第七组液相色谱-核磁共振联用技术在药物分析中的应用.doc

药物分析课程论文综述液相色谱-核磁共振联用技术在药物分析中的应用药学2011级（2）班刘星明（1103501226） 张 婷（1103501227）林敏燕（1103501228） 刘培能（1103501229） 指导教师：周漩2014 年 6 月 摘 要液相色谱（LC）是分离各种未知混合物的高效能的物理分离技术，核磁共（NMR）是结构分析的强有力手段。液相色谱核磁共振（LC-NMR ）联用技术能达到快速分离、结构鉴定并且定量分析的目的，该技术在药物分析中的应用非常广泛，具有广阔的应用前景。本文主要对LC-NMR 联用技术在化学药物分析（包括未知杂质的结构分析、混合物中已知成分的定量分析）、中药 物分析（包括异构体分析、新化合物的结构鉴定），天然产物，代谢产物分析中的应用进行详细的综述。关键词 ：生物碱；中药材；含量测定 前言液相色谱- 核磁共振谱联用技术(LC - NMR)的尝试始于20 世纪70 年代末, 但直到90 年代中后期才发展得较为成熟并且得到推广使用。而随后从确定菊科植物Zaluzaniagrayana 的粗提物中倍半萜内酯成分的结构开始 , LC - NMR 在天然产物分析中逐渐显示出高效、快速、微量的优势。现由于LC-NMR一体化联用技术能一次性完成从样品的分离纯化到峰的检测、结构测定和定量分析,提供大量分子结构和混合物组成的信息,提高了研究效率和灵活性,因此引起人们的广泛关注,现已成为目前用于天然产物研究的一种新型分析手段,。随着对药品分析要求的提高，LC-NMR 又与质谱（MS）等技术联合，发展成了LC-SPE-NMR 联用、LC-MS-NMR联用， 实现优势互补, 在混合物成分的结构鉴定中具有不可替代的作用。LC-NMR 联用技术包括连续流动（on-line）和停止流动（off-line）两种模式。LC-NMR 在混合物尤其是未知物的结构鉴定中的应用已经越来越广泛。在药物分析的领域：有机小分子药物的鉴别、定量，生物大分子类生化药物的结构研究；对药物的体外评价与研究、对体内药物的监控与研究等也有广泛使用。本文主要阐述本文综述LC-NMR联用技术在分析化学药、中药药物分析，天然产物分析，代谢产物分析的应用。1 化学药物分析1.1 未知杂质的结构分析 LC-NMR 联用技术在分析未知杂质时，无需纯品做对照，不产生破坏性，具有专属性强、快速、准确、精密度好等优点。为混合物的即时分离、鉴定提供了一种简便、快速、准确的方法。检测药物中的杂质是这一技术应用领域之一。杨春1等用高效液相色谱-核磁共振(HPLC-CNM)联用技术中的连续流动和停止流动两种模式对萘哌地尔中杂质进行检测。所有的高效液相色谱采用Varian公司的Prostar-230高效液相色谱仪, 分析柱为Inertsil ODS-3柱(4.6I.D.250mm, 5m)，萘哌地尔样品用乙腈溶解, 浓度为5g/ L。连续流动的进样量为20L, 停止流动的进样量为50L。检测器为VarianProstar-330二极管阵列检测器, 紫外检测波长为210nm。HPLC分离条件为乙腈磷酸缓冲溶液=6535( pH7.88.0)。所有的图谱均在INOVA-500核磁共振仪上完成。HPLC-NMR采用反相60L流动探头。WET脉冲序列抑制乙腈和重水的溶剂峰, 同时抑制乙腈的卫星峰。在没有纯品的对照下，根据1HNMR,1H-1HCOSY谱完成了主要杂质1-萘环-丙三醇结构鉴定。联用技术同时能得到化合物的UV、NMR、MS信息，为化合物分析提供了全面的信息。孙煌2等应用HPLC-MS/MS/核磁共振(1H-NMR/13C-NMR/HMBC) 技术，对多索茶碱及其未知杂质进行结构分析,首次发现并确定多索茶碱未知杂质的结构。采用Inertsil ODS-3（4.6m,2.1mm150mm,迪马公司），流动相为乙腈-水( 82:18) ，进样量为10l，通过ESI 与LC相联采用全扫描一级质谱及全扫描二级质谱同时测定。通过多索茶碱对照品及茶碱对照品确定未知杂质，通过其产物离子推测，该未知杂质为多索茶碱的同分异构体1,3-二甲基-9-（1,3-二氧环戊基-2-基）甲基-3,9-二氢-1H-嘌呤-2，6-二酮。采用联用技术已经证明是一种有效的研究工具，特别是在药物研发、生产过程中。1.2 混合物的定量分析 核磁共振波谱用于定量分析的基础是不同化学环境上的原子核共振吸收峰面积只与它的原子数有关，因此，不需要引进任何校正因子，不需要为每一种被测物选择相应的标准品。LC-NMR 广泛应用于有机化合物的定性分析，它在化合物纯度定值含量测定中也具有很多优势，现已经广泛应用于药物合成及生产中。美国药典规定使用定量 NMR法，以苯甲酸苄酯为内标物，进行亚硝酸戊酯的定量分析。此外，LC-NMR 法还应用于多种药物的副产物或降解产物含量测定，具有快速、简便、专属性高的特点；与其他方法相比，有不破坏样品，信号峰不会发生重叠等优势3。柳娜4等采用HPLC-PDA和核磁共振(NMR)法定性定量分析。流动相为氘代甲醇水-乙酸（40|：60：0.5），以1.0 mL/min的体积流量在Pure 2811C18 色谱柱（250 mm8mm，2040m）中分离样品，柱温室温，检测波长254 nm。Bruker DRX-500 NMR 仪。杜仲中环烯醚萜类化合物京尼平甙酸(GPA)和京尼平甙(GPS)的质量分数分别为w( GPA) = 94.69%和w( GPS) =93.27%，该方法能够满足一般的混合物的定量分析，且成本低。Lienau 5等用LC-NMR 联用技术同时分离并定量分析了生育酚这一大类物质。HP1100型HPLC系统，流动相为氘代甲醇甲醇（5 95），以0.4 mL/min的体积流量在Bischoff C30 色谱柱（250 mm4.6 mm，3 m）中分离样品，柱温22 ，检测波长280 nm。Bruker AMX 600 NMR 仪。Bruker Esquire-LC 离子阱LC/MS(n )系统，装有大气压化学电离（APCI）源和离子阱。生育酚中各单一成分的量为： -生育酚醋酸酯96.7% 、 -生育酚 1.8%、 -生育酚0.7%、-生育酚0.1%、-生育酚0.1%，检测对样品需求量少，对微量样品也适用。2 中药药物分析 中药和天然药物成分十分复杂，而有效物质通常多为数种，因此单纯采用一种色谱分离模式通常不能够全面地解决问题，往往需要将多种分离模式相结合。采用LC-NMR可以很好的表征化学成分特征和相对含量的差异。LC-NMR技术在色谱峰分离不完全情况下仍可提供详尽信息，使得同分异构体无需分离提取，便可进行检测分析，大大提高了分析速度。2.1 药用成分异构体分析 Bobzin等用Hewlett-Packard 1100 HPLC系统，Alltech Alltima C18 色谱柱，流动相为A 0.01%TFA的D2O，B 0.01% TFA的10%100%乙腈，梯度洗脱，体积流量1 mL/min，Va r ia n Unity-Inova 500 MHz NMR仪，有效体积60 L的1H/13C PFG探头，WET 脉冲来抑制溶剂峰，连续模式下，联合使用Perkin-Elmer Sciex AP100型MS仪对天然产物氨基转移酶中存在的几何异构体进行了鉴定，分别是阿普他明、反式阿普他明、阿普他昔及其类似物。根据质子的偶合常数确定其双键的构型，作者提出虽然LC-NMR联用缺乏灵敏性，但该方法仍然广泛用于已知化合物的分析和未知化合物的结构鉴定，将为药物的研究提供可靠地手段和提高效率。刘宁等用LC-10AT HPLC仪，HPCHEM型LC/MS仪，色谱柱为Kromasil C18（250 mm4.6 mm，5 m），流动相水（8020），体积流量为1.0 mL/min，检测波长216 nm。INOV500 MHz NMR仪，在500 MHz的工作频率下，以氘代甲醇为溶剂并作化学位移内标，试验在室温下进行，对HPLC分离得到的两种异构体进行NMR分析，得到了双氢青篙素型差向异构体向转化过程。实验中得到异构体和异构体的值分别为5.425.55。从NMR图中可看到共振峰化学位移变化的过程，也说明双氢青篙素的异构体转化现象的存在。王映红等在HPLC-MS分析的基础上用HPLC-NMR技术进一步分析了土茯苓中的二氢黄酮醇苷4个异构体。YMC-Pack ODS-A（250 mm4.6 mm，5 m）色谱柱，柱温25 ，流动相为乙腈（A）、0.05%甲酸的D2O溶液（B），梯度洗脱010 min 5%20% A、1045 min 20%55% A、4555 min 55%90% A，体积流量0.8 mL/min。Va r ian NOVA -500 HPLC-NMR联用系统，停流模式，WET抑制溶剂峰。Agilent 1100 LC-MSD-TRAP XCT PLUS系统，ESI接口。土茯苓中二氢黄酮醇苷的4个异构体分别为落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷和新异落新妇苷。该方法避免了传统的分离单体成分再鉴定结构的繁琐过程，从而可以简便快速的得各化合物的分子结构信息。Strohschein等研究了-胡萝卜素的顺/反异构体，分离出5种顺/反异构体，并通过2D NMR确定了3种顺/反异构体结构。用Merck L6200 A LC仪，（250 mm4.6 mm，5 m和3 m）硅 胶C30色谱柱，分别采用丙酮氘水（928，937）作为流动相，体积流量为1 mL/min。Bruker AMX 600 NMR仪，BPSU接口，停流模式。其中在3 m硅胶柱分离异构体最大峰比在5 m硅胶柱大。这是由于3 m硅胶柱能分离到异构体更小的洗脱体积，在实验中NMR流通池为120 L，这比洗脱体积小。因此认为NMR检测量取决于样品最大峰的浓度而不是样品的总量。Dachtler等用HPLC-MS和HPLC-NMR在线联合技术进行菠菜和视网膜中的叶黄素和玉米黄质立体异构体的分离和测定，浓度在纳克水平。HP 1100 HPLC系统，ProntoSIL C30（250 mm4.6 mm，3 m）色谱柱，柱温为22。用氘水作为流动相以减少溶剂峰，流动相为丙酮（A）和水（B），梯度洗脱021 min 86% A、2125 min 86%97% A、2540 min 97% A，体积流量为1 mL/min。Esquire-LC离子阱MS系统，APCI接口。NMR采用Bruker AMX 600NMR仪，BPSU接口，停流模式和连续流动模式结合。结果提示LC-NMR联用技术是结构明确的异构体分析的首选方法，可以用于痕量样品的分析和鉴定。2.2 新化合物的结构鉴定 Hendrawati等对峨参Anthriscussy lvestris (L.) Hoffm.中木脂素类成分的分离鉴定。采用Agilent 1200 色谱仪，Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm4.6 mm，5 m）色谱柱，柱温为30 ，流动相组分为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸的乙腈溶液（B），05 min 32% B、515 min 32%86% B、1515.1 min 95% B、15.120 min 95% B梯度洗脱，体积流量1 mL/min。API 3000型MS仪，APCI接口。Bruker Avance III 500 MHz仪和5-mm CPTCI 低温探头。获得了1D 1H、1H-1H- DQF-COSY、1H-1H-TOCSY、1H-13C-HSQC、1H-13C-HMQC和1H-1H-NOESY谱，最终鉴定了提取物中14种化合物，其中有6种含甲基的木脂素是以前没有报道过的，分别为-盾叶鬼臼素、-盾叶鬼臼素、异鬼臼苦酮、去氧鬼臼毒素、换臼毒酮、-盾叶鬼臼素甲基醚。结果证明联合使用LC-ESI-MS，LC-SPE-NMR技术是一种有效的分离鉴定化合物的分析手段，样品可以通过SPE在线富集，使得NMR灵敏度提高。Zehl等采用Varian 9012 HPLC系统，色谱柱为Hypersil BDS-C18（250 mm4.6 mm，5 m），柱温25，流动相为0.05%TFA的氘水溶液（A）、乙腈（B），梯度洗脱01 min 12% B、120 min 12%20% B、2050 min 20%50% B，体积流量为1.0 mL/min，停流模式，Varian INOVA 500 MHz仪，有效体积为65 L的ID PFG探头，WET抑制溶剂峰，联合运用三重四级杆型MS仪，分析1D（1H，13C）和杂核2DNMR（COSY、TOCSY、ROESY）谱，对茅膏菜属植物中黄酮类和鞣花酸衍生物进行了定量定性分析，其中2-O-没食子酰基金丝桃苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-(2-O-没食子酸)-吡喃半乳糖苷这3种化合物首次在此种属中被鉴别。HPLC-SPE-NMR联用技术是分离，分析化学或生物制品生物活性有效的手段，Goulas等21分析了狭叶香科Teucrium polium L.提取物。采用HPLC-SPE-NMR和HPLC-DPPH联用，Agilent G13311A HPLC系统，色谱柱为Discovery C18（250 mm4.6 mm，5 m），柱温为室温，流动相采用0.1%醋酸溶液（A）、乙腈（B），梯度洗脱，020 min 15% B、2030 min 15%40% B、3040 min 40%80% B、4045 min 80% B、4555 min 80%95% B。流动相体积流量为0.6 mL/min。Bruker AV-500 MR仪，有效体积为60 L的3 mm LC SEI 13C-1H探头。首次在狭叶香科中发现金石蚕苷，且是其中含量最高、性最强的成分，毛蕊花苷以及二甲氧基槲皮素是抗氧化的主要成分。Xu等采用联用技术分析了链荚木属植物Ormocarpum kirkii S.Moore中黄酮类化合物共有14个不同的成分，其中有8种是新发现的化合物，分别为氨基丙酰胺狼毒素、葡糖基化狼素、顺式7-氧-葡糖基化狼毒素、反式7-氧-葡糖基化狼毒素、7,7-双氧-葡糖基化狼毒素、4-羟基强的松龙、顺式7,4-双羟基强的松龙、反式7,4-双羟基强的松龙。LC-NMR采用Agilent1200色谱仪，流动相为0.05%的TFA溶液和乙腈，体积流量为2 mL/min。Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm4.6 mm，5 m）色谱柱，柱温为20 ，Bruker DRX 400 NMR仪。实验采用电子圆二色谱技术分析化合物的手性结构，用HPLC技术分离得到不同的单体，然后联用NMR技术对分离得到的单体化合物进行结构鉴定，这些技术的联用将有助于推进天然产物中新的化合物的发现。3 天然产物分析应用NMR 能检测到化合物的结构信息, 但其灵敏度由组分浓度决定, 因此目前该技术研究的主要对象是相对分子质量较小的化合物。当常规天然产物研究方法效率过低甚至无法有效发挥作用时, HPLC- NMR 则显示出快速高效的优点, 可用于粗提物微量组分的分离及结构鉴定, 因此在天然产物研究的不同环节均能发挥重要作用。3.1 化学筛选并指导粗提物定向分离由于灵敏度较低, 且缺乏适用的数据库, 对粗提物进行化学筛选时HPLC- NMR 不能作为首选方法。高效灵敏的分析方法, 如HPLC- MS 及HPLC/ UV 等更有效。但HPLC- NMR 在鉴别新组分结构类型, 鉴定结构具有规律性的同类化合物, 尤其在化合物的快速鉴定筛除等方面, 能有效地补充HPLC/UV- MS 法检测结构信息的不足, 从而能提高效率, 避免资源浪费。这些在天然产物的前期研究中具有重要意义。多数HPLCNMR实验是在停止流动模式下检测1H NMR 谱, 主要目的是判断组分的结构, 指导随后的定向分离新化合物等粗提物的处理步骤, 为天然产物的常规研究奠定基础3.2 结构鉴定 HPLC- NMR 鉴定结构通常从了解粗提物生源的植物学及化学分类学的特点开始, 结合HPLC/ UV- MS 和HPLC- MS n 等信息并参考可能存在的相关文献, 初步判别组分骨架类型。同时主要以停止流动模式检测高浓度组分, 可得1H NMR 谱、COSY、TOCSY 等1H- 1H NMR 相关谱以及HSQC、HMBC 等1H-13C NMR 相关谱, 并从后者反推出13C 的信息。这些信息基本可解决结构鉴定问题。虽然现在HPLC- NMR 检测涉及13C 信号的谱图仍较困难。基于以1H作为发射道的各类谱信息, 在鉴定粗提物中含量少、不稳定而不易分离制备的组分, 以及难分离或发生互变异构的组分, 尤其在确定结构、构象及光学异构体时, HPLC- NMR 仍发挥着重要作用。Dachtler 等HPLC- MS 及HPLC- NMR 检测了几种生物样品中对光或氧敏感易变的黄体素、黄质素等胡萝卜素类成分, 区别并鉴定了它们的数种几何异构体, 为阐明这些组分在预防治疗相关疾病时的不同作用奠定了基础。Schaller 等 HPLC- MS 及HPLC- NMR 测定了两个新的难分离的甲基醌类二萜组分, 对它们的混合物进行了常规NMR 实验, 并用HPLC- NMR 研究了它们在溶液中的互变异构现象4 代谢产物方面的应用 LC-MS 能分析更高极性和更高相对分子质量的化合物，已被越来越多地用于代谢组学研究，它非常适合于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标记物的鉴定。而药品中的代谢物分析在新药研究和临床用药监控方面起着极为重要的作用。LC- MS一个很大优势是它大多数情况下不需要对非挥发性代谢物进行化学衍生。过去几年，LC- MS技术中的软电离方式使得质谱仪更加完善和稳健，尤其是最近几年，超高效液相色谱(UPLC)/高分辨飞行时间质谱(TOFMS)技术及联机的MarkerLynx 自动化数据处理软件的应用为复杂生物混合物提供了更好的分离分析能力；另一方面，现代离子阱多级谱仪的发展使LC- MS 可提供未知化合物的结构解析信息。因此选择LC-MS，简便连续，灵敏度高，分辨率好。4.1 药物研究中的应用 药物在体内吸收、分布、代谢、排泄过程或某一治疗措施,可使机体功能活动发生变化, 进而影响终端代谢产物的变化, 并在代谢物有所反应。因此,代谢物水平变化是药物研究的有效指标。对LC-MS分析产生的数据,采用适当化学计量学方法进行处理, 可提取丰富的药物代谢信息, 使代谢组学研究在药物研发阶段发挥作用, 进行早期活体毒理测试, 而且能为药物分子筛选提供依据, 帮助确定药物的安全性生物标记物和代谢表型, 评价将动物模型实验应用于人类疾病的可行性。Wagner等采用LC-MS技术研究男性和女性患者口服阿司匹林的代谢差异。Sun等通过LC-MS进行儿茶酚氧位甲基移位酶抑制剂在大鼠体内代谢轮廓分析, 为药物的药理、毒理研究提供依据。Zhao等通过LC-MS技术, 成功检测小鼠服用传统中药后代谢物改变。可见, LC-MS 应用于代谢组学技术,可分析传统中药的药理、毒理。4.2 疾病标志物的寻找及病因学研究中的应用病理生理刺激或基因改变时, 生物体系动态代谢改变, 如尿液、血浆、血清、唾液和胆汁等生物体终端样本动态变化, 同样为代谢组学研究范围。Chen等通过LC/ MS 研究发现21 种代谢物可能成为肝癌标志物。Haleem 等指出, LC-MS检测技术可成为预测膀胱癌的检测手段。同时, LC-MS对疾病标志物的探索, 将为疾病发病机制研究提供依据。由此可见,LC-MS 作为一门很有潜力的新兴技术, 将在疾病诊断, 尤其是在疾病的早期诊断及进一步阐明发病机制方面, 将发挥重要作用。 五 结束语 LC-NMR的特点不仅是LC的高效分离能力和NMR精确的结构分析能力，更在于将两者巧妙结合技术。优点主要表现在减少了从提取到谱学数据测定中间的样品制备步骤，实验周期缩短，减少样品分散，需要样品量少，