（微生物学专业论文）犬类microrna的计算机鉴定及分析.pdf

摘要 4 利用启动子分析软件对所有的m ir na进行了 分析 最后鉴定出了1 42个mi朋 a 形成了53 个簇 由上游的启动子控制表达 其中 28 个簇由多个同源的 mir na 基 因组成 18个mir n a 簇形成8 个不同的同源簇 进一步的分析表明有些簇 是通过重复的形式产生多拷贝 5 研究结果 表明8 号 染色体上存在一个与 人具 有高度同源的印迹区域 在这个 区域发现一个最大的由41 个mir na 组成的mir na 基因簇 另外两个簇则位于 该簇的上 游 分别是由5 个耐朋a 组成的基因簇以及c d sn o rna 基因 簇 进 一步分析 表明这 最大的m ic ror na基因 簇由 三个基因家族组成 这三个家族分 别是由不同的mic r o r n a通过串联重复而产生的 6 研究发现 巧 个耐rna 位于基因组的重复区域 其中 7 个位于 l i ne 元件中 其它大多数位于sin e中 它们有些完全位于重复元件内 有些则与元件部分 重叠 而且还有2个丽rna位于rrna 基因的内含子中 7 通过分析 发现大多 数耐r na 在 动物的 进化过程中都是保守的 研究发 现 大 多 数m irn a 是通 过局部串联重复以及非 局部重复形式而进化的 串联重复 在 邻近区产生多个 拷贝 而非局部重复发生在不同 染色体 之间 从而 产生 基因 或者基因簇的迁移 8 对所鉴定的m irna 靶序列的预测分析表明 大多数 m irna 所调节的靶序列参 与了几乎生物体所有的细胞过程 比如生长发育 代谢 调控因子的调节以 及信号转导作用 等等 其中参与的最多的功能 可能是调节 转录因 子的 表达 同 时有些mir n a 可能参与了一 些癌症相关的 过程 更为重要的是 我们鉴定 出了狗特异性的靶序列 它们可能参与了狗生长过程中的一些特殊过程 最 后 我们 发现m ir 一 1 8 6 能 够调 节其宿主蛋白 的 表达 从而影响其表 达量 这 是一种自 我调节的反馈机制 相互制约 相互影响 关键词 微小r n a mic r o rn a 基因 组织形式 同源簇 反馈抑制 a b s t r act abs tract m cror n a s asa 细1 1 i lyofnon c o d in g sma u r n a1 8 25niin e n g t h h ave b 沈 n p r o fo un dl ys 加 d l ed 访代 c e n t y ears inpl ants ani m 川 s andvi rus as 助 诵脚找 朗 玄 re gul a l o r ineuk 别 下 o t e o r g 田 叮 s m m an y 创 udy w o r k l l a d donetop r o v e th at而cror n a h ave abr o ad ro l es inthe de v e l 0 p m e ntofo 飞 anl sm in v o l v in gev 恻 留 户 戈 t o f c e l l p h y s i cai activity t b e c h a m c t eriza t i on of而rn aissti a hot a c a d emicdom ain fo r thec a u s e0 fthe ide nti 6 edmi c r d r na farfro m 劝 切 rat l o il th esci enl i s ts had com p 1 e l ed se q u enc i n g0 fd o gg e n 0 m e an d而o u gh h u m 田 时 d o g罗n om i c州r ai i 即 口 e n 仁 it i s fo und th a t dog s and h 切 旧 ans b a v e s 而i l arl e v e isofo v e r a l l nuc l 即 t i de d i v e rs i ty m ean w hi l e the s pec i esdi spl aye x t r e m e 灿e n o ty p i c d i v ersi ty th e r e fo 肥 a l l p r o v l dea g ed fl atfo r 肥 s e a r c h d i se ase re l ated 诫thh ujnan m o rei m porlan t l y 5 议 mir n a w e r echara c t e ri zedin mi r b aseth us fara bove all th 盘 p t o vi de agre at 即ade m i c and r e al i stic n e a n i ng for id enti 斤 in g mi r n a ls i n dog gen om e as fo r l i m e 助d tissue一 杯 姆 c ialityof 而r n aexp r e s si on andm i l ea d in gof deg r a d a t i o nof mr n a 即do u l er o o n c odin gr n as th ere is li m it at io nby usin g e x per lme nt alr n o m ic s there fo re we a p p l yc o m p utat l o n 习r n o m ic sto p re d i ct m i r n a in d og b a s e don seq u e n c eco玫 犯 r v atio nof ma t 川 re har n as andth eir p recu r s o r d i s p i 即 i n g h ai rp in 就 nj c l u re l e a d i n g 仍i d enlifi cati o n of3 5 7 n o ve l m i r n as t 七 e fol l o w i 雌 i s the s um n a r l zat i on o f o urresult 1 t b e l o c i o f al l 3 5 7 而c ro r n ase q u en ce s in罗 n o me l i e inal l 3 3 c hr o m o so m eso f g eno m e a l l l o n gt h e sem i r n a s z g l se q u ence s be l o n g 1 0si n g l e 一 co py i n d o g g e nom eandthe 0 t h e r3 5se q u enc es belo ng to m u l t i 一 opy then umbe r o f 哭 q uen c esi n i d t e r g e ni c re g i on i s 2 2 2 inl n tr o n isl 2 5 ant i 一 s ensetog e n e i s 5 0 sen setog ene i s 7 5 andi n exo ni s 6 i n u t ri s 3 a l l p r e c u rso rs御 g ed from6 5 tol 2 0 niinl e n gt h witha v e 口 g e l en gth o f 8 0 nt 2 w 七h a v e 即al y 双 刃w h e t h erall m i r n acoul dfo而 s t e m l oopwh enj oi n ed with n 歇 止 i ng se q u e n ceinge no服 u 甘 u gh m 一 fo ldp r o g 刊 m s 出 l dthe re su lts s how e d th ata m aj o ri tyo f m i r n ah a v e 面s p r l pe i ty门 h o mol o g u e o f b u m anm i r n as bad h 犯 n vali d at edb y e x pen m e 城in d i cating th a t th eycan e x p re s s st a b 1 y m eanw h i1 e sn o v elmi r n as werefou n dby 浅 叮 c h i n ge s tdal abase f u rt h e n 刀 re we c ar ry o utr i p c rassa y o f s n o v e l mi r n a 1 认 心o f w h i c h can o b ta i n the e x pec l e d resul仁 s u g gesti ngt h atth ey咖 exp r e s s ab s t ract 3 肠 叫gh anal y s i s we fo und th atth e 3 0 0 homol o g u e o f h u m an m 1 r n abel o n g to 1 4 9fa l ll i l i e s andmi r 一 1 5 4 m i r 1 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f c hr o mosome8 hi gh co ns erv edbe t w e e n h u m anan d d o g 即danoth e r 妇 胃 0c l u s t e i sl i ein即s t 肥 am o f this c l u s t e r ami r n ac l ust e r com p o s e d o f s mi r n a胡d c d sno r n ac l u 旧 t e r 6 w 七 fo u n d t h a t l 5 m i r n aoc cur i n re pe t i t i veregi o n i n g enome among whi c h 7 l i e in l i ne e l e 们 e n tandt h eo t h e r sr e s i d ein s 刀 习 e e l e r n e n t s s o r n e o fth e 们 口 c o m p l etel yre s i d ei n化 沐石 t i v eregl 呱 andsomeo v erlap 俪th e l eme n t t w m i r n as re si de ini n t r o n o f r r n ag e n e 7 am aj o ri tyofm i r n a s are co ns e rv ed amo n g ani m a l t hr o u g ha na1 y si s m o sto f m i r n as evo l v ed by l oca l t al d e md u p 1 i cati o nandnon i ocald upl ic at 1 o 几l 戊al 翻 川 d e md u p l i c at i o ns re sult inp 田 滋 1 o g o ussc q u e nce s t h atare l o c at ed onth e s ame t r a n sc ri pt no n 一 l o c a l dup li catio ns re sult inp ara o g o us g e n e s org e n e cl uste rson d i fl 七 r e nt c hro mo s o me s 8 w 七 p r e d i ct1 a r g etof1 d e n t 1 fi ed m i r n as us in g 3 一t r f u rt h er皿al ys isindi ca l e 山 以a m aj orityo f ta 飞 e t i n v o l v ed i n a m o stal l ce l l ul arp ro c e s se s for e x 即 的 p l e d eve l o p m e n 丸m e t a bol i s n 比 gu a t o ry facto r ands i gnalt 晓 m sd u ct i o n t 七 em o st rich ed g 0te rm is切 an s c ri ptio nal 伪 c l o r m e an w h l l e 5 o m e m 1 r n as m i ght are invo i v edinp rd ce s ses re l a t e d 诚thcan既 m o stimpo比 知 t l y we i d e n l i fi edt ar g et g e n e 画q 此todog whi ch re gul ate s pe c i alp r o ces se s d u ri ng dog d e v e 1 叩m e n t f i n al l y we fo u n d th at而凡1 8 6 can re g u a l e e x p r e s s i o n o f itsh o stp r o t e i 氏resu it into m o utofitsp r o t e i n t b i s isa self r e g u 1 at o ryfe e d b a ck r n e c h 画 sm k e ywo 川5 m i c ro r n a g e n o m i co r g an i za t i o n p aj 旧 o gous c l u s l e r feed b a c k i n 1 1 b i ti o n 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是本人在导师指导下进 行的研究工作及取得的 研究成果 据我所知 除了文中 特别加以 标注和致谢的 地方外 论文中不包含 其他人已 经发表 或撰写 过的研究成果 也不 包含为获得 南昌大李 或 其他教育 机构的学位或 证书 而使用 过的材料 与我 一同工作的同 志对本研究所做的任 何 贡献 均已 在论文中 作了明 确的说明 并表 示谢意 学 位 论 文 作 者 签 名 手 雕 松 签 字 一 问年 月诊 学位论文版权使用授权书 本学位论文 作者完全了解南昌大李 有关保留 使 用学位 论文的 规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅 和借阅 本人授权南番大李可以 将学位论文的全 部或部 分内容编入有关数据 库 进行检索 可以 采用影印 缩印或 扫描等复制 手段保 存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 手写 命 长 参 导 师 签 名 手 写 了 今 签 字 日 问 年 月 签 字 日 期 间 年 标 对日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 第 1章 综述 第 1 章 综述 引言 rna 是生物体内最重要的物质基础之一 它与 d na和蛋白 质一起构成生命的 框架 但长久以来 rna 一度被认为仅仅是d 卜 a 和蛋白质之间的 过渡气它从dna那 儿获得自己 的顺序 然后将遗 传信息 转化成蛋白质 然而 一系列的研究 表明 这 些小分子r na事实上操纵着许多细胞 功能 它可 通过互补序列的结合反 作用于 d n a 从而关闭或调节基因的表达 m icrorna 而r n a 是新近发现的一种非编码的小 分子rn a 长度大约在17 一 2 5 nt 它们对真核生物的生命活 动的多 方面产生 重 要的 影响 是调节生命活 动的一 个重要调节分 子 目 前己 经知 道它在染色体消 除 染 色体重组 d n a 复 制 以及 基因 调控等方面 产生重要的影响 从目 前所积累 的实 验证据可以肯定它涉及到了整个细胞水平的几乎所有事件 zm i c r orn 八 基因 2 1 1 o r orna的发现过程 而cro r n a的发 现最早要 追溯到上世纪 九十年代 当 时人们是 用遗传 筛 选的 方 法寻找线虫 c el e g a n s 胚胎后发 育的缺 损体 发现了 一个控制 线虫幼 虫发育 时 序性的 非编码基因l in 礴 该基因产生 一对小分 子r n a 其中 一个长 约22nt 另 一个约为6int 较长的r n a可折叠为 茎环样结构 被认为是 较短r n a的前 体11 2l lin 4可抑制l in 一 14基因 表达蛋白质 的水平 而l in 一 14在发 育路径 中起 着 重要的作用 最终的研究结果表明 正是1 访 礴和11 介 14的3 非翻 译区这 种直 接 的但不完全的配对作用是li n 礴调节着 l in 14 的蛋白质合成的原因 即l in 4所编 码的小分子r n a与li n 14 的3 非翻译区的7 个位点不完全互补 结合后 抑制 了 该基因的蛋白 质的 翻译 而l in 礴突变体由 于iin4不能正常的表 达 因而l i n 一 14 就会一直处于无 抑制 状态 它就会一直抑制 线虫从幼虫向 成虫的过 渡 从 而出 现 上述表型p 刃 在相当长时间里 li n 闷被认为是内 源性的小r n a分 子的唯一 例子 第 二个 小分子r n a l et 7 由ruv k u n 实验室发现181 该而r n a也为22nt 同样在 异 时性 基因路 径中发 挥作用 与l in 礴相似 let一 7 r n a识别 靶lin4 l m r n a的3 一 u t r序 第 1 章 综述 列 抑制蛋白 l in一1的水平 lin 礴 和 l et 一 7 r na被命名为小分子时序性 r n a smallt e m po ralrna 19 1 叮 li n 4和iet 一 7 在 所 有 的 线 虫 亚 种 中 呈 现出 进化 上的 高度保守 性 其同源物在 软体动物 海鞘 小鼠 和人类中 也能 够检测到 这种广 泛存在的高 度保守 性有力 的说明了m i r n a在发育过程中的 重要的调节作用 这 一观点正已 经被线 虫的 各个器官所鉴定的m i r n a的 功能所证明 li n 4现在被 认为 是m icrorna 分 子 的 奠 基 性 成员 111 i 对 m i cro r n a指导的基因调节的研究成果集中于寻找更多的 m i r n a和它们 所调节的 靶分子及其 功能等方面的 研究 近来的 研究表明 m i r n a的 功能包括 对细胞分化的 控制 细胞死亡 代谢以 及造血千细胞分 化等等 11 5 1 81 1 2 2耐r n a 基因的结构特征 目前 在不同 物种中发 现的 绝大多数 而rn人长度一 般为 2 2 nt 其中 21 2 3 n t 长度的mir n a占大 多数 约为 8 钱 mir n a的一个特点是它的前 体常形成 分子内茎 环结构 而且含有大量的 g l 碱基对 这个前体物经过核酸酶的加工形成成熟的 m i rn a ll 3 19 2 1 如同线虫的 li n 4和 l et 7 一样 大部分m i r n a基因与己注释基因相距较远 提示他们来自 独立的转录单 位 然而 相当多的分子来自p re 一rn a中 的内 含子 这些 mi r n a常与预期的 m r n a以同一方向排列 提示这些 m i r n a并没有 自己 的启动子 这种组织形式为m 1 r n a与蛋白的共同表达提供了便利的机制 同时 也 解 释了m ir n a与 宿 主m rna 之间 的 保 守 关系 1侧 22 创 10 然而近来研究表明 大多数哺乳动物的 m i r n a位于转录单元 t u 内 通 过即时更新的基因组装配以及 e s t数据库 人们发现许多以前位于基因间隔区 的 m 1 r n a位于内 含子中 有时 候由 于选择性剪接方式 m 1 r n a位于同一个 pre一 m rna 的 外 显 子 或 者 是 内 含 子 中 4l 根 据m irna 基 因 组 位 置 m irna 可以 分为下列 几种 1 位于编 码蛋白 质的转录单元内 的内 含子中 2 位于非 编码转 录单元的内 含子中 3 位于非 编码转 录单元的外显 子中 见图1 1 混合m i r n a 依据剪接模式的不同 而成为以上一种基因 组织形 式 一些内 含子mir n a的位置 在 许多 物 种 中 是 非 常 保 守 的 3 5 7 川 另 外一些m i r n a基因 在基因组中和表达模式中成簇排 列 意味着 它们的转 录以多 顺反子形式的 原初转录本进行 在人类基因 组中 大约50 的己 知m i r n a 成簇表达 而且一个簇的m1 r na经常是彼此相关的 而一个簇中也包含了不相 关 的 m i现 1 4 3 1 1 目前 有研究发 现 m i r n a基因可 能也 来自 于进化过程中出现的假 基因 在 人的 m i n r a基因中 mi r 2 20 和 m i r 4 92 各自位于一个加工的假基因中 这说 第 1 章 综述 明m i r n a在进化过程中可能出 现了重复以及发生了 变异 同时也表明了 有一部 分m 1 r n a是来自 于假基因中 25 一 10 几乎所有已经克隆的而r n a在相近的动物中保守 如人与小鼠 或秀丽线 虫和布氏线虫 许多m i r n a在动物中具有更为广泛的保守关系 例如 大于三 分 之一的 线 虫m ir n a可以 很 容易 在人 的m ir n a中 找 到 同 源 物 13 5川 如 果比 较 更远一点的物种 相当多的基因家族的扩大或缩小非常明显 最令人吃惊的例子 是l et 7 家族 它在线虫中有四个相同的成员 在人中至少有巧个 但在果蝇中 只有一个11 0 22 气 与植物m i r n a前 体相比 动物而r n a前体分子的长度变化较小 大多数 在7 0 一 8 0nt 之间 一部分而r 卜 a常以单拷贝 形式存在于基因组中 一 些m 1 r n a 的前体分子常以两个或多个拷贝 存在于不同染色体或者是同一染色体不同的位 置上 某些m i r n a来自 两个或多个仅有微小差异的 前体12 峨 6 刀 偏码蛋自质转最单元 非编码转最单元 非拐码转最单元 非翻译区 图1 l m ic m 阴a 的 基 因 组 织 形 式 fi g l l o e n o m ico 飞 ani皿i o n ofm i c ror n a 1 3丽r n 的生物合成 1 3 1 丽rna 生物发生的基本概况 成熟的mirna 是一种长约1 9 一 2 5 nt大小的单链r na 而编码mir na 的 基因则位 于基因间区或基因的内含子中 m irna 的形成需要经历如下阶段 基因的转录 原始转录本 p r i mar ym i r n a p r i 一 m i r n a 的加1 m i rn a前体分子 m i r n a p r e c u s o r p r e m i 朋a 转 运 p r e 一 m i rn a的剪切及 m i r n a 链的 选择共 5步 最后 形 成具有生物学功能的 成熟 单 链 mir naiz 峨 7 1 之 5 1刀 它可 以 组合 进入 刚 a诱 导的 沉默复合体 rna i n d u c e d s i l e n c i n g c o m p l e x r i s c 中 进而引起靶 m r na 的降 解或翻译的抑制 而m i 朋a究竟发挥哪种作用 是由 耐rna 与靶诫na之间的互补 程度决定的 硬加 引 1 当 二 者完 全 匹配时 引 起靶 rn a 的降 解 二者不完 全 匹 配时 第1章 综述 则引起靶m rna翻译的抑制 在耐r n a的生 物发生过程中 mir na 基因的 转录是由r na多聚酶1 工 p ol l l 催化完成的 形成 p ri一 耐rna 然后 p ri一 mir na 在 细胞核中的一 种 微处理器 m i c r o p r o c e s s o r 蛋白 质复合体的作用下 产生具 有特征 性的大 约7 0n t 大小 的发夹 状p r e 一i rna 生成的 p r e 一 m i r n a在核转运受体e x p o r t i n 一 5 e x p 一 5 的作 用下 转运到细 胞浆中 细胞浆中的 p re一i rna在d i c er 的作用下 剪切产生大 约22 nt大 小的双 链m i rna 见图1 2 1 孤 321 其中 只有一条单链可以 选择性结 合到r i sc 中 去而成为 成熟耐rna 一般而言 成熟的 mir na 多为具有 5 端小突 起的那条链 价 州侧峪 袱 七 j p c 月 喃 贫 几 1 路 1 此 组钳4卜 工紊 内 j 妇 1 妇 沼 1 州匀 一口 叮 弓厂j 州 们 图 1 z m i c r o r na 的成熟加 l 过程 f i g l 2 m at u ra t ionan d p roces s i n g o f m ic r 0 r n a 3 zm i rna 加工的核内过程 m i r n a 在细胞核中经历了从最初的m i r n a 基因到大约7 o nt 大小的 m i r n a前体阶段 在这个过程中 有多 种不同的 细胞 核内 蛋白 质的参与 这些 蛋白质相互协调作用 保证mi r n a在细胞核内的正常加工 研究已 经发 现m 1 r n a 的 基因绝大部分定位于基因间区 也有一部分 位于基 因中的非编码区域 即内 含子中 这 些m i r n a 的基因一般由 r n apom 进行转录 生 成 的 州一m i r n a长 达 几 千 个 碱 基 有 帽 子 结 构 cap st 川 c tl 叮 e 和 po ly a 尾 同 时 具有一个或几个局部 的发夹状结构 以多顺反子形式存在 最近的 研究还发 现大 约5 溅 的 m i r n a基因 彼此相 邻 簇集 存在 带有自 己 独立的转录启 动子 可见 m i r n a的基因 也类似 于其他的基因 在不同的 发育阶段及不同的 组织类型中 处 在 po l n的 精 确 调 控 之 下 33 调 目 前 推 测由 r n a pom指 导 的 转 录 可 能 具 有 如下的 优点 m 1 r n a基因的 转录可以 被不同的 pol ll调节因子所控制 从而 第 1 章 综述 使得在不同的发 育阶段 不同的细胞类型中 表达特异的 m i r n a m i r n a 和 编码蛋白 质的 基因表 达可能存在彼此协调的作用 尤其是 二者同时位于一个转录 本时更为明 显 斌 3 飞 从 如一i rn a到衅一i r n a 的加工 需要细胞核中 一种叫做微处理器的复合 体的作用 在其 作用 下 pri m 1 rn a 被 加工成为 p r e m l r n a 这一过程在细胞核 中完 成 细胞核中的 微处理器在不同的生物体中 所包含的成分不尽相同 在线 虫 果蝇及 哺乳动物 体内 该复合体至少 包含有两种蛋白 质成分 分别为d 印 s ha 和p asha p 侧 rt n e r ofd 印 sha 在人 类 p as h a 又称为 dig e o r g e综合征关键区域基 因 8 di g eo rge synd ro m e 币ti cal re gi o n ge nes d ocrs 阳6 3 81 1 3 3m i o r orna加工蛋白 dicer 酶是内 切核酸酶rnase ln家族成员 对它的 最早认识是来自 对rna 干涉 过程中sir nas 的产生的研究 后来表明它在m i r na 的成熟过程中起着同样重要 作 用 口 说 d ic er 酶 包 括 pa z 结 构 域 及 含 有 d e x h d e ah 盒 的 rn a 解 旋 酶 结 构 域 近 来通过x 射线晶体衍射分析及核磁共振 阳r 获得了队2 结构域的三维立体结构 表 明 它 具 有 异 常 的 ob 折 叠 结 构 其 与 核 酸 的 亲 和 性 较 弱 但 持 久 f35 叨 研究 发现 p a z 结构域具有一条由两个亚结构域所形成的沟 可能是rna 结合区 其中一个亚 结构域具有一个由 五条多肤链组成的开放p 桶芯结构 两 条螺旋位于桶的 两个末 端 以及另一条链位于桶的外表面 另一个亚结构域是由连有 螺旋的日发夹结 构组成 因而d i cer 酶是通过 队2 结构 域与 p re一 m i r na之间 的相互作 用而行 使切割 功能的134 3 010 d r o s h a 大约1 6 0 k d a 大小 全长大 约1 3 0 0 个 氨基酸 是rn a 酶1 1 1 rna s e l l l 家族成员之一 包含 有一个 脯氨酸富 集区 精氨酸 一 丝 氨酸富集区 两个rna 酶1 11 结构域和c 端的一个双链r n a 结合结构域 d o u b l e 一 s t r a n d e drna 一 b i n d i n g d o 呱i n d s r b d 朴 dr o s h a 在线虫 果蝇以及人类中 具有保守性 d r o s h a 在果 蝇体内形成一种大约s o ok 兔大小的复合体 而在人类体内形成的复合体大约 650k da 大 小 这 一 复 合 体 即 微处 理 器 135 40 d ro sh a 的 主 要 作 用 是 剪 切 pri ir n a 形成具有3 端z nt悬垂的p re ir na 此为rnaseih 作用的主要 特征 生成的 pre 一i rn a 的具 有3 端 znt悬垂的末 端即为成熟m i rna 的一 端 而mi 朋a 另一端是 由 d i c e r 在距离已 知末 端大约 2 2 n t 的 位点 上剪 切而成的 可见 d rosha 的加工决 定着m i rna 的真正序列 其加工的特异性是mirna 的整个生物发生过程中特异性最 高的 研究发现 p r i 一 mir na的三维结构是底物特异性的 主要决 定因素 剪切位 点附近双链的茎 部结构和末 端的环 状结 构 10 nt 也 是非常关键的 135 一 91 而且 drosha复合体可以测量茎部的长度 一般在距离末端的环状结构约2 个螺旋转角 第 1章 综述 h e l i c a lt u r n 大约2 2n t 的地方进行剪切 此外 研究还发现d r o sha 间接地 参与了前 核糖体r na的 加工14041 微处理 器的另一个关键成分是p ash a p asha为d srn a 结合蛋白 参与 d rosha 对底物的识别 抑制该基因的表达可以使pri 一 mirna 在细胞核中的堆积增加 d gcrs是第 一个被鉴定出 来的参与体内 mi朋a加工过程的p asha 进化上具有保守 性 约12 ok da 大小 包含有两个ds洲a 结合 结构 域和一个已知的 可以与脯氨酸 富集的多肤相互作用的w份结构域 民c rs 的释结构域很可能是与d rosha 的n 端 脯氨酸富集区发生相互作用的部位137 一 dgc rs是染色体的2 2 q ll 2 的预测的30 个基因中的 一个 在人类最常见的遗传综合征 o i g eo r ge综合征中非等位性缺 失 所以 有人推 测d i g eorge 综合征的发病可能与人类 mirna的加 工和表 达过程 的 紊乱有关 口 9 引 1 1 3 4微处理器对pri i r na的剪切机制 drosha 对p ri一 毗rn a 转录本进行特异 性识别的机 制尚未完全明了 研究发现 drosha对发夹状茎环结构有一定的亲和力 而且d rosha 也通过一些可以特异识别 p ri 一 mirn a 的中 介因子而招募p ri一 m i rna 到其剪切位点上进行剪切 p as ha 即为 一 种已经发现的有助于d r o s h a进行底物特异性识别的蛋白质 h an 等提出了关于 pr i 一 丽 rn a剪 切 机 制 的 一 个加 工中 心 的 模型 1401 该 模型 认 为 d ro sh a 与 p as ha 形成异二聚体 对 p ri一 mir n a的茎环状结构部分 进行剪切 其中 d r osh a结合 在远离末端环的 双链rn a 上 两 个rnase hi结构 域 r l 工 i da 和r hi d b 形成分子 内 二聚体 构成 一个加工中心 加工中 心中的两 个活性位点紧 密相邻 在距离 末 端环约两个螺旋 转角的地方 在相反方向 上剪切 r na 链 上邻近的磷酸二酷键141 1 rl工 i da一侧的催 化位点催化3 链的剪切 而r l l l db一侧的 催化位点则催化5 链 的剪切 活性中 心位点由 对应于超耐 热菌 a q 叮伦万 aeoiz c u 川 钓 朋 ase i h 中谷氨 酸e 4 0 天冬 氨酸d 44 d i o 7 和ello 而 pash a则结合在靠 近末端 环状结构的部分 有助于p ri i r 卜 a 的 识别及微处理 器在底物分子上的定向l 2 3 spr行 i r n a 的 细胞核输出 drosha对pri 一 而rna 加工完毕之后 产生的pre 二i rna 需要 输出 到细胞浆中 才 可以在d i c er作用下生成大约22 nt大小的mirna 双链 这一输出过程需要 pre 一 耐rna 在核孔转运受体的作用下穿过位于核膜上的核孔复 合体 而进入细胞 浆中 135 刀3 司 现 在已 经 确 定 进行 p re i rn a输出 的 主 要 核 孔 转 运 受 体为 e xp 一 50 除 此之外 e x p 一 5 可以 少量地输出 t r na和腺病毒rnav a e xp 一 5 对 底物进行 识别的 第 1 章 综述 特异 性是由 底物所具 有的 特征性 微小螺旋 所决定的 与序列 无关 该螺旋中 包含有大于1 4 b p 碱基对 的茎部和 3 一 s nt的 3 端悬垂 而pre 一i rna 所具有的 类 似的茎部结构和大约znt的3 端悬垂使得e xp一 5 对其的亲和力远远高于其他 两 种底物 而 且pre i r 刊 a 在细胞中 的含量相当高 所以 很可能pre 一 mi rna 就是e xp一 5 进行 输出的 主要底物 exp s 与r an 一 gtp 以及pre m i 刚a 形成异三聚体 通过核孔到 达胞浆后 r a n 一 tp转变为 r an劣dp 释放出 pr鲡 i r na 此外 还发 现pre 二i r n a 与 ex p 一 5 结 合 之后 还 可以 稳定 pr e 一 毗 rn ala 401 t 4llticr峨na 的作用机制 mir na 能够通过两种沉默机制中的一种指导r l sc下调目的基因的表达 r n a 的切割或翻译抑制 如果m rna 与mirna 具有完美的互补性 耐r na就指导m r na特异 性切割 或者如果两者没有足够的互补性 则而rna 就指导翻译抑制 见图1 3 4 1 丽r 湘指导靶m 倪 以的切割 大多数植物mir na与靶序列的开放阅读框 o r f 完全匹配 因而在植物 中 mi即a 主要进入rna 千涉途径以降解靶分子 植物中的r l sc是由arg o n a u t e ago 蛋白 血rna 或51删a 及相关蛋白 组成 3i一 a go蛋白具 有与d i cer 酶一样的p az结构 域以及 p l wj结构域 pl雨结构域具有与r nas 州类似的结构 据 报道 mirna 的 3 末 端位 于paz 结构域的亲水性结构域内 而靶分 子位于 pl肛结构 域中 两者识别互 补之后 刚a 酶水解作用于靶分子中与 mir n a 的第11或第12碱基 所对应的残基的磷 酸 键 随后 降解靶分子的 5 端序列 因 而当 m i rna 指导切割时 切点的 位置是由 相 关的 mi r 刊 a 的 残 基 所 决 定 即 从 配对 区 的中 部向 m rn a 的 5 方向 切 割 13 1 在 植 物 中 两者完全匹配在大多数情况下是引起切割 但是有时并非如此 m ir一 17 2 与 成r 一 17 2 样基因与 靶分 子完全匹 配却 产生翻译抑制 研究人员发 现 经过切 割之后 靶分子上与 耐r 漱匹配位点相邻 的序列会产生内 源性的sir na 以 增强沉 默效应 m ir na切割之后 耐rna 仍然是完整的 而且能够指导另外的m rna 的识别和切割队 铆 1 4 2翻译抑制 通常动物mirna 与靶m 翩a 的3 一 u t r 部分序列反向互补结合 与rnai不同的是 靶mrna的稳定 性不 受影响 而其 翻译起始后的表 达受到影响 这种新的调控机制 首次 在 线虫 的l i n 一 14 m r na得 到 证实 l i n 一 1 4 m rn a 受l i n 一 4 丽 洲 a 的 调控 135 1 第 1 章 综述 m i r n a 可能 抑制翻译的延伸或终止 或降 解核搪体新合成的新生肤链 然而简单地 影响翻译延伸是不可能的 因为未受到抑制的多核糖体的形态与由 耐r na抑制的 靶mrna 的多核糖体的形态是相同的 当lin 一 14蛋白水平下降时 难以区分处于线 虫幼虫第一阶段和幼虫后期阶段的l i n 一 14 m r n a 的多核搪体外型 具体的调控机 制目 前 还 不 是 很 清 楚 有待 于 科 学家 进一 步 研 究 1391 多 数 mi rn a 是以 m ir np形式与 靶m r n a 结合并使之抑制 最近研究人员发现 处于不稳定状态的袱n a的3 一 u tr 中的富含a u 元件 a r e s 能够指导m r na的降解 参与m irna加工和功能行使的蛋白 即d ice r 一 1 a g ol和a g o 2 是q 肿瘤坏死因子mrna快速降解所必需的 该m r n a 含有 a r e s 元件 人的mir 一 16具有与a r es互补的u a 从u a uu 序列 它使得具有a r e s 的rna 易于降解137 40 1 4 3靶分子的识别 线虫l i n 一 1 4的3 一 u t r 具有与l i n 一 4 m i r n a的5 区域互补的核心区域 这说 明 多 细 胞 动 物 mi rn 人 5 端互 补的 重 要 性 123 这可 从以 下 事 实 得 到支 持 l 几 种 无脊椎动物的mirna的2 8残基与靶m rzna3 utr是完全互补的 2 在第一 个确认的无脊椎动物的 mirna 与靶分子的互补位点之间 诫n a 与耐rna z 8残基 配对的部分在其它种类的同源信息中是完全保守的 一个邻近的至少六个碱基对 的螺旋几乎总是出现在这个区域 3 mirna 的2 8 残基在同 源的后生动物mir na 中是保守的 4 预测哺乳动物丽rna 的靶分子时 要求跨越mir n az一8 残基的七 聚体具有完全的碱基配对 比要求m i rna 的其它任何一个七聚体的配对更有效率 6 2 乃 如果 不考虑互补位点其它区域的互补程度 与核心区 域的错配就可抑制起 始时对靶分子的识别 因而阻止了切割或翻译抑制 如果同时允许mir na的其余部 分有足够的配对 将产生切割作用 然而仅由 一些侧翼配对来补充核心配对 再与 ri sc 共同 作用 足以 介导 翻译 抑制131 一381 1 4 4快速脱腺昔酸化 枷 等人以 mir 一 1 2 5b和l et一 7 两种代表性的mir na为研究对象 以启动子一 荧光 素酶或p 球蛋白为报告系统发现它们能够促进m rna 聚腺昔酸尾巴 p oly at ail 的 去 除 135 刁 9 研 究 人员 用3 组 蛋白 茎 一 环 结 构 取 代聚 腺 昔 酸 尾巴 结 果发 现不 但 可以消除 m ir一 1 2 5 b对m r n a 含量的影响 还可以降低对蛋白 质合成的作用 由 此 可知 耐rna 通过降低