分子克隆技术步骤.doc

分子克隆技术步骤在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。1.方法：(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；从mRNA反转录产生cDNA。(2)载体DNA的选择：质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。噬菌体DNA：常用的噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；同聚寡核苷酸末端连接。人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为11。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。(5)克隆的选择：直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。2.重要意义与应用：分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。在基因治疗方面。通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。分子克隆主要步骤分子克隆可以分为以下几个步骤： （1）带有目的基因的DNA片段的获得（2）重组DNA分子的构建 （3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选（4）特定重组克隆的鉴别 1.带有目的基因的DNA片段的获得：可以用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反转录酶合成互补DNA，即cDNA，也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。 2.重组DNA分子的构建：重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是载体DNA。用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA。它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA分子。在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。 3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选：重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落，亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。 4.特定重组克隆的鉴别：由于重组克隆往往是较多的，而在某 一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。 此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定，基因在DNA片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。 分离制备待克隆的DNA片段将靶DNA片段与载体在体外进行连接重组DNA分子转入宿主细胞筛选、鉴定阳性重组子重组子的扩增。分子克隆方法DNA片段的制备常用以下方法获得DNA片段：用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；从mRNA反转录产生cDNA。载体DNA的选择质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。噬菌体DNA：常用的噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。DNA片段与载体连接DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；同聚寡核苷酸末端连接。人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为11。引入寄主细胞常用两种方法：转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。克隆的选择直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。 分子克隆技术(质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化)分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。（一）质粒DNA的制备（二）DNA插入片段的制备 1、逆转录反应 2、DNA聚合酶链式反应（PCR）（三）连接反应（四）重组质粒的转化关键词：分子克隆质粒DNADNA插入片段连接反应重组质粒转化克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入到不同的子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。（一）质粒DNA的制备质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环DNA分子，它能赋予细菌（宿主细胞）某些特定的遗传表型。质粒并非细菌生长所必需，但由于其编码一些对宿主细菌有利的酶类，从而使宿主细菌具有抵抗不利自身生长的因素如抗药性等的能力。目前发现的质粒主要分为F质粒（性质粒），R质粒（抗药性质粒），E.coli质粒（大肠杆菌肠毒素质粒）。根据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可将质粒分为严紧型（低拷贝，复制1-2次）和松弛型（高拷贝，复制10-200次）。由于质粒的不相容性细菌经分裂后就只留下了拷贝数较高的一种质粒，例如R1和R2两种抗药性质粒同属于一类，由于不相容性使它们不能共存于同一细菌中，但不同类群的质粒可以在一个细菌中共存。质粒存在于细菌中，所以制备质粒DNA时，首先应将含有质粒的细菌在含有相应抗生素的液体培养基中生长至对数期,使质粒在细菌中得到扩增。通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA变性，然后再加中和液，使溶液PH值恢复到中性，这样质粒DNA又可以复性至天然双链构象状态，而细菌染色体DNA不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体DNA与变性蛋白质缠绕在一起，易被离心去处，而质粒DNA仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最后经离心即可得到质粒DNA。（二）DNA插入片段的制备DNA插入片段是指我们所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得DNA插入片段是分子克隆过程中的第一步。目前有几种方法，如限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法、人工合成法等，下面以逆转录-DNA聚合酶链式反应为例介绍获得外源基因DNA插入片段的方法。1、逆转录反应所谓逆转录，就是以mRNA为模板合成一条互补DNA链(即cDNA)的过程，在逆转录反应中所用的是逆转录酶，即以RNA为模板的DNA聚合酶，它也具有5-3DNA聚合酶活性，在合成新的核苷酸链时也需要引物。由于真核基因组DNA由内含子和外显子组成，内含子不编码蛋白质，因此体外扩增基因组DNA会给某些研究造成困难，以mRNA为模板的基因扩增可避免这种问题的发生，因此从某种意义上来说，逆转录反应更具实用性。制备cDNA时，首先要从细胞中提取mRNA，以mRNA为模板，在mRNA的poly(A)尾上结合12-18个寡聚（dT）片段作为合成的起始引物，在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链。然后用RNA酶消化DNA-RNA杂交链中的RNA，剩下的单链DNA的3端往往有自发回折形成的发夹结构，正好可以作为合成第二条DNA链的引物。第二条DNA链的合成可以用DNA聚合酶，也可以用逆转录酶。双链DNA合成后，用S1核酸酶切去发夹结构，即获得平端的双链cDNA。2、DNA聚合酶链式反应（PCR）PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核酸存在下，DNA聚合酶催化的一种体外酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应由三个步骤组成：1、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA解离成单链DNA；2、退火：当温度突然降低时，使含量远远多于模板DNA的引物与模板DNA在局部形成杂交双链；3、延伸：在4种dNTP底物和Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶由5-3方向合成新的与模板DNA互补的DNA链。以上反应为一个循环，通常进行25-30个循环，由此介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制，数量可达2107-8拷贝。PCR引物决定PCR的特异性，引物的设计就显得尤为重要。下面以已知DNA序列设计引物为例介绍设计引物应考虑的几个方面：1、GC比值：众所周知,碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR中退火温度的重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半即可。2、长度：通常15-20bp即可。由于目的不同，有时引物长些，但太短会影响引物的特异性。3、方向：设计出的引物永远是5-3方向,所以正向引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向引物则与这股模板DNA序列相互补。4、酶切位点：如果想克隆所放大的DNA片段，通常在引物的5端设计适当的限制性酶切位点，使进一步的克隆工作更容易。一对引物可用一种或两种酶切位点，这取决于设计者，两种不同的酶切位点使克隆具有方向性。5、启始和终止密码：如果想表达所放大的DNA片段，所用的克隆载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在引物的酶切位点之后，特异性DNA序列之前。6、其它：如果表达的融合蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。（三）连接反应将载体质粒DNA和外源基因DNA在DNA连接酶的作用下，双链DNA片段相邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸二酯键，形成重组质粒，这是分子克隆技术的核心步骤。在连接反应进行之前，质粒和外源基因DNA分别用同样的限制性内切酶消化，使它们成为含有同样粘性末端或钝端的线性DNA，这是连接成功的先决条件。下面介绍连接反应的程序。1、模板DNA的准备在进行DNA重组以前，通常要先将DNA分子用限制性内切酶消化，使两种DNA分子的末端产生相同的粘性末端或平齐末端。通常按下列比例进行：1. 双蒸溜水 适量2. 10 酶缓冲液 1/10容量3. DNA 多少l4. 限制性内切酶 1/10容量（每微克DNA用1-10单位）总容量（根据DNA分子量来确定，通常10-100l）。混合后37温育30-120min。2、连接反应在DNA连接酶的作用下，将外源基因DNA片段和线性质粒DNA连接起来构成重组质粒的过程。通常按下列比例进行：1. 双蒸溜水 适量2. 10 酶缓冲液 1/10容量3. 质粒DNA 适量4. DNA插入片段 适量5. 限制性内切酶 1/10容量(每微克DNA用1-10单位)总容量（根据DNA分子量来确定，通常10-20l）。混合后置14-16水浴6-12小时。注意通常DNA插入片段的量是载体DNA的3倍，这需根据DNA分子量计算，而不取决于浓度。（四）重组质粒的转化DNA插入片段和质粒DNA在体外连接形成重组质粒后，需要被导入到细胞内才能进行扩增和表达。接受重组DNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。受体细胞分为原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞）。原核细胞即可作为基因复制扩增的场所，也可作为基因表达的场所；真核细胞一般用作基因表达系统。一般将重组DNA分子导