生物药物分离技术.doc

第二章表面活性剂分子在溶剂中缔合形成胶束的最低浓度即为临界胶束浓度反胶团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”。反胶团特异性功能：(1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能； (2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。 反胶团萃取优点：（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性； （2）分离、浓缩可同时进行，过程简便； （3）能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题； （4）由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶； （5）反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。 吸附分离法吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表面，而从混合物中的分离的的过程。吸附法特点:(1)不用或少用有机溶剂（2） 操作简便、安全、设备简单 （3） 生产过程pH 变化小 （4） 从稀溶液分离溶质 （5）吸附剂对溶质的作用小 （6）吸附平衡为非线性 （7） 选择性较差吸附的类型：（1） 物理吸附: 放热，可逆，单分子层或多分子层，选择性差 吸附速度较快，需要的活化能很小 （2） 化学吸附: 放热量大，单分子，选择性强 吸附速度慢，需要一定的活化能 （3） 交换吸附: 吸附剂吸附后同时放出等当量的离子到溶液中活性炭是非极性吸附剂，在水中吸附能力大于有机溶剂中的吸附能力。对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。活性炭种类颗粒大小表面积吸附力吸附量洗脱粉末活性炭小大大大难颗粒活性炭较小较大较小较小难锦纶活性炭大小小小易大网格吸附树脂适合于提取各种有机化合物。优点（1） 选择性好（2） 解吸容易（3） 机械强度好（4） 流体阻力小（5） 反复使用 （6） 可适用于各种产品硅胶是极性吸附剂,具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质. 硅胶的活性与含水量有关：含水量高则吸附力减弱。当游离水含量17%以上时，吸附能力极低.亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分离。吸附剂由载体（Carrier）和配位体(Ligand)组成亲和吸附的特点：a 效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。 b 分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物 c 通用性较差，洗脱条件苛刻亲和吸附的载体通常是惰性的，往往不能直接与配基连接，偶联前需要先活化载体经活化后，就可以进行与配基的偶联反应。载体的活化:a溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳酸盐 b高碘酸活化法：氧化多糖，生成烷基胺 c环氧化法：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，再与氨基偶联 d甲苯磺酰氯法：双功能试剂法 二乙烯砜配基偶联方法: 碳二亚胺缩合法(脱水) 酸酐法 叠氮化法 重氮化法固相析出分离法盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程盐析法机理：1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂优点（1）价廉 ；（2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好（4）不易引起蛋白质变性。 缺点：（1）水解变酸；2）高pH 释氨，腐蚀；3）残留产品有影响影响盐析的因素：a溶质种类的影响：Ks和值 b溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；c pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量 通常调整体系pH值，使其在pI附近；d 盐析温度：一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降盐析法特点:1成本低，不需要特别昂贵的设备。2操作简单、安全。3不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。4分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。 有机溶剂沉淀法: 在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点：1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高有机溶剂沉淀法机理: A 降低溶剂介电常数：减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B 破坏水化膜：有机溶剂与水互溶后，溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。C 相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂. 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。膜分离技术膜分离方法: 透析, 微滤, 超滤, 纳滤, 反渗透, 电渗析, 渗透气化过程膜结构驱动力应用对象实 例微滤对称微孔膜0.0510m压力差消毒、澄清收集细胞培养悬浮液除菌，产品消毒，细胞收集超滤不对称微孔膜0nm压力差大分子物质分离蛋白质的分离/浓缩/纯化/脱盐/去热源纳滤复合膜1nm压力差Donna效应小分子物质分离糖/二价盐/游离酸的分离透析对称的或不对称的膜浓度差小分子有机物/无机离子除小分子有机物或无机离子膜的污染大体可分为沉淀污染、吸附污染、生物污染。沉淀污染对反渗透和纳滤的影响尤为显著。当过滤液中盐的浓度超过了其溶解度，就会在膜上形成沉淀或结垢。有机物在膜表面的吸附通常是影响膜性能的主要因素。污染物在膜孔内的吸附或累积会导致孔径减少和膜阻增大，这是难以恢复的。 生物污染是指微生物在膜内积累，从而影响系统性能的现象。微生物粘附和生长形成生物膜。老化生物膜主要分解成蛋白质、核酸、多糖酯等，强烈吸附在膜面上引起膜表面改性防止膜污染的方法：进料液的预处理：预过滤、pH及金属离子控制；选择合适的膜材料：减轻膜的吸附；改善操作条件：加大流速。化学法常用的清洗剂有： 1NaOH：发酵工业中用得很普遍，浓度为0.11.0M。它能水解蛋白质，皂化脂肪和对某些生物高分子起溶解作用 2酸：如HNO3、H3PO4 和HCl。用于去除无机污染物，如钙和镁盐。对不锈钢装置不能用HCl。柠檬酸对含铁污染物有效。 3表面活性剂：主要对生物高分子、 油脂等起乳化、分散、干扰细菌在膜上的粘附。常用的SDS和Triton X-100，有较好的去蛋白质和油脂等作用。4氧化剂：氯有较强的氧化能力。当NaOH或表面活性剂不起作用时，可以用氯，其用量为10-6mg/L活性氯，其最适pH为1011。5酶：酶本身是蛋白质， 能用其他清洗剂就酶。但如要去除多糖时，淀粉酶有一定作用的。6有机溶剂：由于有机溶剂对膜和装置有不良作用，因而很少采用。20-50乙醇可用于膜装置的灭菌和去除油脂或硅氧烷消泡剂，但使用时系统必须符合防爆要求。膜污染的清洗方法还有物理法：海绵球擦洗。热水法。反冲洗和循环清洗*膜污染与浓差极化在概念上不同， 浓差极化加重了污染，但浓差极化是可逆的，即变更操作条件可使之消除，而污染是不可逆的，必须通过清洗的办法，才能消除。 *超滤是在外压工作下进行的。外援压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度，这就是浓差极化现象。第三章反相高效液相色谱 *分离机理：用C4C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。 在水溶液中，疏水性基团避开水而亲合其他疏水性基团，即溶质分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填料（疏水性配基）的亲合。 不同的蛋白质在相同流动相中由于疏水基团数量、种类以及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到分离。结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟； 疏水性小的蛋白质就容易被洗脱。固定相：常用C4 C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为填料。孔径2550 nm。流动相：水溶性有机溶剂（B液） （甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃）水（A液）强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ）加酸作用：SiOH = SiO- H+ 蛋白质易与SiO- 结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。 检测：用紫外检测器，检测波长280nm 和220nm。280nm检测中含有含苯环的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以280nm检测是普遍使用的波长。220nm主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。洗脱方式：梯度洗脱逐渐增加洗脱强度。最大优点：分离度最高； 最大缺点：容易使蛋白质变性失活。疏水相互作用色谱：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体 系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化合物的液相色谱法，叫疏水相互作用色谱*分离原理：1在HIC中：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2，-CH3 ，-ph等）。2蛋白质分子是一个外部有亲水层包围，内部有疏水核的具有四级结构的复杂体系。 3蛋白质表面亲水性很强，但也有一些疏水性的基团，同时团状的蛋白质还存在疏水基团较多的裂隙。4在不同的介质中裂隙的伸展和收缩程度不同，从而使疏水基团暴露的多少也不同。 5疏水色谱是利用盐水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之间疏水作用力的不同而达到分离的目的。 疏水作用色谱与反相色谱的区别相同：蛋白质与填料之间的保留是疏水力作用的结果。*区别：1）填料不同 HIC，表面中等疏水性作为配基； RPC，表面是烷基C48等疏水性强的为配基。2）疏水力不同 HIC，疏水作用较弱； RPC，强。两色谱中洗脱液主要成分不同（正是上面的差异引起的）在HIC中可以加入少量有机溶剂以增强流动相的洗脱能力； 在RPC中加入盐来改变蛋白质的保留值。体积排阻色谱：根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 凝胶过滤色谱的优点 分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好。 分离的分子量范围广。 易于操作。凝胶过滤色谱的缺点 处理量小，时间长，效率低。离子交换色谱：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离的目的。骨架：接有功能基团，本身是惰性功能基团：连接在骨架上，可与相反离子结合活性离子：与功能基团所带电荷相反的可移动的离子待交换分子：在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基团结合活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换原