胆固醇对人内皮细胞DNA的损伤及绞股蓝总苷的保护作用论文.pdf

遵义医学院硕士学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用d n ad a m a g eo fh u v e c si n d u c e db yc h o l e s t e r o la n dp r o t e c t i o ne f f e c to fg y p e n o s i d e sa b s t r a c to b j e c t i v e ：sw o r ki sd e v o t e dt oi n v e s t i g a t ed n ad a m a g eo fh u v e c si n d u c e db yc h o l e s t e r o la n dt h ep r o t e c t i o ne f f e c to fg y p e n o s i d e s m e t h o d s ：1 h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a le e l ll i n ec r l 17 3 0w a sc u l t u r e di nv i t r oa n di d e n t i f i e dw i t hv i i if l u o r e s c e n ta n t i b o d y 2 t h r e em e t h o d sw e r eu s e dt oe x a m i n e) , h 2 a x ：a f t e ri n c u b a t e dw i mc h o l e s t e r o la t12 5 m g l ，2 5 m g l ，5 0 m g lf o r12h o u r s ，t h e7 h 2 a xf o c if o r m a t i o ni nc r l - 17 3 0c e l l sw a sd e t e c t e db yi m m u n o f l u o r e s e e n c e ；t h ee x p r e s s i o n so f7 h 2 a xp r o t e i nw a se x a m i n e db yw e s t e r nb l o ta n df l o wc y t o m e t r y ( f c m ) 3 a f t e rao n eh o u r1 0 r e - t r e a t i n gw i mn a co rd i f f e r e n td o s a g e so fg y p e n o s i d e s c r l - 17 3 0c e l l sw e r ei n c u b a t e dw i t hc h o l e s t e r o la t5 0 m g lf o r12h o u r s t h ey h 2 a xl o c if o r m a t i o nw a sd e t e c t e db yi m m u n o f l u o r e s e e n c ea n dt h er h e a xp r o t e i ne x p r e s s i o n sw a sd e t e c t e db yw e s t e r nb l o t ；t h ee x p r e s s i o n so fr o sw e r ed e t e c t e db yf c m r e s u l t s ：1 v i i if a c t o ri m m u n o f l u o r e s c e n c et e s ts h o w sp o s i t i v ee n d o t h e l i a lc e l ld e n t i t yo ft h ec u l t u r e dc r l - 1 7 3 0c e l l s 2 a f t e r1 2h o u r sc h o l e s t e r o li n c u b a t i o n , t h ey h 2 a xf o c if o r m a t i o nw a sa b l et ob ed e t e c t e di na l l3c h o l e s t e r o ld o s a g eg r o u p w h i c hi n c r e a s e sw i n lt h ec h o l e s t e r o ld o s a g ea s c e n d i n g w e s t e r nb l o ta n df c ms h o w st h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f1 h 2 a xp r o t e i ni n c r e a s e sa l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo fc h o l e s t e r o ld o s a g e ，w h i c ha r ea l ls i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h e c o n t r o lg r o u p 3 i nt h en a co rg y p e n o s i d e sp r e - t r e a t i n gg r o u p ，t h e7 h 2 a xf o c if o r m a t i o nd e c r e a s e sa l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo fg y p e n o s i d e sd o s a g e m e a n t i m e ，t h e 饵2 a xp r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e ld e c r e a s e sw i t ht h ei n c r e a s eo fg y p e n o s i d e sd o s a g e b o t ht h e7 h 2 a xf o c if o r m a t i o na n dt h ep r o t e i ne x p r e s s i o nd e c r e a s es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a to ft h ec o n t r o lg r o u p f c ms h o w st h a tr o sl e v e ld e c r e a s e sa l o n gw i t ht h eg y p e n o s i d e sd o s a g ei n c r e a s e s ，w h i c hi ss i g n i f i e a n t l yl o w e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p c o n c l u s i o n ：1 c h o l e s t e r o li n d u c e sd n ad a m a g ei nh u v e c sb yi n c r e a s i n gr o sl e v e l s 2 g y p e n o s i d e sd e c r e a s e dd n ad a m a g ee f f e c to fc h o l e s t e r o lb yl o w e r i n gr o sl e v e l s k e yw o r d s ：g y p e n o s i d e s ；d n ad a m a g e ；c h o l e s t e r o l ；1 , h 2 a x ；r o s6 遵义医学院硕士学位论文胆固醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总茴的保护作用- i 一缩略词a la pa sa t ra r md a p id c f h d ad m s od n a p kd s b sf b sf c mf r r ch e p e sh u v e c sn a co do sp b sr o s? h 2 a xs d st r i s英汉缩略词对照表英文全称a c r yl a m i d ea m m o n i u mp e r s u l f a t ea t h e r o s c l e r o s i sa t ma n dr a d 3 一r e l a t e dp r o t e i na t a x i at e l a n g i e c t a s i am u t a t e dg e n e4 6 - d i a m i d i n o - 2 一p h e n y l i n d o l e2 7 - d i c h l o r o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t ed i m e t h y ls u l f o x i d ed n a - d e p e n d e n tp r o t e i nl d n a s ed n ad o u b l e s t r a n db r e a k sf e t a lb o v i n es e r u mf l o wc y t o m e t e rf l u o r e s c e i ni s o t j i o c y a n a t en - 2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - n - 2 一e t h o n e u l f o -u i c a c i dh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l sn - a c e t y l l - c y s t e i n eo p t i c a ld e n s i t yo x i d a t i v es t r e s sp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n er e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sp h o s p h o r y l a t i o no f h i s t o n eh 2 a xs o d i u md o d e c y ls u l f a t e2 - a m i n o 2 ( h y d r o x y m e t h y ) - 1 , 3 一p r o p a n e d i 0 13 中文全称丙烯酰胺过硫酸铵动脉粥样硬化a t m 和r a d 3 相关蛋白毛细血管共济失调突变基因4 , 6 二脒基2 苯基吲哚2 。7 二氯二氢荧光素乙酰乙酸二甲基亚砜d n a 依赖性蛋白激酶d n a 双链断裂胎牛血清流式细胞仪异硫氰酸荧光素n 2 羟乙基呱嗪一n 2乙磺酸人脐静脉内皮细胞n 乙酰半胱氨酸光密度氧化应激磷酸盐缓冲溶液活性氧簇磷酸化组蛋白十二烷基磺酸钠三羟甲基氨基甲烷遵义医学院硕士学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用刖吾动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 的系统研究开始于上世纪五十年代n 3 ，随后陆续展开了流行病学、临床和实验室研究，从整体、器官水平，再到细胞、分子水平，直到目前的基因组和功能基因组水平。虽对a s 有了较为深入的认识，在预防、诊断和治疗方面也取得了巨大的进步乜1 ，但其发病机制仍有许多问题需要深入的探索。早期动物实验提示：高胆固醇饮食可以诱发a s 口1 。以后提出的“胆固醇学说”认为：血清胆固醇水平增高不需要其它因素协同就能够诱发和推进a s 发生发展心3 。研究还发现：无论是人类自然发生或实验动物用高饱和脂肪和高胆固醇诱导的a s ，在动脉壁细胞内和细胞之间都有大量胆固醇及其酯沉积瞄1 。胆固醇致a s 的细胞分子机理始终是a s 研究中很受关注的问题。血管内皮细胞是参与a s 病变形成的三种主要细胞之一嗨 7 1 ，血管内皮细胞构成了血管内膜，对保持血管内皮系统的生物学功能至关重要。血管内皮细胞还能分泌多种活性物质，调节促凝与抗凝，纤溶与抗纤溶平衡等多种作用，血管内皮细胞结构与功能的异常被认为是a s 发生的始动环节呻1 。研究内皮细胞的损伤机制对认识a s 的发病机理十分重要。近年来有研究者提出将应激分为基因毒应激( g e n o t o x i cs t r e s s ) 与非基因毒应激。基因毒应激阳3 主要是在电离辐射) ( 线，紫外线，t o p o i s o m e r a s e 抑制剂和活性氧等各种应激原的作用下，细胞染色体d n a 发生了损伤。a s 发病中存在氧化应激机制，因此人们开始注意a s 中r o s 是否产生了基因毒应激? a s 的治疗困难并且容易复发。是否因存在d n a 损伤? a s 炎症反应中n f r b 的激活是否也可能导致基因毒应激?基因毒应激中存在的n f r , b 激活是否是引起其下游炎症因子表达改变而致a s 的原因? 总之，基因毒应激与a s 的关系已成为了倍受关注的一个问题，而目前对此问题的了解还很有限。近几年来，7 h 2 a x ( g a m m a - h 2 a x ，即磷酸化h 2 a x ) 与d n a 双链断裂( d n ad o u b l e s t r a n db r e a k s ，d s b s ) 的关系是国内外研究细胞d n a 应激损伤的一个热点n 们。h 2 a x 是组蛋白的一种，普遍存在于整个基因组当中。研究发现，h 2 a 组蛋白家族中有7 个成员：h 2 a 1 、h 2 a 2 、h 2 a x 、h 2 a z 、m a c r o h 2 a x l 、m a c r o h 2 a x 2 和遵义医学院硕十学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用h 2 a b b d ，其中h 2 a x 编码基因位于1l q 2 3 2 q 2 3 3 。h 2 a x 多肽链有1 4 2 个氨基酸残基，c 端的2 2 个残基序列与一些低等真核生物的h 2 a x 蛋白的c 端序列具有同源性并且在进化上高度保守，包含有一个1 3 9 位为丝氨酸残基的丝氨酸谷氨酰胺谷氨酸( s e r - g l n g l u ，s q e ) 结构域1 ，s q e 结构域中的s e r 残基可被磷脂酰肌醇3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e ，p 1 3 k ) 、共济失调毛细血管扩张突变基因( a t a x i at e l a n g i e c t a s i am u t a t e dg e n e ，a t m ) 、a t m 和r a d 3 相关蛋s ( a t ma n dr a d 3 2r e l a t e dp r o t e i n , a t r ) 和d n a 依赖性蛋白激酶( d n a - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，d n a - p k ) 等磷酸化口羽，磷酸化的h 2 a x 在d s b s 位点形成焦点( f o c u s ) ，并进一步募集许多与损伤修复相关的蛋白，如b r c a l ( b r e a s tc a l l c e ra s s o c i a t e dg e n e1 ) 、5 3 b p l ( p 5 3b i n d i n gp r o t e i n1 ) 、r a d 5 0 和n b s l 等，对d s b s 进行修复，并在损伤处形成焦点( f o c o 复合物n 引。r o g a k o u n 4 3 等于1 9 9 8 年首先观察到h 2 a x 暴露在电离辐射及其它引起d n a 双链断裂的药物下能迅速磷酸化，形成? h 2 a x 焦点，发现所形成的焦点数目与d s b s数目具有线性的正相关关系，h 2 a x 焦点和d n a 双链断裂在数量上呈现1 ：l 对应关系口副，随后进一步实验研究证明，y h 2 a x 焦点的形成没有细胞特异性n 副，任何一种因素诱导细胞产生的d n a 双链断裂( d s b s ) 都伴随h 2 a x 的磷酸化和簇集，形成饵2 a x 。故可根据研究需要，应用y h 2 a x 单克隆抗体作为一抗，再结合相应的荧光标记的二抗，通过免疫荧光分析，显示细胞核内饵2 a x 的形成情况n ，也可利用流式细胞术和免疫印迹法来检测细胞中7 h 2 a x 含量的变化，检测d n a 损伤。? h 2 a x 已被认为是细胞d s b s 检测的一个特异性指标，成为了测定d s b s 的金标准。中药绞股蓝( g y n o s t e m m a p e n t a p h y l l u mm a k i n o ) 为葫芦科绞股蓝植物，其药理作用比较广泛，主要有效成分为绞股蓝总苷( g y p e n o s i d e s ，g p s ) 剐。经研究证实，g p s 能增强机体清除自由基能力，具有抗氧化作用n 9 1 。绞股蓝总苷片在临床上已用于缸的防治，但其药效作用的机制，还有待深入研究。本室前期的研究发现，胆固醇通过激活h u v e c s 中n a d p h 氧化酶导致细胞内r o s 升高，n f r b 活化，产生细胞通透性增加，分泌功能改变等损伤反应啪t2 。g p s能显著降低胆固醇所致的细胞内升高的r o s 水平嗽1 ，降低胆固醇诱导的h u v e c s中n a d p h 氧化酶( n o x ) 活性，抑制n o x 4m r n a 和蛋白表达( 文章待发表) 。基因毒应激与a s 关系问题的提出启示我们想到，胆固醇所引起h u v e c s 中r o s遵义医学院硕+ 学位论文日日同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用的升高是否会产生细胞内d n a 的损伤，从而导致细胞结构与功能的异常? 如果引起了d n a 损伤，中药绞股蓝总苷抗氧化作用能否减轻细胞内基因毒应激? 对此问题探索将有助于深入认识胆固醇致a s 机制及a s 与基因毒应激的关系，并为a s 的抗氧化治疗提供理论依据。基于上述工作基础，本课题探讨内容如下：( 一) 胆固醇是否造成h u v e c s 中d n a 损伤7( 二) 胆固醇致h u v e c s 中d n a 的损伤是否与活性氧( r o s ) 有关?( - - ) g p s 能否保护胆固醇所致的h u v e c s 中d n a 损伤?遵义医学院硕士学位论文胆固醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苜的保护作用1 材料与方法1 1 主要实验材料h u v e c s ( c r l 1 7 3 0 )r p m l l6 4 0 干粉培养基胎牛血清胰蛋白酶青霉素、链霉素g l u t a m i n e二甲基亚砜g p s 干粉制剂，纯度9 8 胆固醇抗氧化剂n a c2 ，7 - 二氯二氢荧光素乙酰乙酸( d c f h d a )鼠抗人v w f 单克隆抗体鼠源r h 2 a x 单克隆抗体f i t c 标记山羊抗鼠i g gh r p 标记山羊抗小鼠d a p ih e p e s 、d m s o4 多聚甲醛a c t i n 抗体t r i sp v d f 膜s d st r i t o nx 1 0 0w e s t e r n 细胞裂解液蛋白m a k e r山羊血清美国a t c c 公司g i b c o 公司杭州四季青公司上海生物工程有限公司华北制药厂a m r e s c o 进口分装美国s i g m a 公司西安赛邦医药科技有限公司美国s i g m a 公司美国s i g m a 公司美国s i g m a 公司武汉博士德公司美国u p s t a t et e c h n o l o g y 公司碧云天公司j a c k s o n 进口分装碧云天公司a m r e s c o 进口分装博士德生物工程有限公司碧云天公司美国p r o m e g a 公司m i l l i p o r e 公司美国s i g m a 公司碧云天公司博士德生物工程有限公司f e r m e n t a s 公司博士德生物工程有限公司遵义医学院硕七学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用b c a 蛋白浓度测定试剂盒丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺其余试剂均为国产分析纯1 2 主要实验仪器c 0 2 孵箱超净工作台( y j 1 4 5 0 )磁力搅拌器倒置显微镜显微照相机凝胶成像分析仪流式细胞仪司台式冷冻离心机荧光显微镜( b x - v r a 2 c )电子分析天平p h 计6 孔培养板2 5 c m 2 培养瓶胞刮2 0 m l 冻存管自动酶标仪滤器、滤膜( 孔径0 2 2 p a n )单道可调式移液器超声波清洗机( f q c 3 0 0 )恒温振荡器( t h z 9 5 )电热鼓风干燥箱( g z x 9 0 7 0 m b e )上海捷瑞生物工程有限公司美国s i g m a 公司晶美生物工程公司美国t h e r m o 公司苏州净化设备厂上海南汇电讯器材厂日本o i y m p u s 公司日本o l y m p u s 公司美国伯乐公司美国b e c k m a n 公美国b e c k m a n 公司日本o l y m p u s 公司德国s a r t o r i u s 公司美国t h e r m o 公司美国c o s t a r 公司美国c o s t a r 公司美国c o s t a r 公司美国c o s t a r 公司德国h u m a r e a d e l 公司美国m i l l i p o r e 公司法国g i l s o n 公司江苏无锡福尼达电子公司江苏太仓医疗器械厂上海博迅医疗设备厂遵义医学院硕士学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用液氮生物容器( y d 3 0 8 0 )超纯水机( k l r o 2 0 )三用电热恒温水浴箱四川金风液氮容器有限公司四川康宁实验专用纯水设备厂天津泰斯特仪器有限公司1 3 主要实验试剂( 1 ) p b s 称取8 0 9 n a c l ，o 2 9 k c l ，3 4 8 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，0 2 9 k h 2 p 0 4 倒入盛有8 0 0 m l 双蒸水的烧杯中，在搅拌器上搅拌使其溶解，调节p h 值为7 2 ，定容至1 l ，高压蒸汽灭菌2 0 m i n ，4 。c 保存备用。( 2 ) r p m l l 6 4 0 培养液：取一包r p m l l 6 4 0 干粉剂，加入2 0 9n a h c 0 3 及3 0 9h e p e s ，溶于8 0 0 m l 三蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋2 3 次( 冲洗液一并加入培养基中) ，搅拌至粉剂全部溶解，调p h 至7 2 ，定容至1 l ，用0 2 2 1 a m 微孑l 滤膜过滤除菌，分装，4保存备用，另取少量培养液置于细胞培养箱内2 4 h 孵育检菌，使用前加入胎牛血清、双抗、谷氨酰胺配成r p m l l6 4 0 完全培养液。( 3 ) 抗生素：一瓶8 0 万u 瓶青霉素溶于4 m l 双蒸水中，一瓶1 0 0 万u 瓶链霉素溶于5 m l 双蒸水中。l o o o m l r p m l l 6 4 0 培养液分别加两种抗生素各0 5 0 m l ，使抗生素在培养液中的终浓度均为1 0 0 u m l 。( 4 ) 0 2 5 胰酶：称取0 6 2 5 9 胰蛋白酶粉于烧杯中，用少量已消毒p b s 调成糊状，移入2 5 0 m l 容量瓶中，p b s 定容，混匀。用0 2 2 p , m 的微孔滤膜过滤除菌，按每瓶1 5 m 1分装，密封，2 0 保存备用。( 5 ) 2 0 0 m m o l l 谷氨酰胺液：称取2 9 2 2 9 谷氨酰胺粉于小烧杯中，用双蒸水溶解，加至1 0 0 m l 即配成2 0 0 m m o l l 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，2 0 保存，使用时可向1 0 0 m l 培养液中加入l m l 谷氨酰胺溶液。( 6 ) 细胞冻存液( 临用前配制) ：将r p m l l 6 4 0 培养液、胎牛血清、d m s o 按照7 ：2 ：1的比例现配现用。( 7 ) 胎牛血清：5 6 水浴中灭活3 0 r a i n ，分装，2 0 保存备用。( 8 ) o 2 t r i t o nx 1 0 0 - 0 2 m lt r i t o nx - 1 0 0 溶于1 0 0 m lp b s 中。( 9 ) 4 台盼蓝母液：取台盼蓝4g ，少量蒸馏水研磨，加双蒸水至1 0 0m l ，滤纸过滤后4 c 保存备用。遵义医学院硕士学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用( 1 0 ) n a c 储存液：称取1 0 0 m g n a c 粉末，溶于6 0 0 1 x l 灭菌双蒸水中，配成l m o l l的储备液，2 0 保存，用前加入不同量培养基配成终浓度1 0 m m 。( 1 1 ) 胆固醇储存液：称取1 0m g 胆固醇粉末，溶于l m l 的无水乙醇中，配成1 0 0 0m g m l的储备液，震荡混匀后，2 0 。c 保存，用前加入不同量培养基配成终浓度1 2 5 9 9 m l2 5 9 9 m l 、5 0 9 9 m l 。( 1 2 ) 绞股蓝总苷储存液：称取1 0m g 绞股蓝总苷粉末，溶于l m l d m s o 中，配成1 0 。0 0m g m l 的储备液。震荡混匀后，- 2 0 c 保存，用前加入不同量培养基配成终浓度为1 0 0l x g m l ，1 0 岭r r d ，1l x g m l 的绞股蓝总苷溶液。( 1 3 ) t r i s h c l 缓冲液( 0 5 m ，p h 7 6 ) ：称取t r i s 6 0 5 7 9 ，先用5 0 0 m l 双蒸水溶解t r i s ，加入h c l 后，用1 nh c l 将p h 调至7 6 ，最后加双蒸水至1 0 0 0 m l ，4 。c 保存。( 1 4 ) t b s ：量取 i r i s - h c l 缓冲液1 0 0 m l ，称取n a c l 9 9 ，先以少量双蒸水溶解n a c l ，再加入t r i s h c l 缓冲液，用双蒸水定量至1 0 0 0 m l 。( 1 5 ) t b s t - 在t b s 内加入t w e e n2 0 ，使t w e e n2 0 的终浓度为o 1 。( 1 6 ) 3 0 丙烯酰胺溶液：称取丙烯酰胺2 9 2 0 9 ，n ，n - 亚甲基双丙烯酰胺l g ，溶解于蒸馏水中，溶解后加双蒸水定量至1 0 0 m l ，并确认溶液p h 值小于7 0 ，4 。c 避光保存。( 1 7 ) 1 0 十二烷基硫酸钠( s d s ) ( w v ) 储备液：称取1 0 9s d s ，溶解于1 0 0 m l 双蒸水中，室温保存。( 1 8 ) 1 0 过硫酸胺( a p ) ( w v ) 储备液：称取o 1 9 过硫酸胺，l m l 双蒸水溶解，4 。c保存，1 周内使用。( 1 9 ) 1 5 m o l l l r i s ( p h = 8 8 ) 缓冲液：称取t r i s1 8 1 7 9 ，溶解于1 0 0 m l 双蒸水中，调p h 值至8 8 。( 2 0 ) 1 0 m o l l l r i s ( p h - - 6 8 ) 缓冲液：称取t r i s1 2 1 9 ，溶解于1 0 0 m l 双蒸水中，调p h 值至6 8 。( 2 1 ) 电泳缓冲液( 1 0 ) ：称取3 0 9 t r i s 、1 4 4 9 甘氨酸和1 0 9 s d s ，依次加入，溶解于8 0 0 m l 双蒸水中，调p h 值至8 3 ，用双蒸水补充至1 0 0 0 m l 。( 2 2 ) 电转缓冲液( 5 ) ：称取2 9 9 t r i s 、1 4 5 9 甘氨酸和1 8 5 9 s d s ，溶解于6 0 0 m l 双蒸水中，用双蒸水补充到1 0 0 0 m l 即可。遵义医学院硕十学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用1 4 实验方法1 4 1 培养并鉴定人脐静脉内皮细胞株1 4 1 1 细胞的复苏( 1 ) 将水浴锅预热至3 7 。c ，从液氮罐中迅速拿出细胞盒，取出所需的细胞，迅速将冻存管投放到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并不断的摇动冻存管，使管中的液体迅速融化：( 2 ) 约1 - 2 m i n 后冻存管内液体完全溶解，从水浴中取出，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，旋开冻存管；( 3 ) 将冻存管内的液体移至离心管，滴加1 0 倍体积的r p m l l 6 4 0 培养液，1 0 0 0 r p m 离心5 m i r a( 4 ) 弃去上清，滴加含1 0 f b s 的r p m l l 6 4 0 培养液4 m l ，吹打制成细胞悬液；( 5 ) 将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入3 7 c 和5 c 0 2的培养箱内培养，8 1 2 小时后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。1 4 1 2 细胞的消化传代( 1 ) 待细胞生长融合，铺满细胞瓶底，弃去原培养基，p b s 洗2 次；( 2 ) 向细胞瓶内移入0 6 m l0 2 5 胰蛋白酶，3 7 c ，消化2 - 3 m i n ；( 3 ) 待胞质回缩、间隙增大弃去消化液；( 4 ) 向细胞瓶内移入含1 0 f b s 的r p m l l 6 4 0 培养液3 m l 终止消化，吹打细胞，制成细胞悬液；( 5 ) 将细胞悬液滴入计数板计数，按( 2 3 ) x 1 0 5 细胞触细胞密度接种到新的培养瓶中，移入3 7 c 和5 c 0 2 的培养箱中培养。1 4 1 3 细胞的冻存( 1 ) 换含1 0 f b s 的r p m l l 6 4 0 培养液培养1 2 小时，待细胞生长至对数生长期；( 2 ) 弃去原培养基，p b s 洗2 次，0 2 5 胰蛋白酶消化，将消化液移入离心管，1 0 0 0 r p m离心5 m i n ，弃上清，收集细胞；( 3 ) 移入冻存液制成细胞悬液，调整细胞密度为( 1 - 3 ) x 1 0 6 m l ；( 4 ) 分装，每冻存管l m l ，旋紧管盖，封口，做好冻存标记；( 5 ) 先将冻存管放入4 。c 冰箱3 0 m i n ，接着置于一2 0 c 冰箱，约3 0 6 0 m i n ，置于8 0 超低遵义医学院硕士学位论文胆固醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用温冰箱中过夜，置于液氮罐中长期保存，同时在自己的笔记本和冻存记录本上记录。1 4 1 4 细胞的鉴定用因子( f a c t o r r e l a t e da n t i g e n v o nw i l l e b r a n df a c t o r ) 单克隆抗体和c y 3 标记山羊抗鼠i g g 作用后，免疫荧光法鉴定人脐静脉内皮细胞株。方法如下：( 1 ) 将细胞爬片，培养在6 孔培养板内盖玻片上，种植密度为1 0x1 0 5 m l ，当细胞生长至近融合状态时，取出玻片，p b s 润洗玻片，用丙酮在细胞面于2 0 固定1 0m i n ；( 2 ) p b s 润洗玻片3 次，每次5m i n i( 3 ) 干燥后，滴加适量一抗鼠抗人工作液( 1 ：1 5 0 倍稀释) ，放入湿盒内4 。c 过夜，同时不加一抗以p b s 磷酸缓冲液替代作阴性对照；( 4 ) p b s 润洗玻片3 次，每次5m i n i( 5 ) 干燥后，滴加适量c y 3 标记的二抗溶液( 1 ：5 0 倍稀释) ，3 7 。c 湿盒内保温2 h ；( 6 ) p b s 润洗玻片3 次，每次5i i l i i l ；( 7 ) 取出玻片，用蒸馏水润洗最后一次，用滤纸吸去水滴，用一滴缓冲甘油封片；( 8 ) 立即在荧光显微镜下观察，拍摄。1 4 2 免疫荧光检测细胞内 , h 2 a x 形成的焦点1 4 2 1 实验分组1 4 2 1 1 观察胆固醇对h u v e c s 中d n a 损伤分组阴性对照组：含i f b s 的r p m l l 6 4 0 组实验组：a i ：1 2 5 m g l 胆固醇作用组a 2 ：2 5 m g l 胆固醇作用组a 3 ：5 0 m g l 胆固醇作用组1 4 2 1 2 观察抗氧化剂n a c 对胆固醇所致h u v e c s 中d n a 损伤影响分组阴性对照组：含i f b s 的r p m l l 6 4 0 组实验组：b i ：5 0 m g l 胆固醇作用组b 2 ：5 0 m g l + 1 0 m mn a c 胆固醇作用组遵义医学院硕十学位论文胆固醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用1 4 2 1 3 观察绞股蓝总苷对胆固醇所致h u v e c s 中d n a 损伤保护作用分组阴性对照组：含i f b s 的r p m l l 6 4 0 组实验组：c i ：5 0 m g l 胆固醇作用组c 2 ：5 0 m g l 胆固醇+ 1g g m l 绞股蓝总苷作用组c 3 ：5 0 m g l 胆固醇+ 1 0 1 t g m l 绞股蓝总苷作用组c 4 ：5 0 m g l 胆固醇+ 1 0 0 r t g m l 绞股蓝总苷作用组1 4 2 2 免疫荧光的检测( 1 ) 培养细胞，取生长状态良好的细胞，调节细胞浓度( 1 2 ) x1 0 5 m l ，接种于6 孔板中，传代培养；( 2 ) 待细胞贴壁，生长至对数生长期，换1l i l l 含1 f b s 的r p m l l 6 4 0 培养液培养1 2 h ，使细胞同步化，按实验分组要求分别加入相应因素作用1 2 h ；( 3 ) 细胞处理1 2 h 后，用1m l4 多聚甲醛固定1 5m i n ，4o c ；( 4 ) 预冷p b s 洗细胞三次，每次5 m i n ，r t ；( 5 ) 用0 2 t r i t o nx 1 0 0 冰上破膜1 5 m i n ，冰上破膜；( 6 ) 预冷p b s 洗细胞三次，每次5 m i n ，r t ；( 7 ) 每孔滴加1 0 0 i t l 山羊血清，封闭2 h ，3 7o c ；( 8 ) 预冷p b s 洗细胞三次，每次5 m i n ，r t ；( 9 ) 每孔滴加5 0 山鼠? h 2 a x 单克隆抗体( 1 ：1 0 0 0 倍稀释) ，水浴孵育细胞2 h ，3 7 。c ；( io ) 预冷p b s 洗细胞三次，每次5 m i n ，r t ；( 1 1 ) 每孔滴加5 0 灶lf i t c 标记的二抗( 1 ：5 0 0 倍稀释) ，水浴避光孵育细胞1 h ，3 7 ；( 1 2 ) 预冷p b s 洗细胞三次，每次5 m i n ，r t ；( 13 ) 每孔滴加5 0 1 1 1 d a p i ( 1 ：10 0 0 倍稀释) 核染色，10 m i n ，r t ；( 1 4 ) 预冷p b s 洗细胞三次，每次5 m i n ，r t ；( 1 5 ) 9 0 甘油封片，荧光显微镜下观察。1 4 3w e s t e r n b l o t 检测细胞内? h 2 a x 蛋白表达水平1 4 3 1 实验分组：遵义医学院硕+ 学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用1 4 3 1 1 观察胆固醇对h u v e c s 中d n a 损伤分组阴性对照组：含i f b s 的r p m l l 6 4 0 组实验组：m i ：5 0 m g l 胆固醇+ 1 0 0 1 x g m l 绞股蓝总苷作用组m 2 ：5 0 m g l 胆固醇+ 1 0 m mn a c 作用组m 3 ：1 2 5 m g l 胆固醇作用组m 4 ：2 5 m g l 胆固醇作用组m 5 ：5 0 m g l 胆固醇作用组1 4 3 1 2 观察绞股蓝总苷对胆固醇所致h u v e c s 中d n a 损伤保护作用分组阴性对照组：含i f b s 的r p m l l 6 4 0 组实验组：n i ：5 0 m g l 胆固醇作用组n 2 ：5 0 r n g l 胆固醇+ 1 0 m mn a c 作用组n 3 ：5 0 m g l 胆固醇+ 1 9 9 m l 绞股蓝总苷作用组n 4 ：5 0 m g l 胆固醇+ 1 0 1 x g m l 绞股蓝总苷作用组n 5 ：5 0 m g l 胆固醇+ 1 0 0 1 x g m l 绞股蓝总苷作用组1 4 3 2 蛋白质样品的制备：( 1 ) 取生长状态良好的细胞，用含i f b s 的r p m l l 6 4 0 作用细胞1 2 h ，同步化后，换不同终浓度的胆固醇作用细胞1 2 h ；( 2 ) 去除旧培养液，用预冷p b s 洗一遍，每一细胞瓶加入1 5 0 u l 裂解液，充分裂解后，用细胞刮收集细胞，将裂解液转移至离心管内；( 3 ) 1 4 0 0 0 9 离心1 0 分钟，取上清，保存于- - 8 0 。c 。1 4 3 3 蛋白质定量：b c a 蛋白定量法，按说明书操作，步骤如下：( 1 ) 根据样品数量，按5 0 ：1 比例配制b c a 工作液；( 2 ) 将标准品按o ，1 ，2 ，4 ，8 ，1 2 ，1 6 ，2 0ul 加到9 6 孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到2 0ul ；( 3 ) 加适当体积样品到9 6 孔板的样品孔中，加标准品稀释液到2 0ul 。遵义医学院硕士学位论文胆固醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用( 4 ) 各孔加入2 0 0l alb c a 工作液，3 7 放置3 0 m i n ；( 5 ) 在酶标仪5 7 0 n m 波长测蛋白o d 值；( 6 ) 根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。1 4 3 4 用w e s t e r n b l o t 检测7 h 2 a x 的表达：( 1 ) s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳装配胶板，配制5 m l1 2 分离胶，将配制好的分离胶倒入胶板夹缝中，胶面上加l m l 无水乙醇，1 5 m i n 待胶凝固后，用滤纸小心吸出残留的无水乙醇，用双蒸水冲洗玻璃板外表面洗去未聚合的丙烯酰胺；装配胶板，配制3m l 浓缩胶，配制好浓缩胶后，灌在分离胶面上，并插入梳子待胶凝固( 约3 0 分钟) ，处理样品：将蛋白样品2 0 山在沸水浴中煮沸5 分钟；将凝固的胶板固定于电泳槽内，倒入电泳缓冲液( 1x ) ，拔出梳子；点样：将蛋白分子量标准( m a r k e r ) 与样品依次加入点样孔；电泳：电压4 0 v ，至溴酚蓝到达分离胶底部时，终止电泳。( 2 ) 电转：剥胶，制作“三明治”( 依次按：滤纸、凝胶、p v d f 膜、滤纸叠放) 4 0 v稳压1 2 0 分钟，冰水浴中电转；( 3 ) 封闭：将p v d f 膜置于杂交袋中，w e s t e r nb l o t 膜封闭液封闭，4 过夜；( 4 ) 一抗杂交：把p v d f 膜放在密闭塑料袋中，根据滤膜面积以0 5 m l e m 2 的量加入一抗和a c t i n 抗体( 一抗用封闭液稀释，效价比l ：1 , 0 0 0 ) 稀释液与滤膜温育，3 7 c孵育- - d , 时。( 5 ) 洗膜：倒掉一抗溶液，t b s t 漂洗液洗膜3 次，每次5 m i n ，r t ；( 6 ) - 抗杂交：把p v d f 膜放在密闭塑料袋中，根据滤膜面积以0 5 m l c m 2 的量加入二抗( - - 抗用封闭液稀释，效价比1 ：1 , 0 0 0 ) 稀释液与滤膜温育，3 7 c 孵育- d , 时。( 7 ) 洗膜：倒掉二抗溶液，用t b s t 漂洗液洗3 次，每次5 m i n ，r t ；( 8 ) 底物显色：化学发光显色法( h r p ) ，按a 、b 液各lm l 配制显色液，暗室曝光，显影、定影。遵义医学院硕十学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用1 4 4 流式细胞术检测细胞内t h 2 a x 蛋白表达水平1 4 4 1 实验分组：阴性对照组：含i f b s 的r p m l l 6 4 0 组实验组：p 1 ：溶媒组( 无水乙醇)p 2 ：1 2 5 m g l 胆固醇作用组p 3 ：2 5 m g l 胆固醇作用组p 4 ：5 0 m g l 胆固醇作用组1 4 4 2 流式细胞术分析1 , h 2 a x 表达量( 1 ) 取生长状态良好的细胞，用含i f b s 的r p m l l 6 4 0 作用1 2 h 使细胞同步化后，换不同终浓度的胆固醇作用1 2 h ；( 2 ) 消化、离心收集细胞( 1 0 0 0r p m ，5 r a i n ) 于离心管中；( 3 ) 用含0 1 t r i t o nx - 1 0 0 的p b s 作用5 r a i n ，4 预冷的p b s 洗细胞两次；( 4 ) j j l 入3 0 r d 山羊血清封闭1 0 m i n ，弃去山羊血清；( 5 ) 加入适量一抗一鼠抗人单克隆抗体( 1 ：5 0 0 倍稀释) ，3 7 孵育l h ；( 6 ) 预冷p b s 洗细胞一次；( 7 ) 滴加f i t c 标记的二抗( 1 ：5 0 0 倍稀释) ，3 7 水浴避光孵育1 h ；( 8 ) p b s 洗细胞两次后上机检测。1 4 5 流式细胞术检测细胞内活性氧水平1 4 5 1 实验分组：1 4 5 1 1 观察n a c 对胆固醇所致h u v e c s 中d n a 损伤影响分组阴性对照组：含i f b s 的r p m l l 6 4 0 组实验组：r 1 ：溶媒组( 无水乙醇)r 2 ：5 0 m g l 胆固醇作用组r 3 ：5 0 m g l 胆固醇+ 1 0 m mn a c 作用组遵义医学院硕士学位论文胆同醇对人内皮细胞d n a 的损伤及绞股蓝总苷的保护作用1 4 5 1 2 观察绞股蓝总苷对胆固