顺铂.奈达铂.奥沙利铂致豚鼠螺旋神经节细胞凋亡及caspase-3活化的对比研究.pdf

顺 铂 .奈 达 铂 .奥 沙 利 铂 致 豚 鼠螺 旋 神 经 节 细 胞 凋 亡 及 caspase-3 活化 的对 比研究 a poptosis and caspase-3 e xpression of spiral g anglion c ells in g uinea p igs c ochlea w ith c isplatin. n edapiatin. o xaliplatin o totoxicity 指 导小组成 员 名 单 导 师 王胜 资 （ 教授 ，主任 医师 ) 导师组成 员 王纾 宜 （ 病理科主任 医师 ) 陈 念祖（ 药 剂科 副 主任 药 师 ) 目 录 英 文缩 略 词表 1_2 巾文摘 要 3-6 英 文 摘 要 7-11 弓i 言 12-13 第一部分 等摩尔量顺铂 ，奈达铂 ，奥沙利铂致 内耳毒性 的适宜剂量 摸 索 材料和 方法 14 结 果 14 讨 论- 14-16 第 二 部 分顺 铂 .奈 达 铂 .奥 沙 利 销 致 豚 鼠螺 旋 神 经 节 细 胞 凋 亡 及 caspase-3 活化 的对 比研 究 材 料和 方法 16-18 结 果 18-20 讨论 20-22 参考 $ 献 22-24 文献综 述 25 - 34 致 谢 35 封底 英文缩 略词表 英 文缩 写 英 文全名 中文 全名 5-fu 5- fl uorouracil 5-氟尿 喃淀 tu n el td t-m ediated du tp ni ck end label ing 原位末端标记法 sg c spi ral ganglion cel l 螺旋神经节细胞 a u c a rea under concentration-tim e curve 药 时 曲线下 面积 pb s phosphate belanced sol uti on 礎酸缓冲液 ed ta ethyl ene d i am i ne tetraaceti e a ci d 乙二胺四乙酸 t d t t herm al death tim e 热 力致死 时间 dn tp d eoxy n tp 脱氧核苷三磷酸 h r p h orseradish peroxidase 辣 根过氧化物酶 d a b d iam inobenzidine 二氨 基联 苯胺 a i a verage i ndex 凋亡细胞数/_ 2 c d d p c isplati n 顺铂 n ed p n edapl atin 奈达铂 gd n a d eoxyri bonucl ei c aci d 脱氧核糖核酸 m td n a m i tochondrial d n a 线 粒 体d n a ca p com pound acti on potenti al 复合动作电位 c m c ochlear m icrophonic potential 耳锅微音器电位 ep endocochlear pot ential 锅 内电位 a b r a udi tory brai nstem response 听性脑干反应 r n a r ibonucleic a cid 核糖 核酸 g sh g lutathi one 谷 胱甘 肽 g sh - px g l ut athi one peroxi dase 谷腕甘肽过氧物酶 g x g x gl utat hi one reductase 谷胱甘肽还原酶 so d superoxi dase dism utase 超氧化物酶歧化酶 ca t cat hydrogen peroxi de enzym e 过氧化氧酶 lpo lpo l ipi d peroxi dase 脂质过氧化物酶 n o n o nitric oxide 氧化 一氮 i n o s i n o s ni t ric oxi de synthase 氧化一氮合酶 du tp d eoxyuridi ne triphosphate 脱氧尿苷三磷酸 a io d a verage i ntegral opti cal densi ty 阳性面积 比 x o d 值 d po a e d istortion product o toacoustic em ission 畸变 产物 耳声发射技术 t e o a e transient evoked otoacoustic em issions 瞬态 诱发性耳 声发射 c pp32 c ystei ne protease protein 分子量为32kd 的半|光 氨酸蛋白酶 c a d c arbam yl phosphate synthetase, aspartate transcarbam ylase and di hydroorotase, 氨 甲酰磷 酸合 成 酶 2 中文摘要 研究背景与 目的： 铂类药物 是迄今为止应用最广泛的抗肿瘤药物之一 。 基于顺铂 ， 奈达铂 ， 奥沙利钼在头颈部肿瘤治疗中的广泛应用及 良好疗效，治疗 中带来的毒 副作用 也成 为选 择用药 的主要考虑 因素 。怕类药物 的主要共 同毒 性为 ：肝毒性 ， 肾毒性 ，血液毒性 ，耳毒性等 （ 各药毒性又侧重不 同） 。近来关于铂类药物 的肾 毒性 已有一定防护措施 ，但对 于耳毒性 的防治手段则相对落后 ，原 因之一就在于 对铂类药物耳毒性的发生机理不十分明了， 关于铂类药物耳毒性机制及耳毒性大 小方面的研究也甚少 5。因此深入探讨铀类药物耳毒性机制可为其耳毒性的防护 提供新思路 ，且可就在耳毒性方面，为顺钼 ，奈达铂及奥沙利铂 的临床选择应用 提供依据。我们参考顺钴引起细胞凋亡致耳毒性机制的研究方法 ，就奈达铂、奥 沙利铂致豚 鼠螺旋神经节细胞凋亡及caspase-3活化进行研究及对比，旨在对顺 铂 、奈达铂 、奥沙利怕耳毒 性机 制进行探讨 ，对其耳毒性大 小进行对 比。 方法 ：首先取30只 正常 白化青年豚 鼠摸索 出建立 活体耳毒性模型适宜剂量 ，尔后 取48只听力正常 的 白化 青年 豚 鼠，随机分为对照组 、顺铂组 、奈达铂组、奥 沙利 铂组 ；分组注射前述 摸索 出的摩尔量三种铂类化疗药 ，对照组注射生理盐水 ，用 t u n el 法检测 各组凋亡 细胞数量变化 ，用免疫组化法检 测各组螺旋神经节细胞 中caspase-3的表达。tu n el切片观察凋亡指数 （ a i) ，caspase-3切片观察免疫 组化 阳性 指数 （ a io d 二 阳性 面 积 比 x o d 值 ） 。组 内及组 间数据 用m icrosoft e xcel 2000 软件包进 行单 因素方差分析 ；结果均采用均数 标准差表示 ，分别 以 p 0. 05和p 0. 0 1作为显著性判 断标准 。 结 果 ： 1.建立活体耳毒性模型适宜等摩 尔量顺 铂 、奈达铂 、奥沙利铀剂量分别为 12. 5m g/kg, 12. 6m g/kg, 16. 6m g/kg。 2.以此剂量建立 耳毒性模型后取耳蜗组织切片进行凋亡检测及caspase-3免疫组 化 染色 后分析数据 得 出1) 顺铂组螺旋神经节细胞凋亡与 以往类似 实验研究结果 符 合 。2 ) 等 摩 尔量 奈达 铂组 豚 鼠耳蜗 中螺旋神经节细胞t u n e l 染色细胞数 明显 增加，此时检测螺旋神经节细胞中caspase-3免疫组化染色出现阳性结果，说明 sg c 凋亡中有caspase-3的激活，与对照组比较有统计学意义。3) 奥沙利铂组螺 旋 神经节细胞t u n el 染色细胞数稍有增加 ，此 时检测螺旋神经节细胞 中 caspase-3免疫组化染色阳性不明显，较对照组无统计学意义。4) 顺铂组与奈达 铂 组相 比无 明 显统 计学意 义 。 结论：在对照组和实验组中caspase-3的表达状况与tu n el染色阳性细胞的出现 基本相符 。顺钼组及奈达铀组较对照组凋亡及caspase-3阳性表达较对照组 比较 具有明显差异，提不caspase-3介导的信号传导机制可能参与了c d d p 、n ed p所 3 致 的耳蜗细胞 凋亡过程 ，并导致耳毒性 的发 生 ，此 实验结果可为临床上 实现对 c d d p 、n ed p 耳毒 性 的有 效防护提供理 论基 础 。但 两 组 间未见 明显 统计 学差 异 ， 未能证 明顺铂 耳毒性高于奈达铂 。奥沙利铂组未见细胞 明显凋亡 ，因其 1) 内耳 毒性较小，2) 在内耳中代谢动力学与顺铂有很大差异 （ 5m g/kg顺铂的a u c 曲线 与16. 6m g/kg奥沙利钼的a u c 曲线相似），3) 活体动物内耳毒性模型建立存在较 大难度 （ 在 产 生 内耳毒性 前 已因其 它全 身 副作用 致死 ）。其 内耳 毒性机 制有 待 进 一步研究，建议以后研究方向可考虑活体外细胞水平建立模型以便研究 1 5。 关键词 ：顺铂 、奈达铂 、奥沙利铂 、耳毒性 、螺旋神经节、凋亡 4 a b stra ct b ackground and purpose: pl atinum drugs so far the m ost w i dely used anticancer drugs. b ased on the w idely used and good efficacy of cisplati n. nedaplati n,. oxali plati n in the treatm ent of head and neck cancer, treatm ent toxi ci ty has also becom e a m ajor consideration for the choice of drugs. t he m ain com m on toxi ci ty of plati num drugs: liver toxicity, kidney toxicity, blood toxici ty, ototoxicity (drug toxicity and different em phasis). r ecent renal toxicity of platinum drugs have a certain protective m easures, but the for ototoxici ty control m eans is relatively backw ard, one of the reasons is that the m echanism of the ototoxici ty of platinum drugs is not very clear, ototoxic m echani sm of pl ati num drugs and ototoxi ci t y si ze and l i t t l e 5 . dept h of t he m echanism of toxici ty of pl atinum drugs ear protection for its ototoxici ty provide new ideas, and m ay provide the basis for t he clinical sel ection of t he applicati on of cisplati n, nedapl ati n and oxali pl ati n in ototoxici ty. w e refer to the cisplati n-i nduced m echanism of apoptosis induced ototoxici ty research m ethods, nedapl ati n, oxali plati n induced spiral ganglion cell apoptosis and caspase-3 activation studies and contrast, aim s to cispl ati n, nedapl atin, oxali plati n ototoxic m echani sm to explore and com pare the size of the ototoxici ty. m eth ods: first, take the 30 norm al albino young guinea pigs w orked out to establish the appropriate dose of in vivo ototoxicity m odel and then, take the 48 norm al hearing young al bi no gui nea pigs w ere random ly di vided i nto control group, cispl ati n, nedapl atin group, o xaliplati n group; packet injection foregoing w orked out a m olar three platinum -based chem otherapy drugs, the control group i njected w ith saline, changes in the num ber of apoptotic cells detected by tij n e l m ethod, each group of spi ral ganglion cell s detected by i m m unohistochem ical m ethod caspase-3 expressi on. t u n e l slice observe the apoptotic index (a i)， caspase-3 slices observed i m m unohistochem i cal posi ti ve i ndex (a io d = posi ti ve area than x o d val ue). g roup and betw een groups of data using m icrosoft excel 2000 soft w are package, single-factor analysis of variance; results are the m ean 土 standard deviation (x 士 s)， respectively, p 0 05 and p 奈达销 1只存 活 ，奥沙利铀 组无存 活 。高剂 量 (第 ： ： 、 第 四浓 度梯 度 ） ：顺 钿组 脉 鼠注射 药物 第二 天始见全 身毛色 ，嘴唇及 脚 掌粘膜 灰暗 ，精 神萎 靡 ，活动 及进 食减 少 ；奈达 怕组进食可 ，活动可 ，出现 严 重腹汚现 象 ；奥沙利拍 组 毛 色 ，粘膜 灰暗 ，四肢 发抖 ，活动减 少 。从上表可看 出， 9 最适宜 的剂量浓度 为第一 ，及 第二梯度浓度 。因考虑 到奥沙利铀 耳毒性较小 ，且 有研究表明 6 静脉注射5i ng/ kg顺销的au c 曲线与16. 6m g/ kg奥沙利铀的au c 曲线 相似，且5m g/kg顺钿剂量不足以致耳毒性。 所以最终选择第二梯度浓度为本实验 用 药剂 量 。 讨论 白化藤 鼠为销类药物耳毒性研究应用最 多 的动物 ，因藤 鼠耳锅大 ，易操作 ， 且其对顺钼耳毒性敏感 。诸多实验总结 出最适宜建立耳毒性模 型的膝 鼠体重为 250g-350g 7，8，9， i g。怕类药物具有耳毒性，但耳毒性不是其最最主要的毒副作用， 据 临床用药经验 ， 三种铀类药物 中顺铀 ， 奈达钼 ， 奥沙利铀 耳毒性应 呈递减趋 势 。 用药方式有持续滴注及 大剂量调时给药两种 ， 研 究证 实大 剂量调 时给药抑癌效果 更好。顺柏临床常用剂量为1 oom g/ m 2， 奈达钼为80-1 oom g/ m 2， 奥沙利销为 130m g/ i n2 i ，2，3，。一般情况下，人用药量与豚鼠的用药量比例是1: 15或1: 20，即藤 鼠每千克用药量是人每千克用药量的15-20倍 n ，当给药途径不同时，剂量有所 增减 。顺 拍 主要副作用 为 ：肾毒性 、胃肠道 毒性 、耳 毒性 及 神经 毒性 。奈达铀抗 癌作用机制与顺销相 同，与顺怕、卡钻无完全交叉耐药性 。其毒性包括呕吐 、骨 髓抑 制和 严 重 的血 小板 减 少症 ，毒 副作用 小， 胃肠 道 、 肾毒性 、耳毒性 、神经毒 性 明显降低 。奥沙利钼 与顺销 ，卡拍无交叉耐药性 ，主要副作用为 ： 血液毒性， 胃肠 道毒性 ，周围感觉神经病变可见在产 生耳毒性 的 同时也产 生 了全身其 它毒副作用 。 在顺钼致藤 鼠耳毒性剂量方面前人 已有所研 究 ， 我们 以顺销为参照 ， 通过此 实验尽量摸索 出适宜 的三种怕类药物致厥 鼠耳毒性 剂量 ， 但 同时又要考虑 其它全身副作用 ，保证藤 鼠存活超过三天 。参照顺铀剂量研究，选取四个浓度梯 度顺钼剂量 ，相应等摩尔量 的奈达销 ，奥沙利钻剂量 。实验得 出在兼顾 耳毒性及 全 身其它 毒 副作 用 的 同时 ，最适 宜 的剂量浓 度 为顺 钼 12. 5m g/ kg， 奈 达 销 12. 6m g/ kg,奥沙利钻 16. 6nig/kg。 耳毒性为钻类药物共有的毒副作用， st engs等 1 2】 对白化膝鼠进行剂量相关耳 锅电生理学变化得出：0. 7-1. 25m g/kg/d 仅引起 12， 16kh z 电生理学变化。是否发 生耳毒性的过渡剂量为 . 25-: i, 5m g/kg/d 连续腹腔注射 8 天， 1. 5 与 2. 0m g/kg/d 顺 铀剂量连 续 8 天可引起 电生理 学显著变化 。 在藤 鼠中顺怕 主要损伤耳锅柯蒂 氏器 (主要为外毛细胞 ）及螺旋神经 节细胞 （ i 型螺旋神经节细胞脱髓鞘 ） ，其损伤可 在 4 周后恢复，lom g/ kg 顺怕为可致血管纹 tun el 染色阳性及细胞调亡的临界 最低 剂 量 。但 关于奈达 铀 及奥沙 利柏耳 毒性 剂量 尚无 具体前 人研 究可 寻 。 关于奈 达销及奥沙利柏耳毒性及其机制缺 乏具体研究及 统计 。 动物模 型中钴 类致耳毒性剂量的研究也仅顺怕较详细，奈达钼及奥沙利钼缺乏此方面的研究 。 10 81 61 1 3等 1 2 对白化膝鼠进行剂量相关耳帳电生理学变化得出：0. 7-1. 25m g/ kg/d仅 弓 丨 起12,16kh z电生理学变化。是否发生耳毒性的过渡剂量为1. 25-1. 5m g/kg/d for8 days, 1. 5与2. 0m g/kg/d顺钿剂量连续8天可引起电生理学显著变化。在膝鼠中顺铀 主要损伤耳锅柯蒂 氏器 （ 主要为外毛细胞 ）及螺旋神经节细胞 （ i型螺旋神经节 细胞脱髓鞘 ） ，其损伤可在4周后恢复，lom g/kg顺铀为可致血管纹tu n el染色阳 性及细胞调亡的临界最低剂量 ，20m g/kg为顺钼藤 鼠模型致死剂量 。v ictori a 在藤鼠静脉注射致耳毒性的等摩尔量顺怕 （ 12. 5m g/kg) 及奥沙利铀 (16. 6m g/kg ) 后，豚 鼠耳锅外淋 巴液中顺怕浓度显著高于奥沙利钻浓度 ，而 5i ng/kg顺怕的a u c 曲线与16. 6m g/kg奥沙利铀的a u c 曲线相似，显示两药具有显 著不同的耳锅药代动力学。实验要摸索出最适宜等摩尔量顺钼，奈达怕，奥沙利 销组藤 鼠耳毒性剂量 。我们 以以往 实验膝 鼠耳毒性剂量为参考 ，设置四个顺铀致 耳毒性剂量，分别从10m g/kg-20m g/kg。相应奈达怕与奥沙利铀组，注射后根据 藤鼠存活率，最后确定最适宜剂量顺铀为：12. 5m g/kg,奈达铀为：12. 6m g/ kg， 奥 沙利柏为：16. 6nig/kg.为下一步实验做准备。 结论 高浓度梯度 （ 第三 ，第四浓度梯度 ）铀类药物注射后3天膝 鼠存活率低 ，顺 销组主要死于肾毒性及血液毒性 ，奈达铀组 胃肠道反应严重，奥沙利销组 四肢感 觉神经麻瘦症状明显，血液毒性严重。 在考虑藤 鼠除耳毒性外的其它全身严重毒 副作用下仍存活，最后适宜耳毒性模型剂量在第一第二浓度梯度 当中，由于考虑 到奥沙利铀耳毒性较小的缘故，故最后我们选择的最适宜耳毒性模型剂量顺铀 为：12. 5m g/ kg， 奈达柏为：12. 6m g/kg,奥沙利钼为：16. 6m g/kg。 参考 文献 1.梁岩， 何拓 ，孙翠萍， 等.抗肿瘤用药的应用及进展.中国医疗前沿 ，2009，4 (2 1 ) :17-18 . 2.宋慧忠 ，张石革， 等.问顾怕类化合物 的发展历程及临床评价.中 国医院用药评 价与分析，2004, 4(1): 5-8. 3.林 晓雯， 张艳华， 等.祐类抗肿瘤 药 的进展 与临床评价.中国医院用 药评价 与分 析 ，2011, 11(1): 4-6. 4. 廖英俊， 汤浩， 金亚平， 等. 抗癌药顺销对小 鼠的耳、肾和肝毒性及其机制的研 究j .中国药理学通报，2004，20(1): 82-85. 11 5.黄世 勇 ，陶泽章， 等.连翘酯哲对顺钼耳 毒性 防护作用 的实验研 究.journal of a udiology and speech pathol ogy 2011, 19 (2) :152-156. 6. v i ctori a h ellberg ， inger w alli n ， sofi eriksson , et al. c isplatin and o xaliplatin toxici t y; im port ance of c ochlear k i netics as ad eterm i nant for o totoxicity. j n atl c ancer inst 2009;10 1(1): 37 47, y. w atanabe k , inai s , jinnouchi k , et al. e xpression of caspase activated deoxyri bonuclease ( c a d ) and caspase23 (c pp32) in the cochlea of cisplatin (c d d p)2treated guinea pigsj . a uri s n o w l arynx , 2003 , 30(3) : 2 19-225. 8.张民， 刘兆华， 姬长友， 等.顺销致膝鼠螺旋神经节细胞调亡及c aspase-3 活化 的研究 j. 听力学及言语疾病杂志，2003,11 : 40-42. 9.张量， 孙大宇， 杨志航， 江敏， 等.顺销致膝鼠耳毒性作用中细胞调亡及caspase-3 表达的研究.中国医药导报，2011，8(4): 24-26. 10.郝帅，姜学钧，杨梓， 李魏， 惠莲， 等.顺铀对藤鼠耳祸毛细胞的损伤j. 中国耳鼻咽喉头颈外科，2006， 13 (11) : 781-783. 11. 丁 大连 ，李 明 ，姜泗长 ，等.内耳形 态 学 ：第 8 页. 12. stengs c h m , k lis sfl , h uizing e h , et al. c isplatin ototoxicit y: an el ectrophysiol ogi cal dose- ef feet study i n al bino gui nea pig j . h ear r es, 1998,124(1-2): 99. 第 二部分 （ 正式 实验 部分 ） 顺钼.奈达钼.奥沙利钼致藤 鼠螺旋神经节细胞调亡及 caspase-3 活化 的对 比研 究 自2000年 以来 ，顺销致 内耳毒性细胞调亡机制有 不少研究 出现 ，w atanabe 等 1 研究表明： 注射顺销后， 膝鼠耳祸血管纹各圈细胞tunel染色阳性增加， cpp32 及ca d 免疫组化在耳锅各圈血管纹及螺旋朝带细胞出现阳性结果。 11 1等 2 报道， 在caspase-3 水平上阻断细胞调亡的通路可以有效的保护神经元和毛细胞。sai to 等 3的研究结果也证实在顺钼造成听力下降的同时有调亡现象的发生，此时检测 螺旋神经节细胞中caspase-3免疫组化染色出现阳性结果，说明sg c 调亡中有 caspase-3的激活。张民等丨4，郝帅等151 实验结果表明：注射顺钼后毛细胞及螺旋 神经节细胞受损，在细胞内观察到caspase-3免疫阳性反应，并见调亡细胞。 上述 实验 摸 索 出等摩 尔量 的适 宜顺钿 ，奈达钿及 奥 沙利祐 致 耳 毒性剂量 ，我们 选 用摸 索 出 的 剂量 建 立销 类 耳毒性模 型之 后 成 功取 出耳锅 标本 ，对 标本进 行 处理 ， 分析各实验组较对照组 内耳细胞调亡情况及caspase-3的表达差异，各销类实验 组 间细胞调 亡及caspase-3阳性表达 的差异。 以此证 明顺怕 ，奈达柏 ，奥沙利 铀 12 致 内耳毒性是否与细胞调亡及caspase-3通路有关，且三种祐类药物在此通路上 有何差异 。为柏类药物 内耳毒性防护提供思路，为临床用药选择提供依据 。 材料与方法 1. 动物实验方法 1.1实验 动 物 及 分 组 选用48只健康白化青年脉鼠，体重250g350g，由复旦大学附属眼耳鼻喉科 医院动物房提供 。 检查所有动物耳廓反射灵敏， 无中耳炎 。 动物随机分为对照组 、 注射顺铀组、奈达铀组、奥沙利钻组，每组各12只藤 鼠。 1. 2动物模 型 的建立 注射用顺铀针 （ 南京制药厂有限公司，批号 p20091021205885，20r ng/支）， 顺钼组膝鼠腹腔注射顺钼12. 5m g/ kg; 注射用奈达铀 （ 南京先声东元制药，国药 准字h 20030884，lom g/瓶），奈达销组膝鼠腹腔注射奈达销12. 6m g/kg; 注射用 奥沙利铀 （ 江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字h 20000337，50m g/瓶），奥 沙利钼组膝 鼠腹腔注射奥沙利拍16. 6m g/kg; 注射用生理盐水，对照组膝鼠腹腔 注射生理盐水12. 5m g/kg。 1. 3耳祸石 蜡 切 片制备 待各组动物用药后三天， 用1% 戊巴比妥钠 （ 40 m g/kg)腹腔麻醉， 快速断头， 迅速取出听泡。打开听泡后，充分暴露耳妈 ，在解剖显微镜下刺破圆窗膜 ，将镫 骨底脱位暴露卵圆窗，在锅顶钻 一小孔。用微量注射器缓慢注入含40g/l 的多聚 甲醒的憐酸缓冲液 （ pb s，ph =7. 4) ，再将标本置于该固定液中4 c 浸泡过夜后， 经pb s冲洗后放入40g/l 的ed ta 溶液中，4c 下脱妈2? 3周，梯度酒精脱水，二 甲苯透明，常规石錯包埋 ，沿锅轴正中行4t xm 连续切片。 1. 4t u n e l 染 色法 耳妮组织常规脱錯 至水 ；3% h 20 2室温 孵育切片 20m i n; 将蛋 白酶 k (20问/m l) 37c 孵育切片 20m i n; tunel 混合液 u 液： 1m l td t buf ferx 1+ 101 td t b 液：101 bioti n-dn tp) 37c 轉育切片 ih; 漂洗；st reptavidi n-h rp 1: 200 37 c 孵育 30m in; 0. 04% d a b +0. 03% h 20 2 显色 lom i n； 水洗； 苏木素衬染 im in ; 水洗蓝化 ；吹干后常规树脂封片；镜下观察照相，阳性核呈棕黄色 。 1. 5caspase-3 免疫组织化学染色法 石錯切片常规脱錯至水；ph 6. 0，0. 01m 梓檬酸缓冲液热诱导修复(微波 3 档 20m i n), 室温 自然冷却 ；oj % h 20 2 抑制 内源性过氧化物 酶室温 20nii n; 20% 正 常羊血清室温 勝 存 30m i n , 不洗 ；b m p2 ( 1: 200) 37 c _ 育 2h ; en v isi on 试 剂 (h r p-m )37 c 30m i n； d a b 显色 8? 丨 2m i n ; 苏木素衬染色 ，热 水蓝化 ；吹干后 ， 树脂封片；镜 f 观察，核紫蓝色，阳性呈棕黄色，膜 内侧阳性。阴性对照染色切 片用 pb s 代 替 -抗 。 13 2.观 察及 统计 分析 2.1 图像 分 析 tun el及caspase - 3染色切片由上海求为生物科技有限公司m iq a s医学图 象定量分析系统分析，在10 x40 视野下，每张切片随机取5个视野 。tu n e l 切片 观察调亡指数 ：5个高倍视野计数阳性细胞数 ，换算为平均每平方毫米的调亡细 胞数，即为a i。caspase-3切片观察免疫组化阳性指数 （ a io d =阳性面积比x o d 值 )。 2. 2 数据处理 与分析 文中数据使用m icrosoft excel 2000 软件包进行单因素方差分析 ；结果均采用 均数 标准差 （ x s)表示，分别 以p 0. 05和p 0. 01作为显著性判断标准 。 结果 1.1螺旋神 经 节细胞 调亡 的检测 藤 鼠sg c 位于锅轴 内，聚集成 团， i 型sg c 数量多，呈类圆形 ，胞菜丰富， 核 大居 中， 有 明显 的核仁 。ii型sg c 相对较小 ， 呈梭形 散在分布于螺旋神经节 内。 正常藤 鼠sg c 形态清晰 ，很少见到调亡现象 (见图1) 。 注射顺铀3天后 ，sg c 出现 明显 的调亡 ，tu n e l 染色 阳性 ，细胞核呈棕黄色 着色 (见 图2)。注射奈 达钼3天后 ，sg c 出现 明显 的调亡 ，tu n e l 染色阳性 ，细 胞 核呈 棕 黄色 着色 ，但 较顺销 组 浅 （ 见 图3 ) 。注射 奥 沙利 铀3天 后 ，sg c 形 态清 晰 ，很 少 见到 调亡现象（ 见图4 ) 。 经 图像分 析：顺铀组 、奈达销 组 、奥沙利铀组a i值分别 为18. 83 0. 44 、17. 74 1.18、3. 54 0.17 , 与对 照组 （ a i值 为2. 98 0. 99) 相 比， 顺 拍 组 、奈 达 钼 组？ 0.05) 。 1. 2 sg c caspase - 3 的表达 对照组c aspase -3免疫组化染色阴性，胞质内无棕黄色染色 (见图5) 。 c aspase - 3染色阳性结果表现为胞奖中有大量棕黄色染色颗粒分布。经图像分 析 ， a io d值与对照组 （ a io d 值 为 1. 770. 25) 相 比，顺铀组 、奈达铀组 a io d 值分别为28. 6士 0. 44，25. 8 1. 91, 脉鼠sg c 的caspase - 3染色呈阳性反应 (见图6， 图7)， 有显著性差异（ p , ？ ?今 ?- ? ? 7 ? ? / - z 1 ?！ t j v ?广 图1- 对照组tunel染色 ： 正常螺旋神图2- 顺怕组tunel染色：螺旋神经节 经节细胞tunel染色 形态清晰，细胞tunel染色，细胞核呈棕黄色着 很少见到凋亡现象 x400 色，凋亡现象明显 x400 ？ 、， ” - ? -r c r . 、? ?v iv : * 厂： ； 广， - ? 義 ? ；v v ! m ; 二 厂. ？ ： 、 * f i -. *? * v 4 /. ? /?， ， s 一r ?1 ! / /? * / ? 3 ? v ? “ , j 、 ，0. 05。 讨论 恶性肿瘤严重威胁人类的生命，为人类的第二大杀手。自1969年r osenberg 最先发现钻类化合物具有抗癌活性 以来， 对销类化合物 的研究和应用得到了迅速 的发展 。顺铀是临床常用的高效，广谱抗肿瘤药 ，据报道 ，在头颈部癌 中，顺钼 单药有 效率可达25 % ? 41% ,其采用 以顺钻为主 的化疗 方案 ， 其总有 效率 为67 % 。 奈达柏对抗肿瘤活性与顺铀相当， 临床前生物学研究表 明奈达销对小 鼠p388 白血 病 、b 16黑色素瘤 、lew is肺癌 的拮抗作用优于顺钼 ，在头颈部癌 中使用 单剂量奈 达钿其有效率大于25% 。奥沙利怕的载钻氨基结构变化 ，改变 了抗肿瘤活性，其 活性谱 与顺钻有显著 的差别 ，对l 1210、p388、lew is肺癌 、b 1 6黑色素瘤等均有 明显的抑瘤作用 。 包括对顺钻和卡怕耐药株也有显著抑制作用，奥沙利柏单一用 药对初 治和五氟尿啼淀耐药 的晚期结、直肠癌都具有很好的抗肿瘤作用 ，效率在 29% 以上 _。 基于钻类药物较好的抗肿瘤作用及广泛的临床应用，其所带来的副作用不容 忽视 ，成为临床用药选择的一个重要考虑因素。目前临床上针对铀类药物肾毒性 己经有 了一定的保护措施 ，但对于耳毒性 的防治手段则相对落后 ，原因之一就在 于对钴类药物耳毒性的发生机理不十分明了。 因此深入探讨怕类药物耳毒性机制 16 可 为其耳毒性 的防护及 临床应用 的选择提供新思路 。 以往的研究认为钼类耳毒性机制可能存在的四种机制：1)铀类 内耳蓄积的直 接作用；2)对内耳代谢的影响；3)氧化应激损伤：发现活性氧产生的直接证据较 少，主要通过各种抗氧化剂能减轻内耳损伤来间接证实；4)调亡是钴类使耳锅内 细胞损伤死亡的重要方式 9， 。 近来有不少文章集中研究顺销通过细胞调亡致耳毒性。a lam 等 11 的实验证 实 ：顺铀可 以经细胞调亡途径造成耳毒性损伤 。本研 究显示 ：注射 内耳毒性剂量 顺怕后 ，膝 鼠耳锅 中螺旋神经节细胞tu n e l 染色细胞数明显增加 ，说明模型动 物中出现了螺旋神经节细胞调亡现象。 li u等 2 报道，在caspase-3 水平上阻断细 胞凋亡的通路可以有效的保护神经元和毛细胞.sai to等 3的研究结果也证实在顺 销造成听力下降的同时有调亡现象的发生， 此时检测螺旋神经节细胞中caspase-3 免疫组化染色出现阳性结果，说明sgc调亡中有caspase-3的激活。w at anabe等 研究表 明：注射顺怕后，膝 鼠耳锅血管纹各 圈细胞tunel染色阳性增加 ，底转较 顶转明显。c pp32 及c a d 免疫组化在耳祸各圈血管纹及螺旋朝带细胞出现阳性 结果。张民等i 4的研究结果也显示，注射顺钼后sg c 的tun el染色明显增强， caspase-3p20 活性片段的表达增高， 与对照组比较均有显著性差异。 郝帅等5 实验结果表明： 注射顺铀后毛细胞受损， 在细胞内观察到caspase-3免疫阳性反应， 并 见 凋 亡细 胞 。 本 实验 顺铀组螺旋神经节细胞 调亡与 以往类似 实验研 究结果符合 。我们 参考 顺拍耳毒性模型研究方法 ，注射等摩尔量的奈达销与奥沙利怕建立 内耳毒性模 型，观察螺旋神经节细胞的凋亡情况及其caspase-3免疫组化阳性表达。结果显示 奈达铀组藤 鼠耳锅 中螺旋神经节细胞tu n el 染色细胞数明显增加 ，此时检测螺 旋神经节细胞中caspase-3免疫组化染色出现阳性结果，说明sg c 调亡中有 caspase-3的激活，与对照组比较有统计学意义。奥沙利钻组螺旋神经节细胞 tun el染色细胞数稍有增加，此时检测螺旋神经节细胞中caspase-3免疫组化染 色 阳性不明显 ， 较 对照组无统计学 意义 。顺销组与奈达铀组相 比无 明显统计 学意 义 。 本研究结果显示：顺钼组中caspase-3表达显著增强，表明在cd d p致脉鼠耳 毒性的损伤过程中，c d d p可使caspase-3的表达增强。奈达钼组中caspase-3表达 显著增强，表明在n ed p致膝鼠耳毒性的损伤过程中，n ed p可使caspase-3的表 达增强。从实验结果中还可看出：在对照组和实验组中caspase-3的表达状况与 tu n el 染色阳性细胞的出现基本相符，提示caspase-3介导的信号传导机制可能 参 与 了c d d p 、n ed p所致 的耳赐 细胞调亡过程 ，并导致耳毒性 的发生 。此实验 结果可 为临床 上实现对c d d p 、n e d p 耳毒性 的有效防护提供理论基础 。奥沙 利 怕 组 未 见细 胞 明显潤亡 ，因其 丨 ）内耳毒性较 小 ，2 ) 在 内耳 中代谢 动力 学与顺怕 17 有很大差异 （ 5m g/kg顺铀的a u c 曲线与16. 6m g/kg奥沙利铀的a u c 曲线相似） ， 3) 活体动物 内耳毒性模型建立存在较大难度 （ 在产 生 内耳毒性前 已因其 它全身副作 用致死 ）。其 内耳毒性机制有待进一步研究 ，以后研究方 向可考虑活体外细胞水 平建立模型以便研究 1 2】 。 结 论 1 . 藤 鼠注射顺铀顺怕12. 5m g/kg后可产生耳毒性， 内耳螺旋神经节细胞调亡较对照 组明显增多 ，螺旋神经节细胞中caspase-3阳性表达明显增强。与 以往类似研究 结论相同： caspase-s介导的信号传导机制可能参与了顺铀所致的耳锅细胞调亡过 程 ， 2.与上述顺铀等摩尔量的奈达钼12. 6nig/kg后产生耳毒性，内耳螺旋神经节细胞 调亡较对照 组 明显增 多，螺旋神经节细胞 中caspase-3阳性表达 明显增 强 。与 以 往类似研究结论相同： caspase-3介导的信号传导机制可能参与了顺钼所致的耳锅 细胞调亡过程 。此结论未有类似研究，需证实还需做更多研究 （ 采用多种方式证 明螺 旋神经 节细胞 的凋亡 ）。 3.顺铀组及奈达柏组 比较无 明显差异 ， 在此实验 中无法证 明两者耳毒性有 明显差 bi 升。 4.奥 沙利钴 组较对 照组相 比未见细 胞 明显 调亡 ，因其 内耳 毒性较 小 ，活体动物 内 耳毒性模型 建立存在较大难度 （ 在产生 内耳毒性前 已因其它全身副作用致死 ）。 其 内耳毒性机制有待进 一步研究 ， 以后研 究方 向可考虑活体外细胞水平建立模型 以便研究1 2。 参考 文献 l w atanabe k , inai s ， ji nnouchi k ， et al. e xpression of caspase activated deoxyri bonuclease ( c a d ) and caspase23 (c pp3 2) in the cochl ea of cisplatin (c d d p)2treated guinea pigs j . a uri s n ow larynx ， 2003 ， 30(3) ； 2 19-225. 2丄iuw ， s taecker h , stupakh , et al, c aspase inhibitors prevent cispla tin induced apoplos is of auditory sensory cells n euroreport, 1998; 9(11): 2 6 0 9 -2 6 14 . 3. saito t , a ran jm c om parative ototoxicity of cisplati n during acute and chronic treatm ent j . o r l j o torhinolaryngol r elat spec ， 1994 ,56(6) : 315-320. 4.张民， 刘兆华， 姬长友， 等.顺铀致膝鼠螺旋神经节细胞调亡及c aspase-3 活化 的研究m . 听力学及言语疾病杂志，2003,11(1): 40-42. 郝帅，姜学钧，杨梓， 李魏， 惠莲,等.顺怕对膝鼠耳鹏毛细胞的损伤j . 中国耳鼻咽喉头颈外科，2006,13 (11 ) : 781-783. 6.梁岩 d 可銜 ，孙翠萍， 等.抗肿 瘤 用药 的应用及进 展 .中 国医疗 前沿 ，2009，4 ( 2 1 ) :17 -18 . 18 7.宋 慧忠 ，张石革 ， 等 .回顾 铀 类 化合物 的发展 历程及 临床评 价.中国医院用药评 价与分析 ，2004，4(1): 5-8. 8.林 晓雯， 张艳华， 等.销类 抗肿 瘤药 的进展与临床评价 .中国医院用药评价 与分 析 ，2011，11(1): 4-6. 8.韩 永涛 ，冯孟林 ，等 .含 奥沙利销 的化 学治疗方案 治疗晚期头颈部癌 的疗效 . 中国新药 与临床杂志 ，2008， 27 (5) ： 353-355. 9.费文彬，江洋， 等.顺铀耳毒性的研究.journ