g，加水 10mL，置水浴锅中加热使溶胀完全，加温热的醋酸 -锂盐缓冲液（ pH3.0） 10mL，混匀，趁热将胶液涂布与大小适宜（ 2.5cm 7.5cm或 4cm 9cm）的玻板上，厚度约 3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。 （ 2）供试品和对照品溶液的制备：取本品与肝素标准品，分别加水制成每 1mL中含 2.5mg 的溶液即得 （ 3）电泳：在电泳槽内加入醋酸 -锂盐缓冲液（ pH3.0），将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样 1mL，立即接通电源，在电压梯度约 30V/cm、电流强度 1 2mA/cm 的条件下，电泳约 20min，立即关闭电源。取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。 （ 4）结果判断：供试品和标准品所显斑点的迁移距离之比应为 0.9 1.1。 第五章 高效液相色谱法 一、学习要点 1、掌握 HPLC 的基本理论 2、掌握 HPLC 的常用定性方法和定量方法及其优缺点 3、熟悉 HPLC 的基本组成部件和工作流程 4、熟悉 HPLC 的固定相、流动相及其选择 5、了解 HPLC 的发展过程和 HPLC 的优点及适用范围 6、了解 HPLC 的分类 7、了解 HPLC 的应用 二、名词 1、液相色谱法：以液体为流动相的色谱法。 2、经典液相色谱法：用常压输送流动相的方法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。 3、高效液相色谱法（ HPLC）：是在经典液相色谱法的基础上发展起来的，用高压输送流动相，又称高压液 相色谱法或者高速液相色谱法。 4、色谱图：色谱仪以电信号强度对时间做图所绘制的曲线。 5、峰高：色谱峰顶到基线的垂直距离。 6、峰宽：峰两侧拐点处所做的两条切线与基线的两个交点间的距离。 7、峰面积：峰和峰底所包围的面积。峰面积或峰高是定量分析的主要依据。 8、保留时间：样品通过色谱柱所需的时间，即从进样开始到柱后出现组分浓度极大值所需的时间。 9、保留体积：从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值时流出溶剂的总体积。 10、分离度：表示相邻两峰的分离程度。 三、应掌握的知识点 1、 HPLC 具有分离效能高、选 择性高、检测灵敏度高、分析速度快等优点。 2、高效液相色谱仪由高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器、数据处理系统组成。 4 3、根据分离机制不同， HPLC 可分为化学键合色谱法、液 -固吸附色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、空间排阻色谱法，液 -液分配色谱，亲和色谱等。 4、 HPLC 利用纯物质对照法来进行定性。常用的定量方法有内标法、外标法、主要成分自身对照法、面积归一化法等。 5、 HPLC 广泛应用于生物药物的鉴别、检查和含量测定。 6、色谱柱参数主要有：相平衡参数，柱选择参数和柱效参数（包括理论塔板数和理论塔板 高） 7、要获得较好的色谱分离有两个途径，一是最大峰间的距离要大，二是色谱峰要窄。 8、通常用理论塔板数来定量地表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。如果峰形对称并符合高斯分布，理论塔板数可用峰宽和保留时间来表示： 22 16 wtRtRn 为标准偏差； w 为峰宽。 也可用半高峰宽（ Wh/2）和保留时间的关系来表示： 22/54.5 hWtRn9、理论塔板数与柱长成正比，柱子越长， n 值越高。用 n 表示理论塔板数时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为 1m 时的理 论塔板数。 10、分离度越长，色谱峰分离越好，但并非要求其值很大，二是争取在最短的时间内获得最佳分离效果。如果得到的是高斯曲线，分离度 R=1.5（ 6 的峰间距离）对于定量分析就足够了。 11、高效液相色谱法可以用于定性分析药物，比如用于药物的鉴别和检查，也可以用于定量分析药物。 12、高效液相建立实验方法的时候，首先需要考虑，样品的性质；色谱分离的类型；溶剂的选择；检测器的选择。 13、溶剂的处理主要有溶剂的纯化，溶剂的脱气，缓冲液的防腐。 14、 HPLC 操作过程中经常会遇到问题，比如无柱后流出液或无柱压， 可能由于溶剂的管路有渗漏；如果出现平头峰，可能会是柱子过载或检测器过载；如果柱压过高，有可能样品或溶剂组分有残留；检测器具有低背景噪音，可能参比池脏了或有其外来物等等。 四、重点与难点 1、 HPLC 的定义及特点 HPLC 是一种以高压输出的液体为流动相的色谱技术。具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快等优点。 2、常用的化学键合相的种类及在液相色谱法中的应用 常用的化学键合相有十八烷基硅烷，辛烷基，氨基及氰基等。 化学键合相广泛应用于正相与反相色谱法，离子交换色谱法，手性色谱法及亲和色谱法等。 3、 HPLC 对流动相的要求 流动相一般采用分析纯试剂，必要时进一步纯化；避免使用引起柱效损失或保留特性变化的溶剂；对试样要有适宜的溶解度；溶剂的粘度要小；易与检测器相匹配。 4、正相色谱与反相色谱的定义及适用分离的组分 最早， 液 -液色谱有正相和反相之分 ，目前已被正相键合色谱法和反相键合色谱法所代替， 如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。 所以正相色谱一般可用于分离极性化合物 ， 反相色谱一般可用于分离非极性或弱极性化合物。 5、高效液相色谱仪的组成及主 要部件 组成主要为高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器、数据处理系统。 主要部件包括储液罐，搅拌超声脱气器，梯度淋洗装置，高压输液泵，流动相流量显示，柱前压力表，输液泵泵头，过滤器，阻尼器，六通进样阀，保护柱，色谱柱，检测器，记录仪，回收废液罐。 6、利用反相高效液相色谱法测定生长抑素的含量 （ 1）色谱条件：色谱柱规格为 Ominispher C18 柱（ 250mm 46mm， 5m，美国Varian 公司）。流动相 A 液： 含 0.1%三氟乙酸的水溶液；流动相 B 液：含 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；采用梯度洗脱，洗脱程序：流动相 A 与流动相 B 比列在 2min维持 100:0，然后， 20min 内由 100:0 调至 65:35，流速 1mL/min；检测波长 215nm，注温为室温；进样量 20L。理论塔板数按生长抑素峰计算大于 20000，样品色谱图如图（ a）所示。 （ 2）样品含量测定：精密称取合成的生长抑素原料约为 10mg，置 50mL 量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，得贮备液。再吸取 4mL 置 10mL 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，取 20L 进样测定，记录峰面积。 第六章 生物检定法 一、学习要点 1、掌握生物检定法的概念、特点 2、掌握效价检定的基本概念，生物检定的常用方法 3、掌握抗生素的微生物检定法 4、熟悉对比检定的原理与计算 5、了解实验设计和统计分析 6、了解生物检定的应用范围 二、名词 1、生物检定法：利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 2、质反应：当一定剂量的药物注入动物体内后，观察某一反应或反映的某一特定程度出现与否，只有出现与不出现两种情况，故不能用量来表示个体的反 应程度，只能用一组动物中出现正或负反应的百分率来表示，这类反应成为质反应。 3、量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变。 4、琼脂扩散法：也称管碟法，是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 5、抗生素微生物检定法：利用抗生素在低微浓度下选择性地抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成分效力的方法。 三、应掌握的知识点 1、生物检定的应用范围主要用 于药物的效价测定、微量生理活性物质的测定、中药质量的控制、某些有害杂质的限度检查等。 2、生物反应基本上可分为质反应和量反应，质反应是特殊的量反应。 3、生物检定统计方法包括质反应的直接测定法和量反应的平行线测定法。 4、微生物检定法测定抗生素效价一般可分为稀释法、浊度法和琼脂扩散法三类。其中浊度发和琼脂扩散法被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。我国一直将管碟法作为微生物检定的经典方法。 5、生物反应是生物检定的基础，被测物特有的生物学作用都可作为生物法分析的基础。 6、由于抗生素多为结构复杂的多组分物质 ，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法。 7、生物制品的效力，从实验室检定来讲，一是指制品中的有效成分的含量水平，二是指制品在机体中建立自动免疫或被动免疫后所引起的抗感染作用的能力。 四、重点与难点 1、生物检定法的定义与常用的生物检定方法 生物检定法是利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 常用的生物检定法有：胰岛素生物检定法，肝素生物检定法，抗生素的微生物检定法。 2、微生物检定法测定抗生素常用方法及原理 方法 主要有稀释法、比浊法和扩散法，其中扩散法中的管碟法应用最为广泛。 （ 1）稀释法是将等量的试验菌菌液加入到含有不同浓度抗生素的液体培养基中，观察液体培养基中有无细菌生长，多得的结果是一种范围而不是绝对值。 （ 2）比浊法是将一定量的抗生素加入至培养基中，混匀后，短期培养，培养基变浑浊，通过测定其透光率可知道细菌的生长情况。 （ 3）管碟法式利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。 3、管碟法测定抗生素效价的影响因素 实验菌种， 培养基，双碟的制备，双碟的培养温度和时间，抗生素污染，标准品。 4、生物检定法在生物药物分析中的应用 生物检定主要用于药物的效价测定、微量生理活性物质的测定、中药质量的控制、某些有害杂质的限度检查等。 5、生物制品的效力检定方法可分为： （ 1） 动物保护力试验 （ 2）活菌数和活病毒滴度测定 （ 3）类毒素和抗毒素的单位测定 （ 4）血清学试验 （ 5）其他相关效力的检定与评价 6、生物检定效价测定中剂量与反应的关系 生物检定是利用药物不同剂量引起生物体反应程度的变化进行药物效价测定的，要计算效价，首先要 研究剂量与反应之间的关系。 在生物鉴定中，剂量与反应中一般都是曲线关系，可通过各种坐标转换的方法，使剂量与反应间呈直线关系。最便于处理和应用。 生物反应基本上可分为以下两种类型，即 质反应和量反应。 （ 1）质反应，当一定剂量的药物注入动物体内后，观察某一反应或反应的某一特定程度出现与否，例如死或不死，惊厥或不惊厥，只有出现与不出现两种情况，故不能用量来表示个体的反应程度，只能用一组动物中出现正（或负）反应的百分率来表示，如死亡率、惊厥率，这类反应称质反应。 在质反应中，将动物分组，分别给以不同剂量，通过调节剂 量，是最大剂量组接近但不全部产生阳性反应，最小剂量组接近但不全部产生阴性反应，则各组阳性反应动物的百分率将随剂量的增加而递升，剂量与反应率之间的关系是一条长尾的“肩斜”形曲线，如将剂量转换为对数，反应率转换为适当的函数后则呈直线关系，常见的转换方法有概率单位 等。 （ 2）量反应，药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者称为量反应。例如血压的变化值，血糖浓度，组织器官重量的增减，抑菌圈直径的大小等。时反应虽有某些特殊性，但基本上仍属于量反应，它是观察某一反应或反应的某种程度出现所需的时间， 例如血液的凝结时间、动物生存的时间等。 在一定剂量范围内，很多量反应中反应与剂量的关系是一种先锐后钝 的类似对数曲线，此时将剂量转换成对数剂量，即可成一条直线，属于这一类的有抗生素效价测定中药浓度与抑菌圈的直径、催产素与大鼠离体子宫的收缩高度等。 但大部分时反应中，剂量与反应呈现先锐的曲线，将剂量转换为对数，反应值亦可以转换为对数，则二者呈直线关系，属于这一类型的有肝素浓度与体外血凝时间，凝血因子 VIII 与体外促凝时间。 通常利用对数进行坐标转换已能解决大部分曲线的直线化问题，其他方法还有将 5 反应值转为平方根， 立方根或倒数等。 第七章 生物药物的杂质与安全性检查 一、学习要点 1、掌握一般杂质检查的原理、方法、计算，特殊杂质检查方法的类型、特点以及药物安全性检查的项目和方法。 2、掌握生物安全性检查的主要方法 3、熟悉杂质检查方法以及一般杂质检查和特殊杂质检查方法的区别 4、了解杂质的概念、来源、分类及限量的制定 二、名词 1、杂质：任何影响药物纯度的物质均称为杂质。 2、一般杂质：指在自然界分布较广泛，在多种药物的生产和贮藏过程中容易引入的杂质，如酸、碱、水分、氯化物、硫酸盐、砷盐、重金属等。 3、特殊杂质 ：指在个别药物的生产和贮藏过程中引入的杂质。 4、信号杂质：指非毒性杂质 ,由于具有和供试品类似的结构或官能团，而在检测时也具有同样的信号，干扰供试品的检测的物质 。 5、杂质限量：指药物中所含杂质的最大允许量。 6、重金属：指在实验条件下能与显色剂作用显色的金属杂质，一般包括银、铅、汞、铜、镉、铋、砷、锑、锡、锌、钴、镍等。 7、灼炽残渣：药物（多为有机药物）经高温加热分解或挥发后残留下的不挥发物质（多数为金属氧化物、氯化物、碳酸盐、磷酸盐、硅酸盐）。 8、干燥失重：指药物在规定条件下，经干燥后，所减少的重量 ，主要指水分，也包括其他挥发性物质如乙醇等。 9、热原：是指在药品中能够引起人及动物的体温异常升高的致热性物质，目前一般认为热原反应主要是由于细菌内毒素引起的。 三、应掌握的知识点 1、杂质检查是控制药物杂质，确保安全、有效用药，保证药品质量的重要措施。 2、药物中的杂质是药物纯度的一个重要方面，所以药物的杂质检查又叫纯度检查。 3、杂质会由下列各种情况引入药品中： （ 1）在合成药物生产过程中，未反应完全的原料、反应的中间体和副产物，在精制时未能完全除去，就会成为产品中的杂质。 （ 2）从动植物原料中提取 分离药物时，由于原料中常常含有与药物结构、性质相近的物质，在提取过程中，分离不完全，便可能引入产品中。如由哺乳动物睾丸中提取得到的玻璃酸梅，是一种能水解玻璃粘多糖的酶，若提取不周，易把睾丸中的另一组分酪氨酸引入。 （ 3）在药物的生产过程中，还常加入试剂、溶剂等，如不能完全除去，也会使产品中存在有关杂质。如使用酸性或碱性试