发酵液预处理与固液分离.doc

发酵液的预处理和固液分离方法综述 摘要：从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。关键字： 预处理 固液分离正文：1、 发酵液预处理微生物发酵和细胞培养的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类物质。从发酵液和细胞培养液中提取所需的生化物质，第一步就需进行预处理，以便于固液分离，使代谢产物后续的分离纯化工序顺利进行。其原因有三个方面：首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流体，不易过滤，而所需的生化物质往往只有分布在液相，才能有效地提纯。并且，在有些发酵液中，菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤速极慢，必须设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次，目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分复杂，大量的菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。所以，对发酵液进行适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物），并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。 预处理方法要根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择。大多数发酵产品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有产物存在的情形也比较常见。如果目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。细胞经破碎或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进行细胞碎片的分离。如果所需的产物为细胞，离心或过滤所得固相经干燥等过程就可得到菌体。图11为生化产品分离纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。 图11 生化产品分离纯化的一般步骤【1】1.1 预处理简述 发酵液经过预处理，一些物理性质会改变，从悬浮液中分离固形物的速度随之提高，过滤操作更易进行；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处理的相中（一般为液相）。同时，发酵液中的部分杂质也得以去除。发酵液的预处理过程一般包括以下几部分： （1）发酵液杂质的去除：包括除去蛋白质、无机离子以及色素、热原质、毒性物质等有机物质。 （2）改善培养液的处理性能：主要通过降低发酵液的粘度，调节适宜的pH值和温度1及絮凝与凝聚等操作来实现。 预处理在生物技术产品的加工和提纯过程中相当重要。目的产物不同，采用的预处理方法也不同。并且，由于具体发酵液的实际情况差别很大，预处理方法就更加灵活，多样，应根据生产需要进行选择和改进。 发酵液预处理之后，再进行固液分离，进入后续的分离纯化工艺。1.2 发酵液杂质的去除发酵液成分复杂，目的产品与许多溶解的和悬浮的杂质夹杂在一起。在这些杂质中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白。在采用离子交换法提炼时，高价无机离子，尤其是Ca2+ 、Mg2+ 、Fe3+的存在，会影响树脂对生化物质的交换容量。而杂蛋白，一方面，在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低吸附能力，另一方面，在采用有机溶剂或两水相萃取时，常有乳化现象，使两相分离不清。除此之外，在常规过滤或膜过滤时，杂蛋白还会使滤速下降，污染滤膜。因此，在预处理时，应尽量除去这些杂质。【2】1.2.1 无机离子的去除由于培养基或水中含有无机盐，发酵液中往往存在许多无机离子，如Mg2+、Ca2+等，因而需要经常测定并除去无机离子。去除的方法比较固定，因此，在这方面的研究也比较少。1.2.2 可溶性蛋白质的去除及其生化机理在发酵液中除了上述高价无机离子外，还存在可溶性杂蛋白。一般来讲，对于无机或有机酸、碱及其金属盐类，在特定条件下，通过溶媒转向、离子交换等方法可使其与产物逐步分离。但对于可溶性杂蛋白，如果任其进入滤液，将给以后各步的分离精制工作带来极大的不便。因此发酵液的预处理，从根本上说，是如何使可溶性杂蛋白形成沉淀，以便随固形物一同除去的过程。在各种方法中，变性沉淀最为常用。正确认识蛋白质的性质和变性理论很重要，因为它是发酵液预处理所依据的生化机理3。1.3有色物质的去除在发酵的过程中，培养基本身可能带入色素，如糖蜜、玉米浸出液等都带有颜色，使得发酵液的颜色加深；此外，微生物在代谢过程中，本身也可能产生有色物质。但是，从提高产物的质量的观点来看，又必须除去发酵液中有色物质【3】。色素的化学结构比较复杂，性质多样，给脱色工作带来了相当大的麻烦。常用的脱色方法为吸附法，如活性炭吸附，树脂吸附等。吸附法可以不用或少用有机溶剂，操作简便，设备简单，生产过程中的pH值变化范围小。陈碧娥等人采用K15颗粒活性炭作脱色剂对L乳酸发酵液进行脱色，脱色率达到97%，而乳酸钙的损耗仅为1%左右。常用于吸附的树脂又称为“脱色树脂”，它表面积大，具有多孔性，吸附能力强等特点。在发酵工业中多用于脱色、吸附大分子的产物和除去蛋白质。近年来出现的大网格树脂孔隙大，树脂内表面积大，也可应用于脱色工艺。例如食品工业上的糖浆脱色时多用大网格树脂。此外，脱色工艺还可以利用某些离子交换树脂进行。例如，采用强碱性阴离子交换树脂，使果胶酶溶液脱色，酶活损失率不超过15%20%。阴离子交换树脂对糖浆中的有色物质具有很强的吸附能力，可以用在谷氨酸发酵液的脱色中，树脂的最佳操作形式为磷酸盐式。用DEAE纤维素从含酶溶剂中吸附有色物质，通常可同时除去非活性蛋白质，使主产物纯化25倍。另外，现在的预处理工艺也采用工业酶制剂完成，如净化发酵产物、除去干扰性浑浊物。用淀粉酶将发酵液中残留的不溶性多糖转为单糖，可以提高过滤速度；用带电胶体如鱼胶添加到浑浊的饮料中以除去悬浮体等等。2.1.液处理性能的改善2.1.1降低发酵液的粘度根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，因此降低液体粘度可以有效的提高过滤速率。降低液体粘度的常用方法有加热法和加水稀释法两种。升高发酵液的温度可以有效的降低液体粘度，提高过滤速率。同时，在合适的温度和受热时间下，蛋白质会凝聚，形成大颗粒的凝聚物，发酵液的过滤特性得到了进一步的改善。但是，生物产品往往对温度敏感，因此，加热时必须严格的控制加热温度和加热时间。首先，加热温度必须低于目的产物的变性温度：其次，温度过高或时间过长，细胞溶解，会使胞外物质外溢，反而增加了发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。例如，在40时，12Be麦芽汁的粘度为1.210-3Pas，当温度升至75时，粘度可下降一半，过滤速率加倍。对于链霉素的发酵液，在pH值3.0的条件下，升温至70后维持半小时，可使液体粘度下降1/6，过滤速率增大10100倍。加水稀释法也是降低发酵液粘度的方法。但是，稀释后悬浮液的体积增大，加大了后续过程的处理任务。针对过滤操作而言，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比，才能认为有效，即若加水一倍，稀释后液体粘度应下降一半以上，过滤速率才能得到有效提高。2.2.2 调节pH值调节pH值是发酵液预处理的常用方法之一。因为pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调节pH值可以改善其过滤特性。首先，对于氨基酸和蛋白质等两性物质而言，将pH值调至等电点，即可沉淀除去。其次，在膜过滤时，发酵液中的大分子物质容易吸附于膜上，调节发酵液的pH值可改变易吸附分子的电荷性质，减少膜的堵塞和污染。此外，在合适的pH值下，细胞和细胞碎片及某些胶体物质会趋于絮凝状态，形成较大的颗粒，有利于过滤操作的进行。除降低粘度和调节pH值外，还可采用絮凝操作改善发酵液的处理性能。由于絮凝是一种重要而且常用的预处理方法。3.预处理总结与展望目前，预处理的研究，一方面是改进传统的处理方法；另一方面，在生化分离技术走向整合的大背景下，全发酵液的提取技术（将预处理与后续提取纯化操作相结合）倍受关注。由于发酵液的预处理是生化分离过程中首要的一步，因此，正确高效的预处理是得到目标产物的关键。越来越多的人已经认识到了预处理的重要性。随着对其研究的深入，预处理环节必将对提高产品质量和产率作出巨大贡献。2、 固液分离技术1. 概述固液分离是生物产品分离纯化过程中重要的单元操作。在生产中，培养基、发酵液、一些中间产品和半成品均须进行固液分离。其中，发酵液的种类多、成分复杂、粘度大，属于非牛顿型流体，因此，发酵液的固液分离最为困难。生物产品的生产中，固液分离的方法有分离筛、悬浮分离、重力沉降以及离心和过滤等。在这些方法中，用于发酵液固液分离的主要是离心和过滤操作。具体的固液分离方法和设备应根据发酵液的特性进行选择。对于丝状菌，如霉菌和放线菌，体形比较大，一般采用过滤的方法处理发酵液；而单细胞的细菌和酵母菌，其菌体大小一般在110m，高速离心的效果比较好。但是，当固形物粒径较小时，通过预处理改善发酵液的特性，就可用过滤实现固液分离。例如，在氨基酸的发酵液中，菌体很小，如果在预处理过程中进行絮凝，并添加助滤剂，就可使用板框过滤机分离菌体。由此看来，发酵液的预处理为固液分离及后处理作了准备工作。表【4】21给出了主要的固液分离技术，并从原理、设备和优缺点四个方面进行了比较。表21 主要的固液分离技术及其特点序号方法原理设备特点缺点1离心在离心产生的重力场作用下，加快颗粒的沉降速度高速冷冻离心机碟片式离心机管式离心机倾析式离心机框式离心机适用于粒径小、热稳定差的物质回收，常用于实验室适用于大规模工业应用，可连续或批式操作，操作稳定性较好，易放大、推广批式操作、转速高，固液分离效果较好、含水低，易放大推广连续操作，易放大，易工业应用，操作稳定实质为离心力作用下的过滤。适用于大颗粒固形物的回收，放大容易，操作较简单、稳定、适用于工业应用产量小，连续操作困难，大规模工业应用差半连续或批式操作时出渣、清洗复杂，连续操作固形物含水量高，总的分离效率低容量有限，拆装频繁、处理量小、噪声大对很小颗粒的固形物回收困难，设备投资高批式操作或半连续操作，转速低，分离效果较差，操作繁重，离心的设备投资高，操作成本高2过滤依据过滤介质的孔隙大小进行分离板框过滤机、平板过滤机、真空旋转过滤机、管式过滤器、蜂窝式过滤器、深层过滤器设备简单，操作容易，适用大规模工业应用，适用于大颗粒固体过滤分离速度低，分离效果受物料性质变化的影响，劳动强度大3膜分离依据被分离分子和膜孔大小进行分离板框式、管式、中空纤维式和螺旋卷式等膜过滤器。主要用于分离细胞。操作简单，效果好，可无菌操作，适用性好，易放大膜易污染，分离效果与操作技巧关系密切，需要精心保养、清洗，膜易污染，分离效果与物料性质密切相关2. 过滤过滤就是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮物中的固体颗粒，从而实现固液分离的方法。微生物发酵液属于非牛顿型液体，在悬浮液中含有大量的菌体，细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基，这些固体颗粒均可通过过滤操作减少或除去。目前，在生化工业中，过滤的方法还是以传统的板框过滤或真空过滤等为主。随着膜分离技术的发展，过滤已超出了传统意义上固液分离的范畴。选择性和高效性使膜分离技术在生物产品的分离提取中蕴含着巨大的潜力。2.1传统的过滤方法传统的过滤单元操作，据过滤机理的不同，可分为深层过滤和滤饼过滤两种。深层过滤所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性碳和塑料颗粒等。过滤介质填充于过滤器内形成过滤层。过滤时，悬浮液通过滤层，滤层上的颗粒阻拦或者吸附固体颗粒，使滤液澄清，因此，过滤介质在过滤中起主要作用。澄清过滤适于过滤固体含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5100m范围内的悬浮液，如河水、麦芽汁等。滤饼过滤的过滤介质是滤布。悬浮液通过滤布时，固体颗粒被阻拦形成滤饼或滤渣。悬浮液本身形成的滤饼起主要过滤作用。滤饼过滤一般用于过滤固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液。就滤饼过滤而言，如果按过滤推动力的不同，又可分为常压过滤、加压过滤和真空过滤三类。常压过滤效率低，所以只适合于过滤易分离的物料。例如，啤酒糖化醪的过滤。而加压和真空过滤在生物和化工工业中的应用比较广泛。设备一般为板框压滤机和鼓式真空过滤机等。2.2 膜过滤在传统观念中，过滤仅仅是一种过滤分离的手段，但是随着膜技术的发展，过滤已经扩展成为一种选择性滤出一定大小物质的方法。目标产物可根据设计滤出或保存在溶液中。由于膜在分离过程中，不涉及相变，没有二次污染，具有生物膜浓缩富集的功能，同时它又是一种效率较高的分离手段，在某种程度上可以代替传统的过滤、吸附、重结晶、蒸馏和萃取等分离技术，因此，作为一种新兴的有效的生化分离方法，膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期很有发展前途的重大生产技术。利用膜进行分离可以带来很大的经济效益。但由于膜在操作过程中会发生污染及浓差极化，使膜通量下降，进而导致设备成本上升、产品质量下降。为解决这些问题，目前有关滤膜污染及抗污染膜的研制已成为膜分离技术的研究热点。广义的“膜”分隔两相界面，并以特定的形式限制和传递各种化学物质。它可以是对称或非对称的、全透性或半透性的、固体或液体的、中性或荷电性的，可以独立于流体之间或附于支持体和载体的微孔隙中4。一般来讲，膜是均匀的一相或是由两相以上的凝聚物质所构成的复合体，厚度在0.5mm以下。但是，膜不管薄到什么程度，至少要有两个界面，才能与两侧的流体相互接触。并且，膜传递某物质的速度必须比传递其他物质快，才能实现有效的分离。膜分离是利用具有一定选择透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化，过程的实质是物质通过膜的传递速度不同而得以分离，过程近似于筛分，不同孔径的膜截留粒子的大小不同。在分离过程中，膜的作用主要体现在三个方面5：完成物质的识别与透过、充当界面和反应场。物质的识别与透过是使混合物中各种组分之间实现分离的必要条件和内在因素；在分离中，膜作为界面，将透过液和保留液（料液）分为不相混合的两相；而作为反应场，由于膜表面及孔内表面含有可与特定溶质发生相互作用的官能团，因此可以通过物理作用、化学反应或生化反应提