（分析化学专业论文）动物源性食品中磺胺和氟喹诺酮类兽药残留分析方法研究.pdf

摘要 摘要 本文共分四章。 第一章：文献综述，概括了动物源性食品中兽药残留分析方法的现状和进展情况。 对磺胺类药物和氟喹诺酮类药物进行了简要介绍，详细总结了样品前处理技术和兽药残 留检测技术的发展情况，以及这些技术在动物源性食品中磺胺类和氟喹诺酮类兽药残留 分析中的应用。 第二章：本文建立了一种同时测定猪肉中3 种磺胺和7 种氟喹诺酮类药物残留量的 固相萃取一高效液相色谱法。样品经2 醋酸乙腈提取，正己烷脱脂，过e n v i 1 8 固相 萃取柱净化。使用s h i m a d z u v p o d s ( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 r t m ) 色谱柱，以甲醇0 0 2m o l l 磷酸盐缓冲液三乙胺系( 体积比为2 5 5 7 4 5 ，p h 2 8 0 ) 为流动相，采用二极管阵列检 测器进行测定。l o 种药物在o 1 m g l - 5 0 m g l 浓度范围内线性良好，相关系数均大于 0 9 9 9 9 。检测限( l o d ) 为3 4 0 1 t g k g , - , 9 0 0 1 x g k g ，定量限( l o q ) 为11 3 3 1 a g k g 3 0 0 0 i t g k g 。 样品的平均加标回收率在6 9 1 0 4 之间，r s d 5 ( n - 3 ) 。 第三章：本文建立了高效液相色谱一二极管阵列检测法同时测定鸡肉中磺胺类和氟 喹诺酮类兽药残留量的测量不确定度评定方法。通过建立数学模型，分析不确定度的来 源，对各不确定度分量进行量化，给出了3 种磺胺和7 种氟喹诺酮类药物测定结果的扩 展不确定度。 第四章：本文建立了一种同时测定鸡肉中3 种磺胺和7 种氟喹诺酮类药物残留量的 高效液相色谱一电喷雾串联质谱方法( h p l c e s i m s m s ) 。样品经2 醋酸乙腈提取， 正己烷脱脂，过e n v i 1 8 固相萃取柱净化。以乙腈和o 0 5 甲酸溶液作为流动相，采用 梯度洗脱程序进行液相色谱分离，质谱检测器进行定性和定量分析。1 0 种药物在 o 0 2 m g l , 一2 o m g l 浓度范围内线性良好，相关系数均大于0 9 9 8 8 。检测限( l o d ) 为 1 1 0 脚 6 8 5 “g k g ，定量限( l o q ) 为3 6 8 “眺g 2 2 8 5 p g k g ，样品的平均加标回收率 在6 8 9 9 扣1 0 2 6 之间，r s d 8 6 ( 刀- 3 ) 。 关键词动物源性食品；兽药残留量；磺胺；氟喹诺酮；高效液相色谱；固相萃取；不 确定度：电喷雾串联质谱 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i st h e s i sc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r s i nc h a p t e ro n e ，t h ec u r r e n ts t a t ea n dd e v e l o p m e n to fa n a l y t i c a lm e t h o d so f v e t e r i n a r y r e s i d u e si na n i m a lf o o da r es u m m a r i z e d b a s e so fs u l f o n a m i d e sa n d f l u o r o q u i n o l o n e sa r ei n t r o d u c e db r i e f l y n em e t h o d so fs a m p l ep r e t r e a t m e n ta n dv e t e r i n a r y r e s i d u e sd e t e r m i n a t i o na r es u m m a r i z e ds y s t e m i c a l l ya n dt h e s em e t h o d sa p p l i e dt or e s i d u e a n a l y s i so fs u l f o n a m i d e sa n df l u o r o q u i n o l o n e sa sw e l l i nc h a p t e rt w o ，am e t h o dh a sb e e ne s t a b l i s h e df o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o n $ o fr e s i d u e so ft h r e es u l f o n a m i d e sa n ds e v e nf l u o r o q u i n o l o n e si np o r kb ys o l i d - p h a s e e x t r a c t i o na n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h es a m p l e sw e r ee x t r a c t e dw i t h2 a c e t i ca c i d a c e t o n i t r i l ea n dd e f a r e dw i t hn - h e x a n e ，t h e np u r i f i e db ya l le n v i - 18s o l i d p h a s e e x t r a c t i o nc o l u m n t h e v e t e r i n a r yd r u g s w e r e s e p a r a t e d o ns h i m a d z uv p - o d s ( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 1 x m ) c o l u m nu s i n gam o b i l ep h a s eo fm e t h a n o l - 0 0 2m o l lp h o s p h a t e b u f f e r - t r i e t h y l a m i n e ( v ，v = 2 5 5 7 4 5 ；p h 2 8 0 ) a n dd e t e c t e d 埘t 1 1d i o d e - a r r a yd e t e c t o r g o o d l i n e a r i t yw a si nt h er a n g ef r o m0 1 m g lt o5 0 m g la n dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r ea b o v e 0 9 9 9 9 1 1 1 el i m i t so fd e t e c t i o n ( l o d ) w e r e3 4 0 1 t g k g 9 o o r t g & ga n dt h el i m i t so f q u a n t i f i c a t i o n ( l o q ) w e r e11 3 3 p g k g - 3 0 o o p g k g n l cm e a nr e c o v e r i e so f1 0v e t e r i n a r y d r u g sr a n g e d f r o m6 9 t o10 4 诵mr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sb e l o w 5 伽= 3 ) i nc h a p t e rt h r e e ，a ne v a l u a t i n gm e t h o do fm e a s u r i n gu n c e r t a i n t yh a sb e e n e s t a b l i s h e df o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o n so fr e s i d u e so fs u l f o n a m i d e sa n d f l u o r o q u i n o l o n e si nc h i c k e nb yh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dd i o d e a r r a y d e t e c t i o n b ye s t a b l i s h i n gm a t h e m a t i c a lm o d e la n da n a l y z i n gt h es o u r c e so fu n c e r t a i n t y , t h e c o m p o n e n t so fu n c e r t a i n t yo fm e a s u r e m e n tw e r eq u a n t i z e da n de x p a n d e du n c e r t a i n t i e so f m e a s u r i n gr e s u l t so ft h r e es u l f o n a m i d e sa n ds e v e nf l u o r o q u i n o l o n e sw e r es h o w n i i lc h a p t e rf o u r , am e t h o dh a sb e e ne s t a b l i s h e df o r t h e s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n so fr e s i d u e so ft h r e es u l f o n a m i d e sa n ds e v e nf l u o r o q u i n o l o n e si nc h i c k e nb y n a b s t r a c t h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - e l e c t r o s p r a y t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ( m l c e s i - m s m s ) t h es a m p l e sw e r ee x t r a c t e d 研t 1 12 a c e t i c a c i d a c e t o n i t r i l ea n d d e f a r e d 谢mn - h e x a n e ，t h e np u r i f i e db ya ne n v i 一1 8s o l i d p h a s ee x t r a c t i o nc o l u m n t h e h p l cs e p a r a t i o nw a sp e r f o r m e dw i t hag r a d i e n te l u t i o np r o g r a mo fa c e t o n i t r i l ea n dw a t e r ( c o n t a i n i n g0 0 5 f o r m i ca c i d ) a sm o b i l ep h a s e t h ei d e n t i f i c a t i o na n dq u a n t i f i c a t i o nw e r e d o n ew i t hm a s ss p e c t r o m e t r y g o o dl i n e a r i t yw a si nt h er a n g ef r o mo 0 2 m g lt o2 0 m g la n d c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r ea b o v e0 9 9 8 8 t h el i m i t so fd e t e c t i o n ( l o d ) w e r e 1 1 0 l - l g k g - 6 8 5 “g k ga n dt h el i m i t so fq u a n t i f i c a t i o n ( l o q ) w e r e3 6 8 9 9 k g 2 2 8 5 1 x g k g t h em e a nr e c o v e r i e so f10v e t e r i n a r yd r u g sr a n g e df r o m6 8 9 t o10 2 6 w i t hr e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n sb e l o w8 6 伽= 3 ) k e y w o r d s ：a n i m a lf o o d ；v e t e r i n a r yr e s i d u e s ；s u l f o n a m i d e s ；f l u o r o q u i n o l o n e s ；h i 曲 p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ；s o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ；u n c e r t a i n t y ；e l e c t r o s p r a y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y m 河北大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了致谢。 作者签名：壹宝日期：上煎l 年月互日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论 文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密, o 。 ( 请在以上相应方格内打“”) 作者签名：薹宝 导师签名： 壶j 盔蔓 日期：塑1 年上月羔已一日 日期：趁毕年上月丝日 保护知识产权声明 ( 委宣 ) ，是河北大学化学与环境科学学院的( 二o o h )届 (硕士) 研究生。 本人为获得河北大学( 理孚颐士) 学位证书所提交的题目为： ( 糊原段铷中磺i 擀稚诺酮糟苘舳晰方法碗 ) 的( 理哮硕士 ) 学位论文，是我个人在导师(刹怠岩教授) 指 导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在河北 大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并 严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以 及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本人以任何形式公开和传播科研成果和科研工作时， 包括发表的学术论文、学术交流、科技咨询和科技成果转让等行为时，如 果涉及到本论文所包含的研究内容和研究成果，本人将征得指导教师 ( 文! i 黼教授) 和河北大学的书面同意和授权。如果违反本声明，本人 承担法律责任。 声明人：签名( 章) 姜宁 日期：2 0 脾了月胡且 第1 章绪论 第1 章绪论 摘要综述了动物源性食品中兽药残留分析方法的现状和进展情况。对磺胺类药物和氟 喹诺酮类药物进行了简要介绍，详细总结了样品前处理技术和兽药残留检测技术的发展 情况，以及这些技术在动物源性食品中磺胺类和氟喹诺酮类兽药残留分析中的应用。 关键词兽药残留；磺胺；氟喹诺酮；动物源性食品；综述 1 1 引言 近年来，随着我国养殖业现代化、集约化和规模化生产的发展，兽药得到了广泛的 使用。目前，兽药种类繁多，主要包括抗生素、合成抗菌素、抗寄生虫药、生长促进剂 和杀虫剂等。这些兽药在降低动物发病率与死亡率、促进动物生长和改善产品质量上起 到了非常重要的作用。但是，有些不法饲养者在经济利益的驱动下非法滥用这些药物， 造成残留在动物源性食品中的药物超标。兽药残留( r e s i d u e so f v e t e r i n a r yd r u g s ) 就是 指食品动物用药后，动物产品的任何食用部分中与所有药物有关的物质的残留，包括原 型药物或和其代谢产物【l 】。虽然动物源性食品中的兽药残留水平通常很低，但大多数兽 药与医药完全相同，这种由于长期和广泛的非治疗性用药方式而导致的残留问题会对食 用者的身体健康和生活环境产生一定的危害。兽药残留主要会产生各种慢性、蓄积毒性， 如“三致( 致癌、致畸、致突变) 力、免疫毒性、发育毒性和生态毒性等，对食用者的 身体健康和生活环境的危害往往具有隐蔽性，易造成实质性和难以逆转的危害【2 】，如氯 霉素可引起再生障碍性贫血，硝基咪唑类药物具有致癌作用等。此外，尽管兽药引起急 性中毒的可能性很小，但少数药物如盐酸克伦特罗( 瘦肉精) 残留仍可引起人急性中毒， 甚至致人死亡。 兽药残留问题严重危害着人们的生命安全，世界各国都对兽药残留问题引起了高度 重视。欧美发达国家早在2 0 世纪8 0 年代就开始了这方面的研究，并制定了食品中兽药 河北大学理学硕士学位论文 残留的最高限量( m r l ) 和每日的摄入量( a d i ) 。而我国在2 0 世纪9 0 年代才开始这 方面的研究，起步相对较晚。2 0 0 2 年，我国农业部对1 9 9 9 年发布的动物性食品中兽 药最高残留限量进行了修订后，现已对2 2 8 种兽药做出了相应规定，而我国农业部目 前颁布的兽药残留检测标准仅有3 9 种【l ，3 4 】。我国兽药残留监控体系的不完善严重影响了 动物源性食品的出口贸易，给我国造成了巨大的经济损失。例如，2 0 0 2 年，我国因出口 欧盟的水产品中被检测出氯霉素残留而遭到全面禁运，损失就高达6 亿多美元【5 】。因此， 发展可靠、灵敏和实用的残留分析技术对于检测和控制兽药残留、保证食用者安全和避 免国际间有关贸易争端就显得尤为重要。 1 2 磺胺类药物和氟喹诺酮类药物介绍 1 2 1 磺胺类药物 磺胺类药物( s u l f o n a m i d e s ，s a s ) 是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称 ( s a s 的基本结构如图1 1 ) 。s a s 一般为白色或微黄色结晶粉末，无臭，基本无味，因 为其结构中含有伯氨基和磺酰胺基而呈酸碱两性，可溶解于酸碱溶液中。由于其结构中 带有苯环，各种s a s 均具有紫外吸收。s a s 能够通过干扰细菌的酶系统对对氨基苯甲酸 的利用而起到抑菌作用。从1 9 3 2 年发现至今，s a s 的种类可达数千种。其中，疗效好、 毒副作用小的s a s 就有几十种。由于抗菌谱广、性质稳定、价格低廉，s a s 在对于预防 和治疗食源性动物的细菌感染性疾病上得到了广泛使用。近年来，该类药物的滥用现象 非常严重。不管通过任何途径，摄入的s a s 都会在人体中蓄积，其残留能够破坏人的造 血系统，产生白细胞减少症、粒细胞减少症，并可致溶血性贫血；引起人的过敏反应， 严重者甚至出现死亡；损害人的泌尿系统，出现血尿、疼痛、尿闭等症状。此外，不合 理的使用s a s 还能够导致许多细菌产生抗药性，从而影响临床治疗。由此可见，动物源 性食品中的残留磺胺对人类的身体健康会产生很大的危害。目前，国际食品法典委员会 ( c a c ) 和欧美等大多数国家规定食品和饲料中的磺胺类药物总量及磺胺二甲基嘧啶等 单个磺胺类药物的含量不得超过1 0 0 p e , k g ，日本规定食品中不得检出磺胺类药物，而我 国规定所有食品动物的肌肉、脂肪、肝、肾和牛羊奶中的磺胺类兽药总量的m r l 为 1 0 0 9 9 k g ，牛奶中的磺胺二甲嘧啶的m r l 为2 5 k g 。截止到目前为止，我国农业部已 第1 章绪论 发布了4 条关于动物源性食品中磺胺类兽药残留的检测标准，包括了磺胺嘧啶( s d ) 、 磺胺间甲氧嘧啶( s m m ) 、磺胺地索辛( s d m ) 、磺胺二甲嘧啶( s m 2 ) 、磺胺甲氧嗪( s m p ) 、 磺胺甲嗯唑( s m z ) 、磺胺喹嗯啉( s q ) 和磺胺对甲氧嘧啶( s m d ) 共8 种磺胺类药物， 均采用高效液相色谱法进行测定。 h 2 n 图1 1s a s 的基本结构 f i g 1 - 1s t r u c t u r e so fs a s 1 2 2 氟喹诺酮类药物 喹诺酮类药物( q u i n o l o n e s ，q n s ) 是近2 0 年来迅速发展起来的一类十分重要的广 谱抗生素，是继磺胺类药物之后人类在合成抗生素方面最重要的突破。q n s 均为白色或 淡黄色晶型粉末。游离酸形式一般易溶于稀酸、稀碱溶液和冰醋酸，在p h 6 8 的水中 溶解度最小，在甲醇、氯仿、乙醚等多数溶剂中难溶或不溶；盐形式易溶于水，但不溶 于冰醋酸。由于多数q n s 在c 3 位含有羧基，c 7 位连接哌嗪等含氮碱性基团，因此属 酸碱两性化合物。q n s 结构中均含有苯并杂环或并杂环骨架和羰基、羧基、杂原子等生 色团或助色团组成的共轭体系，在紫外区具有特征性和强的吸收。其作用机理主要是它 在细菌体内能够选择性的抑制在d n a 合成中起作用的两种酶：拓扑异构酶i i 和，从 而干扰了细菌d n a 的复制、转录和修复重组，使细菌无法传代而被抑制【6 】。此类药物 抗菌作用强大，抗菌谱较广，主要对抗革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌也有相当作用； 其表观分布容积大，体内的分布较广，可进入大多数药物不能进入的骨、关节和前列腺 组织等；副作用小( 无青霉素、氯霉素类所致的致命反应) ，有较长的p a e ( 抗菌后效 应) 。 自从1 9 6 2 年第一个喹诺酮类药物萘啶酸问世以来，喹诺酮类药物已经发展到第四 代。虽然第四代喹诺酮类药物抗菌效果更好，但是价格较为昂贵，因此第三代喹诺酮类 药物仍然是目前临床应用最多的主流产品。第三代喹诺酮类药物的主要代表有环丙沙星 ( c 口) 、诺氟沙星( n o r ) 、依诺沙星( e n o ) 、培氟沙星( p e f ) 、氧氟沙星( o f l ) 、 r hn o i 卜i o 河北大学理学硕士学位论文 恩诺沙星( e n r ) 、洛美沙星( l o m ) 、麻保沙星( 眦) 等。在结构上，第三代喹诺 酮类药物的喹啉环( 个别为萘啶环) 的c 6 位上有氟原子，c 7 位上连接哌嗪基或吡咯 基，亦被称为氟喹诺酮类( f l u o r o q u i n o l o n e s ，f q s ) 。其基本结构如图1 - 2 。与前两代喹 诺酮类药物相比，第三代抗菌谱更为扩大，抗菌作用强、较低浓度即显抗菌活性；可对 抗耐药性葡萄球菌等革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌疗效更佳，而且价格适中，因此， 被广泛地应用到食源性动物的饲养过程中【7 】。但是，f q s 在食源性动物中的滥用和使用 不当现象也很严重，造成f q s 残留在动物源性食品中，而其残留可导致人体内病原体的 耐药性，而且某些f q s 具有潜在的致癌性，因此，其残留问题已引起了国内外的广泛关 注。欧盟( e u ) 和f a o w h o 食品添加剂联合专家委员会( j e c f a ) 规定了达氟沙星、 二氟沙星、恩诺沙星( 环丙沙星与恩诺沙星量之和) 、氟喹酸、麻保沙星、奥啉酸和沙 拉沙星在各种动物组织中的m r l 分别为低于1 9 0 0 t g k g 和低于3 0 0 0j _ t g k g 。我国规定了 牛、鸡、猪、羊等动物组织中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星( 环丙沙星与恩诺沙星量 之和) 、沙拉沙星等喹诺酮类兽药的m r l 为1 0 - 1 9 0 0 p t g k g 。但是由于q n s 类药物是在 近2 0 年才得到迅速发展与广泛应用的，所以，q n s 残留分析与其它抗生素类药物残留 分析比较，起步也较晚。目前，q n s 类的多残留分析的报道相对较少【8 一，一般只检测 一两种药物【1 0 , 1 1 】，我国除农业部于2 0 0 3 年“动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留检 测方法”外【1 2 】，q n s 多残留检测尚未颁布相应标准。 o o o h r l 图1 - 2f q s 的基本结构 f i g 1 2s t r u c t u r e so ff q s 1 3 兽药残留分析技术及其在磺胺类和氟喹诺酮类药物中的应用 近年来，由于动物源性食品中兽药残留问题得到了世界各国的广泛关注，兽药残留 第1 章绪论 分析技术也得到了迅速发展。兽药残留分析( d r u gr e s i d u ea n a l y s i s ) 属于复杂基质中痕 量组分的分析技术，既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏的痕量检测技术。现代 兽药残留分析方法通常包括分离和检测两个基本方面，样品分离是核心，按分析过程可 分为样品前处理和测定两部分【1 3 1 。以下分别对这两部分的最新研究进展进行介绍。 1 3 1 样品前处理技术 动物源性食品主要包括肌肉、脂肪、牛奶、禽蛋、肝、肾或皮肤等，样品基质复杂、 干扰物质多，而且待测物质浓度低，将药物残留从生物流体或生物基质中释放出来，除 去其中的干扰杂质并达到仪器可检测的浓度范围十分困难。因此，样品前处理技术一直 是分析检测人员关注的热点。近年来，兽药的种类和应用规模剧增，化学组成日益复杂， 并日趋高效或低剂量化，使样品前处理过程难度大大增加。上个世纪末，出现了一系列 新型的样品前处理技术。与经典的样品前处理方法如液一液萃取、索式提取等相比，这 些新技术简单、快速、高效，现己逐渐被应用到兽药残留分析领域中。以下对这些样品 前处理的新技术进行分别介绍。 1 3 1 1 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) s p e 既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取，又可用于净化、浓缩或富 集，是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。与液液萃取相比，它不需要大量 互不相溶的溶剂，处理过程中不会产生乳化现象，而且采用高效、高选择性的吸附剂( 固 定相) ，能显著减少溶剂的用量，简化样品的处理过程，同时减少所需费用。 ( 1 ) 基本原理 s p e 就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化 合物分离，然后通过洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。s p e 实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相同，可分为正相( 吸附剂 极性大于洗脱液极性) ，反相( 吸附剂极性小于洗脱液极性) ，离子交换和吸附。固相萃 取所用的固定相也与液相色谱常用的固定相相同，只是在粒度上有所区别【1 4 1 。s p e 柱上 所加压力一般都不大，分离目的只是把目标化合物与干扰化合物和基体分开即可，柱效 要求一般不高，仅为l o 5 0 塔板m 2 ，故作为s p e 的填料都较粗，一般在4 0 9 m 左右即 可，粒径分布要求也不严格，这样可以大大降低固相萃取柱的成本，易操作，并且一次 河北大学理学硕士学位论文 性使用。 目前，s p e 柱已经商品化，最常用的有s p e 柱( c a r t r i d g e ) 和s p e 盘( d i s k ) 。s p e 柱主要由柱管、筛板和固定相三部分组成。s p e 盘的外观与膜过滤器十分相似，盘的直 径通常为4 - - 9 0 m m ，使用时需与过滤装置和抽滤装置联用。 ( 2 ) 操作程序 s p e 操作一般有四步：固定相活化、样品上柱、淋洗和洗脱。 活化其目的是为了创造一定的溶剂环境和除去柱内的杂质。一般首先使用一种 强洗脱能力的溶剂( 始溶剂) 润湿和净化s p e 柱，然后再用弱洗脱能力的溶剂( 终溶剂) 平衡s p e 柱。一般每1 0 0 m g 固定相用l 2 m l 溶剂平衡。 样品上柱1 只s p e 的柱容量一般为固定相中重量的1 - 3 。在整个s p e 过程 中流速一般采用3 - 1 0 m l m i n ( 离子交换s p e 宜稍低) 。在能保证样品溶解时应尽可能用 弱溶剂溶解样品，使组分在柱上有强保留( 最好在柱床起始部位形成一窄的谱带) ，用 较小溶剂体积即可将组分洗脱，也可减少杂质流出。 淋洗和洗脱淋洗是除去不需要的组分或杂质，所用溶剂一般略强于或等于样品 溶剂。洗脱溶剂必须谨慎选择，以保证用较小体积的溶剂将组分洗脱下来，并且避免溶 剂太强洗出不必要的组分。使用混合溶剂是获得适宜强度溶剂的有效方法。淋洗或洗脱 溶剂体积一般为0 5 o 8 m l 1 0 0 m g ，如淋洗和洗脱溶剂不互溶，则用空气或氮气对柱床 进行干燥后再洗脱。 ( 3 ) s p e 的吸附剂 目前，应用于s p e 的吸附剂种类繁多。比较常用的吸附型吸附剂有：活性炭、硅藻 土、硅酸镁、氧化铝等。就化学键合型硅胶而言，正相的有：氨基、腈基、二醇基等， 用于分析中等极性或非极性化合物；反相的有ic l 、c 2 、c 6 、c 8 、c 1 8 、腈基、环己基、 苯基等，用于分析极性化合物；离子交换型的有：季胺基、氨基、二氨基、苯磺酸基、 羧基等，用于分析离子型化合物0 5 】。 此外，近些年来，一些新型的聚合物吸附剂得到了很快的发展。 亲水亲脂平衡型固相吸附剂其表现出来的亲水和亲脂特性使它能够在水中保 持湿润，并对极性和非极性化合物有很宽的适用范围。该类产品中应用较为广泛的是 w a t e r s 公司的o a s i sh l b 、o a s i sm a x 、o a s i sm c x 。例如，o a s i sh l b 是由亲脂性的二 第1 章绪论 乙烯基苯和亲水性的n 乙烯基吡咯烷酮两种单体共聚而成的大孔共聚物，它的吸附容 量大，一般可达c 1 8 键合硅胶的5 倍，可用于水溶液中的非极性组分的萃取。o a s i sm a x 是三甲基胺丙基取代的二乙烯基苯和n 乙烯基吡咯烷酮的共聚物，由于引入了季氨基， 所以它具有阴离子交换性，可吸附酸性化合物。o a s i sm c x 是磺酸基取代的二乙烯基苯 和n 乙烯基吡咯烷酮的共聚物，具有阳离子交换性，可吸附碱性化合物。 非极性聚合物吸附剂其基本材料大多为苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。例如， e m p o r e 公司的s d b r p s 固相萃取柱，由于连有酸性硫酸基，而具有阳离子交换性。 分子印迹聚合物( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r s ，m i p ) 吸附剂这种吸附剂以 待测化合物为模板分子，采用分子印迹技术合成出来，与待测化合物具有高度的选择性。 ( 4 ) s p e 技术在磺胺类兽药残留分析中的应用 文献中报道的用于分析动物源性食品中磺胺类药物的s p e 柱主要有以下几种： c 1 8 s p e 柱刘铁铮等【1 6 1 采j 羽o d s c 1 8 s p e 柱净化鸡蛋中7 种磺胺类药物，样品经二 氯甲烷提取、正己烷萃取、上s p e 柱净化，净化效果良好，回收率为7 3 2 1 0 2 6 。 碱性氧化铝s p e 柱侯晓林等【1 7 】在测定鱼肌肉中磺胺二甲嘧啶及其代谢产物时， 采ns e p p a k 碱性氧化铝s p e 柱净化样品：样品经乙腈提取、正己烷脱脂后，上碱性氧化 铝s p e 柱净化，样品中的杂质不干扰测定，操作简单，回收率高于8 0 。 o a s i sh l bs p e 柱m i n g - r e ns f u h 等1 18 】采用乙腈提取肉类样品中的8 种磺胺类药 物后，先用s e p - p a ka l u m i n an 柱进行样品净化，再上预先用甲醇、水和5 0 的乙酸溶液 活化好的o a s i sh l bs p e 柱，用水淋洗杂质，用甲醇洗脱磺胺类药物。由于采用了两种 s p e 柱对样品进行了净化，有效的去除了杂质，回收率为8 0 - - - 9 7 。 o a s i sm c xs p e 柱熊芳等1 1 9 对动物肝中的4 种磺胺类药物采用乙腈。氯仿混合液 ( 1 ：1 0 ，v v ) 提取、正己烷萃取。o a s i sm c xs p e 柱用甲醇、水和0 0 3 m o 儿h c l 预处理 后，上样，采用5 氨化甲醇进行洗脱。操作简便，净化效果理想。 硅胶s p e 柱董丹等【2 0 】采用硅胶s p e 柱净化残留在鸡肉中的1 7 种磺胺类药物：鸡 肉样品经乙腈提取、正己烷萃取。提取液蒸干后，用正己烷和三氯甲烷混合液溶解，上 样到硅胶s p e 柱上。由于1 7 种磺胺类药物的极性范围较宽，通过比较，选择甲醇丙酮 ( 1 ：1 ，v v ) 混合液和丙酮作为洗脱液即可将所有药物完全洗脱，回收率为5 2 3 1 2 4 9 。 河北大学理学硕士学位论文 量鲁詈量詈量詈量暑詈置皇葛! 曼詈皇詈墨, ( 5 ) s p e 技术在氟喹诺酮类兽药残留分析中的应用 文献中报道的用于分析动物源性食品中氟喹诺酮类药物的s p e 柱主要有以下几种： c 1 8 s p e 柱n v a nh o o f 等t 2 1 1 建立了一种同时测定牛肉、牛奶和水产品中8 种喹诺 酮类药物的分析方法。牛肉和水产品用水进行提取，牛奶采用2 0 - - 氯乙酸的甲醇溶液 去除蛋白，再用水反萃取喹诺酮类药物。各种样品分别注入由甲醇和水活化好的c 1 8 s p e 柱上，采用甲醇水( 2 0 ：8 0 ) 和正己烷淋洗，1 三氟乙酸的乙腈溶液进行洗脱。净化方 法简单、快捷，而且适用于三类不同的样品。 o a s i sh l bs p e 柱a r u b i e s 等【2 2 1 采用装有o a s i sh l b 吸附剂的9 6 孔盘式s p e 系统 同时净化了牛肉中的9 种氟喹诺酮类药物。牛肉用水提取后，注入预先用甲醇和水活化 好的盘式s p e 装置上，采用水和正己烷分别淋洗，甲醇进行洗脱。由于盘式s p e 装置可 以同时处理多个样品，不仅净化效果好，而且大大地缩短了样品处理的时间。 s d b r p ss p e 柱s b a i l a c 等【2 3 建立了种同时测定鸡肉中7 中喹诺酮类药物的方 法，研究了o a s i sh l b 、o a s i sm a x 和s d b r p s = 种不同的s p e 柱的净化效果。采用o a s i s h l b 时，杂质干扰达氟沙星的测定；采用o a s i sm a x 时，环丙沙星的回收率偏低；采用 s d b - r p s ，去除了杂质的干扰，回收率高。因此，最终选择s d b r p ss p e 柱净化鸡肉样 品。 m i s p e 柱e s t e rc a r o 等【2 4 1 以恩诺沙星为模板分子，采用非共价法合成了分子印 迹聚合物，并将其装入固相萃取柱中，通过优化固相萃取条件，使得这种聚合物对恩诺 沙星和环丙沙星具有高度的选择性。实验中，他们采用分子印迹固相萃取柱和o a s i sh l b 柱联用的两步固相萃取方案对尿样和动物组织样品进行净化，并用高效液相色谱法同时 测定了恩诺沙星和环丙沙星。结果表明，样品中的干扰物几乎不影响测定，而且测定水 平均低于欧盟规定的食源性动物中恩诺沙星和环丙沙星的最大允许残留量。 1 3 1 2 基质固相分散技术( m a t r i xs o l i dp h a s ed i s p e r s i o ne x t r a c t i o n ，m s p d ) m s p d 是b a r k e r 等【2 5 】在1 9 8 9 年提出并给予理论解释的一种快速样品处理技术。其基 本操作是将样品( 固态或液态) 直接与适量反相键合硅胶一起混合研磨，使样品均匀分 散于固定相颗粒的表面，制成半固态装柱，然后采用类似于s p e 的操作进行洗脱。所用 的填充料一般为c l s 或c 8 ，样品和填充料的比例通常为1 ：4 。m s p d 是一种在s p e 的基础 上改进后的样品处理方法，与s p e 相比，它的优点在于：它依靠填料颗粒的机械剪切力、 第1 章绪论 c 1 8 键合相的去垢作用和巨大的表面积使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散，浓缩 了传统的样品前处理中所需的样品匀浆、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免了样 品匀浆、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失，而且固定相处理样品的比容量大，提取 净化的效率较高。 m s p d 处理样品速度快、溶剂和样品用量少，引起兽药残留分析界的广泛关注，在 b a r k e r 等提出m s p d 后的数年间，该方法已被用于近4 0 种的兽药残留分析，如四环素类、 磺胺类、苯并咪唑类药物等。耿志明等1 2 6 j 在测定鱼肉中残留的7 种磺胺类药物时，采用 了m s p d 技术。将样品与c 1 8 填料研磨、装柱后，用正己烷洗去样品中的脂溶性杂质，二 氯甲烷作为洗脱液，获得了理想的净化效果。k u n i h i r ok i s h i d a 等【2 7 】在测定鸡肉中残留的 6 种磺胺类药物时，采用中性氧化铝作为m s p d 的吸附剂净化样品，7 0 乙醇水溶液作为 洗脱液。不仅洗脱液毒性小、净化效果好，而且回收率高、重现性好。 1 3 1 3 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) ， s f e 是利用在临界压力和临界温度以上的流体具有特异性增加的溶解能力，而发展 出来的分离新技术。该技术以超临界流体为溶剂，利用该状态下的流体具有高渗透能力 和高溶解能力进行非极性混合物的萃取分离。与传统的提取方法相比，s f e 具有萃取过 程易于调节、速度快、萃取效率高、选择性强、易于净化、无溶剂残留等优点。超临界 流体是温度与压力均超过其临界点之上的流体，性质介于气体和液体之间，其密度与液 体相似，粘度和扩散系数与气体相接近，而且表面张力小，易于渗透进入样品中。故超 临界流体具有很高的溶解能力及良好的流动、传递、渗透性能，可代替传统的有毒、易 燃、易挥发的有机溶剂。c 0 2 是最常用的超临界流体，它可萃取非极性和中等极性的物 质。对于极性较强的组分，则需要在c 0 2 中加入适量的极性溶剂充当改良剂以提高流体 的极性，或采用极性的超临界流体，如n 2 0 、n h 3 等。近些年来，s f e 技术在兽药残留分 析的样品处理方面得到了一定的应用。r o b e r tj m a x w e l l 等【2 8 】建立了一种同时测定鸡肝中 a m 磺胺类药物的方法。净化鸡肝样品时，选择c 0 2 作流体，在1 0 0 0 0 p s i 、4 0 ( 2 的条件下 进行超临界流体萃取，磺胺类药物被提取后吸附于中性氧化铝柱上，经流动相洗脱后， 采用h p l c 测定，获得了较高的回收率：7 1 4 9 8 2 。 1 3 1 4 微波辅助萃取( m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n ，m a e ) m a e 就是利用极性分子可迅速吸收微波能量来加热一些具有极性的溶剂，如乙醇、 河北大学理学硕士学位论文 甲醇、丙酮或水等，从而促进溶剂萃取。因非极性溶剂不能吸收微波能量，所以在微波 萃取中不能使用1 0 0 的非极性溶剂作为萃取溶剂。一般可在非极性溶剂中加入一定比 例的极性溶剂来使用，如丙酮和环己烷( 体积比= 1 ：1 ) 就可用来作微波萃取溶剂。与其 它方法相比，m a e 具有萃取时间短、试剂用量少、污染低、回收率高和能自动控制等优 点，因此引起了广泛关注。m p h e r m o 等【2 9 】在测定猪肉中残留的8 种喹诺酮类药物时， 分别采用传统的液固萃取技术和m a e 技术对样品进行提取后过s p e 柱净化。与传统的液 固萃取技术相比，采用m a e 技术进行萃取，样品中杂质少，净化效果好，灵敏度高， l o d 和l o q 均低于欧盟规定的m r l 值。 1 3 1 5 免疫亲和色谱( i m m u n o a f f m i t yc h r o m a t o g r a p h y ，i a c ) i a c 是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的技术，根据抗原抗体的特异性亲合 作用，从复杂的待测样品中捕获目标化合物。其原理是将抗体与惰性微珠共价结合，然 后装柱，将含抗原的溶液过免疫亲和柱，抗原与固定了的抗体结合，而非目标化合物则 沿柱流下，最后用洗脱缓冲液洗脱抗原，从而得到纯化的抗原。i a c 的最显著优点在于 对待测物的高效、高选择性保留能力，特别适用于复杂样品极稀组分的净化与富集。l i j s 等【3 0 】采用了i a c 技术对猪肉中磺胺类药物进行检测。利用抗磺胺类药物的簇特异性 抗体制备免疫亲合柱，能够同时提取复方磺胺甲嗯唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺 喹嗯啉等8 种磺胺类药物，用紫外检测的反相液相色谱法测定了猪肉中添加1 0 - 1 0 0 “g k g 的磺胺类药物时的回收率，在7 0 8 9 4 1 ，检测限达到1 - 2 t g k g 。