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浅析质谱在蛋白质组学中的应用摘要：随着蛋白质组学研究的迅速发展, 质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息，本文介绍了基于质谱的定量蛋白质组学定向蛋白质组学、氢氘交换质谱的研究方法及优劣。关键字：蛋白质组学；质谱技术；研究方法；优劣Analysis of mass spectrometry application in proteomicsXuewen Chen (number: 07320901003)Chemistry and Chemical Engineering College of Bijie University09Chemistry (3) class, Bijie,551700Abstract: With the proteomics and the rapid development of mass spectrometry techniques have become used in proteomic research of powerful tools and core technology. Mass spectrometry of advanced technology in proteomics studies provide flux and molecular information presented in this paper based on mass spectrometry in quantitative proteomics, directed proteomics, hydrogen deuterium exchange mass spectrometry research methods and advantages and disadvantages. Key words: Proteomics; mass spectrometry; research methods; advantages and disadvantages 1 引言蛋白质的研究是一个复杂的过程。首先，其化学结构即氨基酸序列的多变性决定了其不同的结构和性质；其次，其形状因素，包括结构和构象以及在溶液中的运动亦是研究的重点。蛋白质的结构和动力学变化对其功能的影响至关重要，因此，研究其三者之间的关系具有重要的意义。1.1蛋白质组学蛋白质组学( Pro teom ics)1是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明蛋白质组学及攻克提供理论根据和解决途径。蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。因此对其进行定性、定量鉴定就显得尤为重要。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线: 一是基于双向电泳的蛋白质组学; 二是基于质谱的蛋白质组学。1.2质谱质谱（mass spectrum）2是化合物分子在真空条件下受电子流的轰击或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带电荷的离子，这些离子按质荷比m/z（离子的质量m与其所带电荷z的比值）的大小被收集并记录程谱的方法。1.2鉴定技术生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术，其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽键）成肽段，对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种：基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI- MS）。 1.21飞行时间质谱：MALDI3 的电离方式是Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶体，当用激光（337nm的氮激光）照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离。它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱，非常快速（每次分析只需35min），灵敏（达到fmol水平），可以精确测量肽段质量，但是如果在分析前不修饰肽段，MALDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列。 1.22电喷雾质谱（ESI-MS）ESI- MS4是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。ESI-MS从液相中产生离子，一般说来，肽段的混合物经过液相色谱分离后，经过偶联的与在线连接的离子阱质谱分析，给出肽片段的精确的氨基酸序列,但是 分析时间一般较长。 目前，许多实验室两种质谱方法连用，获得有意义的蛋白质的肽段序列，设计探针或引物来获得有意义的基因。随着蛋白质组研究的深入，又有多种新型质谱仪出现，主要是在上述质谱仪的基础上进行改进与重新组合。2 定量蛋白质组学在整体水平上研究蛋白质的定量分析被称为定量蛋白质组学( quantitativepro teom ics)。定量蛋白质组学工作流程可分为3 类, 即稳定同位素标签、谱峰计算和谱峰特征分析。基于质谱定量蛋白质组学研究通过质谱谱图的谱峰的强度, 质/荷比和出峰的时间、质量同位素峰等来表示。通过比较多个样品质谱相关信息的丰度变化进行定量, 且通过控制假阳性率( false-discovery rate,FDR)提供差异丰度特征的最大程度列表。2.1 稳定同位素标签稳定同位素标签5是一种标记定量技术, 在相同的质谱运行条件下对肽的谱特征分别定量, 谱峰的信号强度可作为定量的依据。 用稳定同位素标记蛋白质样品混合样品酶解、质谱分析。2.2 谱峰计算蛋白质被质谱检测的计数体现了蛋白质的丰度，用相同的数据采集提取步骤对样品分别进行质谱分析, 并以肽段被质谱检测的计数为基础, 再通过归一化来表征被检测蛋白质的相对丰度。质谱检测计数法认为肽段在质谱中被检测到的频率与蛋白质在混合物中的丰度成正比。2.3 谱特征分析定量蛋白质样品分别单独运行质谱, 通过计算机工具建立肽段的峰强度、峰面积、液相色谱保留时间等信息进行蛋白质丰度的定量。优缺点：15N 体内代谢标记，标记效率高，但一次只能分析2个样本，标记后的蛋白质质量偏移难预测。SILAC 蛋白质掺入同位素标记的氨基酸， 如赖氨酸和精氨酸，标记效率高；适合细胞的标记，但标记效率难保证对生物体组织或体液的标记昂贵。酶促的18O 标记,胰蛋白酶催化下，多肽C 端标的羧基1 6 O被1 8 O置换，标记操作简单，价格相对便宜，标记效率因多肽性质不同差异较大；标记的稳定性欠佳，易回交。ICAT 与多肽的- S H 反应而引入质量标签，标记效率高，标记多肽易于与非标记多肽分离，简化了分析体系，一次只能分析2个样品；只标记含巯基的多肽和蛋白质，覆盖率低。iTRAQ，与多肽- N H 2 反应而引入等质量标签，标记所有酶切多肽，增强了蛋白质定量的可信度，4 或8 重标记能力标记试剂昂贵。3 定向蛋白质组学定向蛋白质组学6是基于质谱技术快速检测目标蛋白的技术，基于质谱的鸟枪蛋白质组学研究是将蛋白质酶解, 片段化成肽片段进行质谱分析。方法是采用选择反应监测( se lected reaction monitoring, SRM ) 和多反应监测( mult ip le react ionmon itor ing, MRM ) 。3.1反应监测和多反应监测反应监测过程是选择一个特征性的母离子做串联质谱分析, 在其碎片中再选择一个特征的子离子作为监测离子。需要建立全分析蛋白组学的SRM数据库。反应监测( mult ip le react ionmon itor ing, MRM )7方法和多反应监测本质上是同样的实验模式。该方法具有蛋白质免疫印迹杂交的灵敏度和重复性, 优势在于验证特异性的速度快。蛋白质免疫印迹定量肽可能需要花费3个月的时间, 而定向蛋白质组学分析只需要几天目前该方法还不能广泛地应用到蛋白质组学中, 主要原因在于建立用于分析全蛋白质组学SRM 数据库是一项非常耗时的工作。但相信随着该技术的快速发展, 将有利于高通量、高灵敏度检测不同生物学样品中蛋白质的鉴定和定量分析。4氢氘交换质谱氢氘交换质谱8法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术，其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息 。氢氘交换质谱法的主要过程包括：样品制备、交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽液相分离、质谱检测、数据解析。优点：氢氘交换质谱不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白、蛋白相互作用位点等。首先，可以进行蛋白质结构动态变化的研究是氢氘交换质谱的一个突出优点，包括变化中的活性位点及表位；其次，氢氘交换质谱在蛋白复合体构象的研究中也具有独到的优势；此外，氢氘交换质谱还具有对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象等优势。缺点：首先，氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。其次，是其应用难点在试验中要采集0s,10s,1min,10min,60min,240min 等多个时间点的数据，而且实验过程重复繁琐。而且，氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。这点对于单纯通过质荷比进行分析的质谱仪来说完全无能为力。5质谱在蛋白质组血研究展望质谱技术的发展推动了蛋白质组学的发展, 在蛋白质组学中处于核心地位。其中的定量，定向，氢氘交换的方法对用于对蛋白质分子测定，结构10，复性中间体以及复性动力学研究，蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质聚集现象等的研究等起着重要的作用，随着质谱技术的逐渐成熟以及整个反应及检测过程的自动化的实现，其在蛋白质结构与功能研究中会起到越来越重要的作用，将推进蛋白质组学的快速发展，以后的质谱在蛋白质组学中的作用将向综合发展，相信随着现有定量技术的改善和发展，以及分离技术、质谱技术的新突破，生物信息学的发展等，定量蛋白质11组学必将走向精确、可靠和成熟，为人类的健康发展做出巨大的贡献。6 结 语质谱技术具有高灵敏度、高分辨率、快速、高通量的特性, 该技术与生物信息学的结合为蛋白质组学研究提供的通量信息是其他技术所不能比拟的。质谱技术的发展推动了蛋白质组学的发展, 在蛋白质组学中处于核心地位。蛋白质组学是功能基因组学中的重要部分, 开展蛋白质组学的研究将有利于推动林木功能基因组学的研究, 林木蛋白质组学研究内容可涉及遗传育种逆境生理和木材形成等多方面。虽然林木基因测序的数量较少, 但利用基于质谱的从头测序技术在一定程度上可以解决基因组测序不完全这一问题。参考文献：1 甄 艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用M. 南京林业大学学报( 自然科学版),2011(35)1.2 孟令芝，恭淑铃，何永炳.有机波谱分析 M.武汉：武汉大学出版社,2010.3 孟令芝，恭淑铃，何永炳.有机波谱分析 M.武汉：武汉大学出版社,2010.4 孟令芝，恭淑铃，何永炳.有机波谱分析 M.武汉：武汉大学出版社,2010.5 甄 艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用M. 南京林业大学学报( 自然科学版),2011(35)1.6 甄 艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用M. 南京林业大学学报( 自然科学版),2011(35)1.7 甄 艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用M.