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硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 摘要 喜树碱是从我国特有的珍稀植物喜树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a ) 中分离得到 的一种单萜类吲哚生物碱。喜树碱及其衍生物已经成为临床上具有显著抗肿瘤效 应的天然植物药之一。但由于喜树生长周期长，仅靠从喜树中提取喜树碱，已经 无法满足市场的不断增长的需求。已有的文献报道在药用植物日本蛇根草 ( o p h i o r r h i z a j a p o n i c a ) 中发现喜树碱的存在，这将为喜树碱的获取提供新的生 药替代来源。本文首次克隆了日本蛇根草中喜树碱代谢途径中的关键酶s t r 基 因，并对s t r 基因的特征、表达分析、诱导调控等展开研究。 同翅目害虫种类繁多，侵害目标广泛，是造成农作物的产量和品质下降的重 要因素之一。近年来植物抗虫基因工程研究进展迅速，为控制病虫害提供了新的 途径。大量的研究表明，植物凝集素具有非常有效的抗虫作用，尤其对同翅目害 虫表现出良好的抗性。本文首次从观赏植物龟背竹( m o n s t e r ad e l i c i o s a ) 的叶片 中分离克隆出了一条新的凝集素基因。主要研究结果如下： 一、首次从日本蛇根草的叶片中克隆出异胡豆苷合成酶基因，该基因全长 e d n a 为1 2 5 8 b p ，包含了一个1 0 6 2 b p 的开放阅读框，编码一个全长3 5 3 个氨基酸 的蛋白，推测该蛋白的等电点为5 7 ，分子量大小约为3 9 3 k d a 。生物信息学分析 表明，从日本蛇根草植物中分离得到的s t r 基因与产喜树碱的短小蛇根草 ( o p h i o r r h i z ap u m i l a ) s t r 蛋白的相似性达9 6 。系统进化分析表明，s t r 蛋白 同其他异胡豆苷合成酶来自于共同的祖先，并且与短小蛇根草、长春花、罗芙木 中s t r 蛋白具有较近的亲缘关系。组织特异性表达谱分析发现，o j s t r 基因在花、 叶、茎、根四种组织中都有表达，表明o j s t r 是一种组成型表达的基因。甲基茉 莉酸与水杨酸诱导实验揭示，o j s t r 在日本蛇根草中具有不同的表达调控方式。 二、植物表达载体的构建：在异胡豆苷合成酶基因( o j s t r ，o p h i o r r h i z a j a p o n i c as t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ) 克隆的基础上，构建了以烟草花椰菜病毒 ( c a m v 3 5 s ) 启动子驱动的植物表达载体p c a m b i a l3 0 4 + - o j s t r ，并成功地导 入到发根农杆菌c 5 8 c 1 中，用于转化日本蛇根草与喜树。 三、首次克隆了天南星科植物龟背竹( m o n s t e r ad e l i c i o s a ) 凝集素基因m d a ， 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 该基因全长c d n a 为11 8 6 b p ，含有一个8 5 2 b p 的开放阅读框，编码一个具有2 8 3 个 氨基酸的前体蛋白质。推测该蛋白的等电点为8 3 4 ，分子量大小约为3 1 6 5 6 k d a 。 生物信息学分析表明，从龟背竹植物中分离得到的m d a 和其他单子叶植物甘露 糖结合凝集素具有一定的同源性，三维结构预测结果表明m d a 属于单子叶植物 甘露糖结合凝集素超家族，并含有两个非常保守的基序( q d n y ) ；组织特异性表 达分析结果发现m d a 只在叶中表达而在根和茎中检测不到表达，表明m d a 并不 是一个组成型表达的基因。 四、构建以烟草花椰菜病毒( c a m v 3 5 s ) 启动子驱动，含有m d a 的植物表 达载体p c a m b i a l3 0 4 * - m d a ，并成功导入根癌农杆菌e h a l0 5 中，进行烟草的遗 传转化。 关键词：日本蛇根草，喜树碱，异胡豆苷合成酶，龟背竹凝集素，基因克隆，序 列分析，生物信息学，组织特异性表达，载体构建，遗传转化。 2 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 m o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o na n de x p r e s s i o na n a l y s i so fas t r i c t o s i d i n e s y n t h a s eg e n ef r o mo p h i o r r h i z a j a p o n i c aa n d am a n n o s e - b i n d i n gl e c t i ng e n e a b s t r a c t c a m p t o t h e c i n ( c p t ) i sam o n o t e r p e n ei n d o l e a l k a l o i di s o l a t e df r o mt h e d e c i d u o u sc h i n e s eh a p p yt r e e n o w , i th a sb e c o m eo n eo ft h ea n t i c a n c e ra n da n t i v i r a l d r u g sf r o mp l a n t c a m p t o t h e c a a c u m i n a t ag r o w sv e r ys l o w l ya n dt h ec p tw a s i s o l a t e df r o mt h eo r i g i n a lp l a n ts o u r c ew h i c hi sv e r yl i m i t e d ，w h i l et h ed e m a n df o r c p ti sr a p i d l yi n c r e a s i n gi nr e c e n ty e a r s i tw a sv e r ye x c i t e dt h a tt h ec p th a db e e n r e p o r t e di no j a p o n i c ai nr e c e n t i nt h i sw o r k ，i ti st h ef i r s tt i m et or e p o r tt h ec l o n i n g a n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h es t rg e n ef r o mt h er u b i a c e a ep l a n to p h i o r r h i z a d a p o m c a a n dt h ee x p r e s s i o n ，r e g u l a t i o na n de f f e c t so ft h ei n d u c t o rw e r ea l s oc a r r i e do u t t h eh o m o p t e r ai n s e c ti so n eo ft h ei m p o r t a n tf a c t o rt ot h eb r e a k d o w no f c r o p s ， h a dag r e a tv a r i e t ya n da l s oaw i d ed i s o p e r a t i o n d u r i n gt h el a s tf e wy e a r sg r e a t p r o g r e s sh a sb e e nm a d ei nt h ep l a n ta n t i i n s e c tg e n ee n g i n e e r i n g ，w h i c hp r o v i d ea n e ww a yt oc o n t r o lt h ep l a n td i s e a s e sa n di n s e c tp e s t s n o w a d a y sa lg r e a to ft h e r e s e a r c h si n d i c a t e st h a tt h el e c t i nh a sag r e a te f f e c to nt h ea n t i - i n s e c t ，e s p e c i a l l yt ot h e h o m o p t e r ai n s e c t s t h i si st h ef i r s t l yr e p o r tt oe m p h a s i z e dt h em o l e c u l a rc l o n i n g ， s e q u e n c i n ga n dp a r t i a l l yc h a r a c t e r i s a t i o no fal e c t i nf r o ml e a v e so fa no r n a m e n t a l p l a n tm o n s t e r ad e l i c i o s a t h em a j o re x p e r i m e n t sf r o mt h i sw o r kw e r ea st h e f o l l o w i n g ： 1an e wf u l l l e n g t he d n a e n c o d i n gs t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ，w h i c hc a t a l y z e sa c o m m i t t e ds t e pi nc a m p t o t h e c i nb i o s y n t h e t i cp a t h w a y , w a si s o l a t e df r o my o u n g l e a v e so fo p h i o r r h i z aj a p o n i c af o rt h ef i r s tt i m e t h ef u l ll e n g t ho fo j s t rw a s12 58 b pa n dc o n t a i n e da10 6 2b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r e ) e n c o d i n gad e d u c e dp r o t e i no f 3 5 3a m i n oa c i dr e s i d u e s s e q u e n c ea n a l y s e ss h o w e dt h a to j s t rh a dh i g hh o m o l o g y w i t ho t h e rs t r sf r o ms o m ep l a n t sw h i c hp r o d u c et i a s p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i s s h o w e dt h a to j s t rh a dc l o s e s tr e l a t i o n s h i pw i t hs t rf r o mo p u m i l a t i s s u e 3 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 e x p r e s s i o np a u e r na n a l y s i sr e v e a l e dt h a to j s t rc o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e di n a l lt h e t e s t e dt i s s u e sa td i f f e r e n tl e v e l s ，w h i c hw a sh i g hi nf l o w e r , m o d e r a t ei nl e a fa n dr o o t ， l o wi ns t e m e x p r e s s i o np r o f i l e su n d e rp l a n td e f e n s es i g n a l ss u c ha sm e t h y lj a s m o n a t e ( m e j a ) a n ds a l i c y l i ca c i d ( s a ) w e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h er e s u l t sr e v e a l e d t h a t e x p r e s s i o no fo j s t rw a s a l l i n d u c e d ，i m p l y i n gt h a to j s t rw a sh i g h e l i c i t o r r e s p o n s i v e 2c o n s t r u c t i o no fp l a n te x p r e s s i o nv e c t o lb a s e do nt h ec l o n i n go fo p h i o r r h i z a j a p o n i c as t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ，ap c a b i a13 0 4 + p l a n te x p r e s s i o nv e c t o rc o n t a i n e d o j s t rg e n eh a db e e nm a d ew h i c hw a sd r i v e nb yt h ec a m v 3 5 sp r o m o t e r t h ev e c t o r w a st r a n s f e r r e di n t oa g r i b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sc 5 8 c1 3t h i si st h ef i r s tt i m et oc l o n eam o n o c o tm a n n o s e b i n d i n gl e c t i nf r o m m o n s t e r ad e l i c i o s ai na r c e a e t h ef u l l - l e n g t he d n ao fm o n s t e r ad e l i c i o s aa g g l u t i n i n ( m d a ) c o n s i s t e do fl18 6 b pa n dc o n t a i n e da8 5 2 b po r fe n c o d i n ga2 8 3a m i n oa c i d p r o t e i n b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sr e s u l t sc l e a r l yi n d i c a t e dt h a tm d ab e l o n g st ot h e m o n o c o tm a n n o s e - b i n d i n gl e c t i nf a m i l y , w h i c hc o n t m n s2p u t a t i v em a n n o s e b i n d i n g s i t e s ( q d n v y ) p e rs u b u n i t r t - p c ra n a l y s i sr e s u l t si n d i c a t et h a tm d ae x p r e s s i o n w a st i s s u e s p e c i f i cw h i c hi so n l ye x p r e s s e di nt h el e a v e s ，n o ti ns t e m sa n d r o o t s 4a p c a b i a13 0 4 + p l a n te x p r e s s i o nv e c t o rc o n t a i n e dm d ag e n e ，w h i c hw a s d r i v e n b y t h ec a m v 3 5 sp r o m o t e r , w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f e r r e d i n t o a g r i b a c t e r i u mt u m e f a c i e n se h a l 0 5 k e y w o r d s ：s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ；o p h i o r r h i z a j a p o n i c a ；c a m p t o t h e c i n ；m o n s t e r a d e l i c i o s aa g g l u t i n i n ( m d a ) ；g e n ec l o n i n g ；s e q u e n c ea n a l y s i s ；v e c t o r c o n s t r u c t i o n ；b i o i n f o r m a t i c s ；e x p r e s s i o np a t t e r na n a l y s i s ；g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n 4 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：嗽桶日期：川易三 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签孝：欲榀导师签名幂 期：沙乡6 矿 沙夕6 矿 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合上海 师范大学硕( 博) 士学位论文质量要求。 答辩委员会签名： 主席( 工作单位、：卫乏乡 甄荔丢弛) 帜 刷吼丽1 氮飞 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 第一章综述 1 喜树碱概况 1 1 植物次生代谢工程 植物中的代谢产物包括初生代谓 物和次生代谢物两类【l 】，初生代谢产物主要 由糖类、脂类和核酸组成，是维持植物生命活动所必需的化合物【2 j o 植物次生代 谢产物则是一类小分子有机化合物，在植物生长发育的过程中属于非必需的成分 【”1 。植物次生代谢产物种类多样、性质各异；酚类、生物碱、萜类、有机酸等 都是次生代谢产物中的一些代表性化合物【l 捌。植物次生代谢产物的产生，是植 物在进化过程中适应环境的一种表现，如植物激素、叶绿素、木质素等在植物的 生命过程中都起着十分重要的作用【3 1 。目前许多已知的名贵香料、有效中成药的 主要成分都来自于天然植物次生代谢产物。但由于日益严重的环境污染，使得许 多天然植物的数量锐减。目前对于次生代谢产物的需求在不断增长，供求平衡已 被打破。虽然人工栽培以及化学合成都取得了一定的成绩，但都或多或少加重了 环境污染的问题。随着代谢工程技术的不断创新与发展，为解决这一问题带来了 新的契机。 植物生物碱是植物次生代谢产物中一类含氮有机化物，具有庞大的数目与结 构【1 2 1 。在五万种天然化合物中，几乎四分之一的化合物都属于生物碱1 4 1 。超过 5 0 个科，1 2 0 个属的植物中都被发现有生物碱的产生【1 捌。生物碱药物在世界范 围内的销售额已超过4 0 亿美元( 2 0 0 2 年统计) 【1 。2 ，5 ，且仍在不断增长。生物 碱通常可以分为喹啉生物碱、吲哚生物碱、喹嗪烷生物碱和莨菪烷生物碱四大类， 喜树碱就是一种喹啉生物碱【h l 。萜类吲哚生物碱( t e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d s ) ， 简称t 认s ，是植物生物碱中具有重要药用及经济价值的一类化合物【1 。2 一。其中 喜树碱、长春新碱等都是目前临床使用最多，且最具代表性的萜类吲哚生物碱， 在世界范围内的销售额已突破4 0 亿美元【5 - 9 。 1 2 喜树碱概述 喜树碱( c a m p t o t h e c i n ) ，简称c p t ，是一类已明确具有高效抗癌及肿瘤的 植物萜类吲哚生物碱，最早于1 9 6 6 年由w a l l 等人从我国特有的珍稀植物物种喜 树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a ) 中首次分离得到【1 ，1 0 1 。在臭味假柴龙树( 茶茱萸科) 、 海木狗牙花( 夹竹桃科) 、短小蛇根草( 茜草科) 中也先后分离获得，最近在药 1 2 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 用植物日本蛇根草中也发现了喜树碱的存在”1 4 】。喜树碱是目前已知的唯一一种 通过抑制拓扑异构酶i 而发挥抗肿瘤作用的天然植物成分【l ，1 5 】。喜树碱衍生物如 拓扑替康( t o p o t e c a n ) 和异扑替康( i r i n o t e c a n ) 已经被f d a 批准用于临床治疗 卵巢癌、肺癌、以及艾滋病等恶性疾病，并具有较好的治疗效果【幡1 7 1 。预计在未 来的时间里，对于喜树碱及其衍生物的需求量将不断增加。喜树碱主要依靠从喜 树种子以及树皮中提取获得，喜树作为一种木本植物，生长速度缓慢，已很难满 足目前的市场需求【1 ，13 1 。 国内外学者就喜树碱的化学全合成，半合成及细胞培养等进行了研究；虽然 取得了一定的进展，但都存在着环境污染、无法大量工业化生产等问题【1 2 ，1 引。 基于对喜树碱合成代谢途径的逐渐明了9 之0 1 ，以及分子生物学、代谢工程、基 因工程等现代化技术的发展，为喜树碱药源问题的解决打开了新的局面。一些喜 树碱生物合成途径中的关键酶基因已被克隆，使得通过基因工程手段获得转基因 的细胞系、组织、再生植株等，并进行大规模的培养成为可能【1 ，1 9 1 。 1 3 喜树萜类吲哚生物碱的合成途径 喜树碱的代谢途径目前已基本明了见图1 1 t 1 之，1 9 删，喜树碱的生物合成来自 于萜类吲哚生物碱( t e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d s ，t i a s ) 途径；而喜树碱的生物合 成途径中的上游途径由两部分组成。其中一条是莽草酸途径，也称为吲哚途径； 另一条是类萜途径，也称d x p 途径【2 ，2 们。上游莽草酸途径途径中的代谢产物色 氨酸( t r y p t o p h a n ) 通过色氨酸脱羧酶( t r y p t o p h a nd e c a r b o x y l a s e ，t d c ) 的作用生成 ? 妾( t r y p t a m i n e ) 1 1 9 _ 2 0 】。另一条上游类萜途径中产生的代谢物香叶基焦磷酸 ( g e 啪i 0 1 ) 经多步反应生成裂环马钱子苷( s e c o l o g a n i n ) l , 2 0 1 。莽草酸途径中产生的 t r y p t a m i n e ( 色胺) 与d x p 途径中产生的s e c o l o g a n i n ( 裂环马钱子苷) 最终通 过代谢途径中处于“咽喉 位置的异胡豆苷合成酶( s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ，s t r ， e c 4 3 3 2 ) 作用，生成喜树碱的前体物质异胡豆苷【1 。2 ，1 9 ，2 1 1 ，在经几步反应后形成 终产物。 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 s h i k t m a p a l h n a v d x p p l l l l l , a ， a l v ap j t h a ，- ：蜊，：一 ( h m 。i m j i c ；t a n y l b p h 口 p h ， ml ： a n l h r = u i l m t eg l _ a u i o l 1 1 ，+ p t n l ) h ：l n c p rlg i o h 1 0 h v d r o x y g e r = n i o j t d ( 1： t r y p t = m l n el o e j u i u 卜旦是，嘲 l c m m p t m b e e i mm u d o i l t 图1 1 喜树萜类吲哚生物碱的合成途径。 f i g l ib i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fc a m p t o t h e c i n 1 4 喜树萜类吲哚生物碱的合成途径中的关键酶s t r 异胡豆苷是喜树碱的关键中产物，是异胡豆苷合成酶( s t r ) 将喜树碱代谢途 径中的两条代谢途径：莽草酸途径中产生的色胺以及d x p 途径中产生的裂环马 钱子苷催化形成的( 图1 2 ) 【2 1 ，7 9 j 。无论是莽草酸途径或是d x p 途径，都必须 经s t r 这一关键酶的催化，才能获得终产物喜树碱的前体物质，这说明异胡豆 苷合成酶在生物碱的代谢合成途径中具有举足轻重的作用【1 。2 】。除了喜树碱代谢 途径之外，在其他萜类吲哚生物碱代谢途径中，s t r 也起着同样的关键作用， 在萝芙木阎、长春花例以及短小蛇根草例中已被证实。 为进一步证明s t r 在植物代谢途径中的作用，1 9 9 8 年，c a n e l 等人报道利 用根癌农杆菌将携带s t r 基因编码区的植物表达载体成功导入长春花细胞中【2 卯。 同时测定代谢产物，发现s t r 的过量表达可以有效促进代谢产物的积累【2 5 1 ，由 此可见，s t r 在喜树碱合成途径中起着相当重要的作用，与植物积累生物碱类 代谢物的能力密切相关，所以在代谢工程中，s t r 通常被认为是重要的代谢靶 点之一【l 】。 1 4 砸论文日本蛇根草异胡豆昔合成酶基因厦龟背竹凝集紊基因的克隆分析 图l 之异胡豆苷合成酶将色胺和裂环马钱子苷耦合成为t a s 的前体化舍物异胡豆苷。 f 唔1 - 2s t r i e t o n i d i n es y n t h 肚ec s t r c a t a l y z e st h et c 。p t a m i n ea n ds c c o t o g a n l nl o s 斫c t o s i d i n e 1 5 日本蛇根草 日本蛇根草为龙胆目茜草科蛇根草届的的多年生草本植物，其生境通常为常 绿阔叶林f 的沟谷沃土上( 引自中国高等植物数据库h t t p ：w w w b i o i n f o c n d b 0 5 k m z w s p e e i e s p h p t a c t i o n = v i e w & i d = 1 9 8 5 0 。日本蛇根革主要分布于我国 长江流域及以南大部分省、区( 自治区) 。在医药上常用于活血散瘀等( 引自 h t t p ：b a i k e b a i d u c o m v i e w 1 2 1 4 4 6 2 h t m ) 。 近期，湖南吉首大学的易波浪等人利用乙醇对日本蛇根草进行了提取，经液 相色谱分析发现日本蛇根草中有喜树碱的存在：其含量虽然低于喜树，但作为一 种草本植物，仍然为寻找替代喜树新的生药来源带来了希望【。 图i - 3 日本蛇根草植株。 f i gi - 3o p h i o r r h l z a j a p o n i c a 2 植物凝集素概况 2 1 凝集素定义 凝集素作为一类对糖及其缀合物专一识别的蛋白质，存在于植物、动物以及 微生物中2 “。凝集素的最大特点是识别细胞膜表面的糖基，且对于特异性糖基 具有高度结合能力。通常将凝集素分为动物凝集素、植物凝集索和微生物凝 集素三类”0 1 。 最早的植物凝集是1 9 8 8 年由俄国d o p a t 大学的s t i l l m a r k 从蓖麻籽萃取物中 发现的，当时认为它是一种能够凝集红细胞的细胞凝集因子。在随后的时间 里，超过1 0 0 0 多种的植物凝集素被发现：植物凝集素的分布广泛，1 4 的高等 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 植物中都含有凝集素，目前已经在六个科目中发现了凝集素的存在2 7 。3 0 l 。在植物 的营养、储藏以及繁殖器官中都分布着凝集素f 2 7 。0 1 。 2 2 植物凝集素的分类 根据植物凝集素所具有的不同的结构、专一性以及氨基酸序列的同源性以及 进化关系等，可以将植物凝集素划分为不同的类别。从结构上划分，凝集素一般 分为全凝集素( h o l o l e e t i n ) 、部分凝集素( m e r o l e e t i n ) 、嵌合凝集素( c h i m e r o l e c t i n ) 和超凝集素( s u p e r l e c t i n ) 1 2 7 2 8 】四大类。从对糖的专一性分类，分为半乳糖n 2 乙酰半乳糖胺组、n 2 乙酰葡萄糖胺组、唾液酸、组甘露糖组、复合糖组【2 9 】六组。 根据氨基酸序列的同源性及其进化上的关系划分，植物凝集素又可以分为7 个不同的家族：豆科凝集素、含有h e v e i n 结构域的几丁质结合凝集素、葫芦科 韧皮部凝集素、苋科凝集素、i i 型核糖体识别蛋白( r i p ) 、木菠萝素( j a c a l i n ) 家族以及单子叶植物甘露糖结合凝集素3 0 4 0 】。 单子叶植物甘露糖结合凝集素是一种广泛存在于单子叶植物，如石蒜科、天 南星科等，其特点是可特异结合甘露糖【2 7 。2 9 j 。单子叶甘露糖结合凝集素在序列上 有相近，在结构上也很相似，属于一个进化密切相关且保守的超家族【2 7 捌。该凝 集素通常存在一个结构域，但也有两个结构域存在的情况【3 引。目前单子叶植物 甘露糖凝集素已经被证明具有免疫、抗肿瘤、抗增殖、抗真菌、抗病毒、抗虫等 不同的生物学功能【4 1 蛔。 2 3 植物凝集素的性质 对于糖结合具有高度的特异性，是植物凝集素蛋白的最大特点。它的特异性 主要表现在以下几个方面【2 7 】：一，能够大范围的特异结合各种表面糖类。目前 所知的表面糖类几乎都可以被凝集素所识别【2 7 ，2 引。二，不同种类的植物凝集素 可以识别同一糖类。植物凝集素结合位点的三维结构决定了的糖结合，主要结合 位点的结构相似就有能识别同一类糖【2 7 】。三，多数的植物凝集素更容易与寡糖 结合【2 扪。四，植物凝集素的特异结合主要针对于动物与微生物表面的聚糖。目 前发现的唯一的一类可以识别并结合微生物( 如细菌和真菌) 外表面或植物害虫 肠胃表面的糖复合物的植物蛋白是凝集素2 7 , 2 9 】。 稳定性也是植物凝集素的另一特性【2 他9 1 。大多数的植物凝集素都能耐蛋白酶 降解，并且具有极好的热稳定性；这是因为这一特性使得植物凝集素在动物或昆 1 6 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 虫体内不易被降解2 7 1 。 2 4 植物凝集素的功能 植物凝集素的许多功能都是在进化过程中逐渐产生的，在抗虫以及对于病毒 和细菌的抗性等发面的功能已经越来越受到关注【4 h 6 1 。主要表现为以下几个方 面： ( 1 ) 抗病毒性 许多医学研究表明，单子叶甘露糖植物凝集素能够抑制包括人类逆转录病 毒h i v 在内的多种病毒，同时也能减少由昆虫引起的病毒传播4 7 1 。 ( 2 ) 抗细菌性 植物凝集素的抗菌活性主要表现在能够结合细菌的细胞壁聚糖，并引起强 烈反应，植物凝集素的这一特性主要在豆科中有所发现【4 8 j 。 ( 3 ) 抗真菌性 植物凝集素的抗真菌活性，主要是由几丁质凝集素表现；可以观察到该凝集 素能够抑制菌丝生长，同时抑制真菌孢子的活， 生1 4 4 , 4 8 】。 ( 4 ) 对高等动物抗性 植物凝集素能够与动物消化道上的糖及糖基化的蛋白结合，造成高等动物误 食之后产生恶心或是腹泻等症状，从而起到保护植物免受动物侵害【2 7 1 。 ( 4 ) 抗虫性 由于植物凝集素可以结合不同种类的单糖以及寡聚糖，而昆虫消化道上的 细胞膜主要成分是糖蛋白，所以能够表现出对于同翅目等害虫的毒性【5 0 1 。在世 界范围内，同翅目害虫引起的农业危害造成了巨大的经济损失；同翅目害虫除了 危害园艺、农作物，更通过刺吸式口器造成的伤口传播各种病原菌【4 9 】。目前的 实验证明，单子叶植物甘露糖结合凝集素对于同翅目害虫的杀伤性最为显著【5 0 j 。 实验统计结果显示，雪花莲凝集素、掌叶半夏、半夏以及朝鲜天南星凝集素对咀 嚼式昆虫和刺吸式昆虫都有致死作用【4 9 5 6 1 。 2 5 植物凝集素在抗虫基因工程中的应用 在植物凝集素的众多功能中，抗虫功能受到了极大的关注，目前一些植物外 源凝集素，尤其是单子叶甘露糖结合凝集素已应用于植物抗病虫基因工型2 7 1 。 ( 1 ) 石蒜科凝集素 1 7 硕士论文日本蛇根单异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 石蒜科凝集素是较早被分离克隆的一类凝集素。实验证明，石蒜科凝集素 对于刺吸式、咀嚼式害虫有一定的抗性【5 2 。5 3 】。而在其中，最为著名的就是雪花莲 凝集素( g n a ) ；据报道，雪花莲凝集素对于桃蚜、褐飞虱能够表现出较强的毒 性1 5 2 】，在水稻等多种作物中得到表达。在石蒜科的其他植物，如孤挺花等中分 离到的凝集素也同样表现出对于同翅目害虫的抑制作用【5 3 1 。 ( 2 ) 天南星科凝集素 最近的研究发现天南星科凝集素在抗虫活性方面也表现出一定的作用。其中 半夏凝集素( p t a ) 对于同翅目害虫棉蚜的成蚜具有显著的致死作用，同时该凝 集素棉蚜成蚜的产幼蚜率也有明显降低【5 4 1 。其他实验也证实了其他天南星科外 源凝集素，如掌叶半夏、东北天南星等对于蚜虫的生殖、发育都有显著的抑制或 推迟效果【5 6 1 。 2 6 龟背竹 龟背竹原产墨西哥，2 0 世纪8 0 年代初我国大量引种；龟背竹又名蓬莱蕉、电 线兰为天南星科龟背竹属植物，且极少有病虫害的发生( 引i 刍h t t p ：b a i k e b a i d u e o m v i e w 1 6 2 4 4 h t m ) 。因此推测龟背竹可能具有天南星科凝集素的一些特性。 3 本研究的目标及拟解决的问题 目前喜树碱的主要来源是从喜树树皮以及种子中提取获得，喜树天然资源数 量稀少，作为木本植物喜树的生长缓慢，且喜树碱及其衍生物在植物体内含量又 非常低1 。2 】。人工提取环节多、费时费力，使喜树碱的生产成本高，产量低，难 以满足市场对喜树碱日益增长的需求【坨1 。因此，利用植物代谢基因工程将喜树 碱合成途径中的关键酶基因( 如s t r ) 导入产喜树碱的植物中，获得转基因发根， 并进行大规模培养，是从根本上提高喜树碱含量和解决市场需求的最佳途径之 一。 最近有文献报道发现在中国南部广泛分布的日本蛇根草( o j a p o n i c a ) 中也 含有喜树碱等活性成分5 ，。目前，还没有从日本蛇根草中克隆喜树碱代谢途径 中克隆基因的有关报道。本研究针对日本蛇根草中喜树碱代谢途径中的关键酶基 因s t r 基因进行了克隆，并构建植物表达载体，通过发根农杆菌介导，转入喜树， 获得转基因发根系，进而观察对次生代谢途径和代谢物产量的影响。这项研究为 探索利用基因工程技术改良日本蛇根草以及喜树等产喜树碱植物生物碱代谢途 1 8 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 径打下了一定的基础。同时对于日本蛇根草喜树碱代谢途径的研究填补了空缺。 得益于抗虫基因工程迅猛发展，已筛选到一些具有一定抗虫效果的基因，然 而针对同翅目害虫，如蚜虫，褐飞虱等的抗虫基因却进展不大【7 0 1 。目前在获得 的凝集素基因中像石蒜科的雪花莲外源凝集素( g n a ) 或是天南星科的半夏凝 集素( p t a ) 等对同翅目的害虫具有较好的抗性【5 2 。5 4 】。龟背竹是天南星科中的一 种比较常见的观赏植物，同时该植物也很少有病虫害的发生。可以推测，天南星 科植物龟背竹或许也具有类似的抗虫效果。 本研究利用同源性克隆的原理，通过已知的天南星科植物凝集素基因，设计 同源性引物，克隆得到龟背竹凝集素基因【7 0 1 。这是首次从龟背竹( m o n s t e r a d e l i c i o s a ) 中克隆出一个新的凝集素基因( m o n s t e r ad e l i c i o s aa g g l u t i n i n ，m d a ) 。经 序列特征分析，并成功进行植物表达载体构建及烟草遗传转化。这为进一步探索 龟背竹凝集素基因在植物发育过程中的作用，以及对于同翅目害虫如棉蚜、飞虱 等的抗虫作用的研究打下基础。 1 9 硕士论文 日奉蛇根草异胡豆苷合成酶基因及龟背竹凝集素基因的克隆分析 2 1 材料 第二章材料和方法 2 1 1 植物材料 日本蛇根草( o p h i o r r h i z aj a p o n i c a ) ，采自中国福建省，无菌组培苗培养于 2 5 * ( 2 的无菌组织培养室中，空气湿度为5 0 ，每日光照1 6 h 。 龟背竹( m o n s t e r ad e l i c i o s a ) ，种植于上海师范大学植物园内。 2 1 2 菌种 大肠杆菌( e c o l i ) d h 5 0 t 、农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) c 5 8 c 1 ， e h a l 0 5 ，以上菌种由交通大学唐克轩教授实验室赠送，由本实验室保存。 2 1 3 载体 植物双价表达载体p c a m b i a l 3 0 4 + 由交通大学唐克轩教授实验室赠送，本 实验室保存。 p m d l 8 tv e c t o r 购自于日本t a k a r a 上海分公司。 2 1 4 试剂及溶液 r n a p r e p 植物总r n a 提取试剂盒购白天根生化科技有限公司； 3 - r a c es y s t e mf o rr a p i d a m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s 试剂盒购自美国英杰 公司； 5 - r a c es y s t e mf o rr a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s 试剂盒购自美国b d 公司： t a qd n a 聚合酶、e x - t a qd n a 聚合酶、t 4d n a 连接酶、d n t p s 购自上海 宝生有限公司； 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海天根生化科技有限公司； d l 2 0 0 0 标准分子量本实验室自制； 水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ) 购自s i g m a a l d r i c h 上海分公司； 甲基茉莉酸( m e t h l yj a s m o n a t e ) 购自s i g m a - a l d r i c h 上海分公司； 引物由上海桑尼生物技术公司合成； 2 1 5 主要仪器 移液器( 量程范围2 5 u 1 5 0 0 0 u 1 ) ：德国艾本德股份公司产品； 硕士论文日本蛇根草异胡豆苷合成酶基冈及龟背竹凝集素基因的克隆分析 t h e r m a lc y c l e rd n a 扩增仪：美国伯乐公司产品； j y 3 0 0 电泳仪：j u n y i 公司产品； 凝胶成像分析系统：美国u v p 产品； 自动蒸汽灭菌锅：日本t o m m y 公司产品； 纯水系统：法国m i n i p o r e 公司产品； 5 4 1 7 r 型台式高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司产品； d h p 9 0 8 2 型电热恒温培养箱：上海华连医疗器械有限公司产品； d k 8 d 型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司产品； t h z c 恒温振荡器：太仓市实验设备厂产品： h z p 2 5 0 型全温振荡培养箱：上海精宏设备有限公司产品； 超低温冷冻冰箱：美国t h e n n o 公司产品； c d a 1 0 8 0 2 垂直面对面超净工作台：上海上净净化设备有限公司； 2 1 6 常用试剂 1 0 0 m g m l 潮霉素b ( h y g r o m y c i nb ) - 购自博大泰克生物基因有限公司，分 装后，2 0 。c 保存 2 5 0m g m l 氨苄青霉素a m p ( a m p i c i l l i n ) ：水溶，过滤灭菌，2 0 * c 保存【5 引。 2 5 0m g m l 羧苄青霉素c b ( c a r b e n i c i l l i n ) ：水溶，过滤灭菌，2 0 。c 保存【5 8 1 。 1 0 0 m g m l 卡那霉素k a n ( k a n a m y c i n ) ：水溶，过滤灭菌，2 0 *