（生物化学与分子生物学专业论文）大鼠kctd10基因的克隆及功能研究.pdf

摘要 肿瘤坏死因子q ( t n f q ) 是一个多功能的细胞因子，在许多细 胞生理过程中起重要作用，比如细胞凋产、细胞增殖、b 细胞激活、 肝细胞的再生以及些急性的细胞炎痘反应等。人类的 p d i p i ( o o l y m e r a s ed e l t a i n t e r a c t i n gp r o t e i ni ) 是j 中受t n f a 和白介素6 ( i l - 6 ) 诱导的蛋白，并且能与增殖细胞核抗原( p c n a ) 和 d n a 聚合酶6 的小亚基有相互作用。p d i p i 家族的另一个成员t n f a i p i 蛋白( 又称为b 1 2 基因) ，能够受t n f q 诱导，并且能与p c n a 、p 5 0 相互作用。在大鼠中，也证实了p d i p i 和t n f a i p l 基因的存在并且已 被克隆。我们用大鼠的p d i p i 基因在g e n e b a n k 中搜寻到了一组与 p d i p i 有较大的序列相似性的e s t ，并且通过r a c e 扩增出了其c d n a 全长，命名为k c t d i o ( p o t a s s i u mc h a n n e lt e t r a m e r i s a t i o n d o m a i n c o n t a i n i n g1 0 ) 。大鼠k c t d l 0 与p d i p i 及t n f a i p i 在氨基 酸序列上高度保守，在n 端区域，都有一个b t b p o z 的结构域：而在 c 端区域，则是p c n a 的结合基序( q t k v e f p ) 。根据p d i p l 和t n f a i p l 能够与p c n a 和p s o 相互作用，我们用免疫共沉淀等方法确定了大鼠 k c t d i o 与p c n a 以及p 5 0 之间也有相互作用。同样，因为t n f 一能 够诱导p d i p i 和t n f a i p i 基因的表达，我们通过t n f - i 诱导n i h 3 t 3 细胞从而使k c t d i o 基因的表达水平升高，从而得出k c t d i o 同样能够 被t n f - a 诱导的结论，因而从功能上证明了k c t d i o 与p d i p i 、 t n f a i p i 之间的同源性。n o r t h e r nb l o t 和实时定量p c r 显示k c t d i o i j i 主要在肺里面表达，其次是心脏和睾丸。我们的研究为进一步研究 p d i p i 家族的功能提供了基础。 关键词：大鼠，k c t d i o ，基因克隆，免疫共沉淀，肿瘤坏死因子a a b s t r a c t t u m o rn e c r o s i sf a c t o ra ( t n f q ) i sam u l t i f u n c t i o n a l c y t o k i n et h a tp l a y sr o l e si nav a r i e t yo fc e l l u l a rp r o c e s s e s s u c ha sa p o p t o s is ，p r 0 1 i f e r a t i o n ，bc e l la c t i v a t i o n ，l i v e r r e g e n e r a t i o na n ds o m ei n f l a m m a t o r yr e s p o n s e s h u m a np o l y m e r a s e d e l t a i n t e r a c t i n gp r o t e i n1 ( p d i p i ) i sas o r to fp r o t e i ni n d u c e d b yt n f qa n di n t e r l e u k i n6 ( i l 一6 ) b e s i d e s ，p d i p ic a ni n t e r a c t d i r e c t l yw i t hp r 0 1 i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n ( p c n a ) a n dt h e s m a l is u b u n i to fd n ap o i y m e r a s e6 ( p 5 0 ) t h ep d i p lg e n ei sa l s o f o u n di nr a tg e n o m ea n dh a sa l r e a d yb e e ncl o n e d b ys e a r c h i n g t h eg e n e b a n ke s td a t a b a s eu s i n gt h er a tp d i p ic d n a ，w ef o u n d ag r o u po fe s ts e q u e n c e st h a ts h a r e ds i g n i f i c a n th o m o l o g i e s w i t hr a tp d i p i ，a n dw ec l o n e dt h ef u l ll e n g t hc d n ao ft h e h o m o l o g u eg e n eo fr a tp d i p ib yr a c ep c r ，n a m e di ta sr a tk c t d i o t h ed e d u c e dp r o t e i no fr a tp d i p la n dk c t d l 0s h a r e6 5 1 s e q u e n c e i d e n t i t yw i t h e a c ho t h e ra n da r eh i g h l yc o n s e r v e di nm a j o r i t y o f t h em i d d l ep o r t i o no f t h et w op r o t e i n s ，w h i c he n c o d ea b t b p o zd o m a i na tt h en - t e r m i n u sa n dap c n ab n d i n gm o t i f ( q t k v e f p ) a tt h ec - t e r m i n u s ，r e s p e c t i v e l y a sp d i p ic a n i n t e r a c tw i t hp c n aa n dp 5 0 ，i no r d e rt oc o n f i r mt h eh o m o i o g y b e t w e e nr a tp d i p ia n dk c t d i o ，w ed e m o n s t r a t et h ei n t e r a c t i o n v b e t w e e nr a tk c t d i o a n d p c n a ，p s 0b yu s i n g c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y s a sp d i p ic a r lb ei n d u c e db y t n f aa n dt n f qp l a y sr o l e si nl i v e rr e g e n e r a t i o n 。t h e e x p r e s s i o no fk c t d i om r n ac o u l db ei n d u c e db yt n f ai nn i h 3 t 3 c e l l s - n o r t h e r nb l o ta n d q u a n t i t a t i v er e a l t i m e p c r d e m o n s t r a t e dt h a tm o u s ek c t d i ow a sp r e d o 川i n a t e l ye x p r e s s e di n 1 u n g ，w h i l el o w e re x p r e s s i o no fk c t d i ow a sd e t e c t e di nh e a r t a n dt e s t i s o u rw o r k sp r o v i d eab a s i sf o rf u r t h e rf u n c t i o n a l s t u d i e so fp d i p i f a m i l y k e y w o r d s ： r a t ，k c t d l 0 ， c 0 一i m m u n o p r e c i p i t a t io n v g e n ec l o n i n g ， 。t n f q 英文缩写表 聚合酶6 相互作用蛋白1 p c n a ：p r o l i f e r a t i o nc e l ln u c l e a ra n t i g e n 增殖细胞核抗原 k c t d 1o ：r a tp o t a s s i u mc h a n n e lt e t r a m e r i s a t i o nd o m a i nc o n t a i n i n g10 钾离子四聚体通道区域1 0 t n f a i p1 ：t u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h a - i n d u c e dp r o t e i n1 t n f a ：t u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h a 肿瘤坏死冈子c 【诱导蛋白1 肿瘤坏死因子a d a b ：3 ，3 - d i a m i n o b e n z i d e n e3 ，3 - 二二氨基对二氨基联苯 b s a ：b o v i n es e r u ma l b u m i n蝴白蛋白 c d n a ：o o m p l e m e n t 州d n a 璐bd n a p b s ：p h o s p h a t e b u f f e r e dsaline磷酸缓冲液 e c o l i ：e s c h e r i c h i ac o l i k d ：k i l o i n l t o n 人肠杆菌 千道尔顿 l b ：l u r i a b e r t a n im e d i u m l b 培养基 o d ：哪c a ld e n s i t y o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e 龇i o n s d s ：5 赫u md o d e c y ls u l 触 t e m e d ：n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l 一 光密度 开放阅读框 聚台酶链式反应 - t - = n n 粼 n ，n ，n ，n 一四甲 e t h y l e m e a m p ：a m p i c i l l i n d t t ：d i t h i o t h r e i t o l p m s f ：p h e n y l m e t h y ls u l f o n y l f l u o u r i d e 乙二胺 氨苄青霉素 二硫苏糖醇 苯甲基磺酰氟 g s p ：g e n es p e c i f i cp r i m e r 基因特异性引物 前。言 在真核细胞中，d n a 复制至少需要五种不同的d n a 聚合酶，人们把 它们命名为p o lq 、p o lb 、p o l8 、p o ly 、p 0 1 8 ”“1 。d n a 聚合酶a 在细胞的复制过程中主要负责前导链和滞后链的r n a d n a 、d n a d n a 的合成1 ，p o lb 、p o l e 主要和d n a 修复有关m 1 ，p o ly 与线粒体d n a 的复制有关瞳一。擎d n a 聚合酶6 具有持续合成d n a 链的能力和校正功 能，具有3 一5 核酸外切酶活力，是完成复制的主要酶聃。通过深 入的研究发现，d n a 聚合酶6 必须与解旋酶形成复合体，该复合体 促进o k a z a k i 片段前体的形成进一步引发d n a 的合成“州。其次，d n a 聚合酶6 在引物末端低水平的链延伸过裎中需要蛋白质辅因子p c n a 的参与3 。据最近的研究，哺乳动物的d n a 聚合酶6 由四个亚基组 成，即p 1 2 5 、p 5 0 、p 6 8 、p 1 2 “，但是研究比较多的p 1 2 5 、p 5 0 ，p 1 2 5 是d n a 聚合酶6 的催化亚基，p 5 0 不行使酶的功能，对p 1 2 5 和p c n a 的相互作用是必需的，它的第三个亚基p 6 8 的c 端有一个p c n a 的类 似p 2 1 ”“的结合位点，与s p r o m b ep o l6 的第三个亚基c d c 2 7 ， sc e r e v i s i a e 的第三个亚基p 0 1 3 2 p 以及酵母p o l8 的第三个亚基相 同。据研究，c d c 2 7 在细胞周期中特别是在g 2 m 检测点上起着非常 重要的作用 1 0 o p d i p i ( p o l y m e r a s ed e l t a i n f e r a c t i n gp r o t e i n1 ) 是通过酵母双 杂交技术发现的一个可与d n a 聚合酶6 ( p o l6 ) 小亚基( p 5 0 ) 相 互作用的新蛋白，进一步研究发现，该蛋白还能与增殖细胞抗原 ( p c n a ) 相互作用并在p c n a 存在时促进d n a 聚合酶6 ( d n ap o l6 ) 的活性“。人类p d i p i 基因位于1 6 号染色体的1 6 p l1 2 位点上，其 c d n a 全长1 6 3 3 b p ，编码区为9 9 9 b p ，编码_ 个分子量为3 2 9 k d 的蛋 白质。p d i p i 蛋白与t n f a i p i 蛋白结构上非常相似。t n f a i p i ，又称 为b 1 2 ，是w o l f f w 等人克隆的一个受肿瘤坏死因子q ( t n f a ) 诱 导的蛋白( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r qi n d u c i b l ep r o t e i ni ) 。本实 验室克隆了大鼠的p d i p i 和t n f a i p i 基因，并发现大鼠p d i p i 蛋白和 t n f a i p i 蛋白结构上非常相似，两种蛋白的n 端都含有b t b p o z 结构 域，c 端都含有p c n a 结合模体( p c n a b i n d i n gm o t i f ) 。g s t p u l i d o w n 和免疫共沉淀分析表明，t n f a i p i 和p d i p i 都能与p c n a 相互作用， 并且在p c n a 存在能促进d n a 聚合酶6 的活性。故我们把t n f a i p i 归为 p d i p i 基因家族的成员之一3 。同时，有研究表明人类p d i p i 蛋白的 合成也能受肿瘤坏死因子q ( t n f _ q ) 和白介素6 ( i l - 6 ) 的共同诱 导“3 1 。肿瘤坏死因子q 因最初被发现能造成肿瘤组织坏死而得名。 根据其来源和结构的不同，可分为t n f q 和t n f8 两类，其中t n f a 是由单核巨噬细胞产生，两类肿瘤坏死因子基本生物当活性相似具 有杀死肿瘤细胞的功能，并且是一种多功能的细胞因子，在许多细胞 生理过程中起重要作用，比如细胞凋亡，细胞增殖，b 细胞激活以及 一些急性的细胞炎症反应等“。特别是，在肝脏再生过程中，t n f a 起引发作用。对于t n f n 诱导肝脏再生的信号途径尚不十分清楚。 有人推测，t n f q 通过t n f 一仪_ t n f r 一1 斗n f l c b i l 6 斗s t a t 3 诱导d n a 复制和肝细胞再生“。而p d i p i 和t n f a i p i 的表达都受t n f q 的诱 导，并且都能促进d n a 聚合酶6 的活性，因此，p d i p i 和t n f a i p i 很 可能在t n f q 的诱导肝细胞再生过程中起“桥梁”作用。本实验室 的研究表明，t n f a i p i 基因在部分肝脏切除手术( p h x ) 后3 6 小时有 明显的增加，推断t n f a i p i 可能在d n a 复制和修复中起重要作用。 p c n a 是一种多功能蛋白，通过与其他的一些蛋白因子的相互作 用，在诸如d n a 复制，d n a 修复和细胞周期调控等一系列细胞生理过 程中发挥着重要的作用“7 。“，比如在d n a 复制过程中，p c n a 与d n a 聚 合酶6 之间的相互作用是必不可少的，它以三聚体的形式形成一个 可以移动的d n ac l a m p ，以闭合环状的形式围绕在双链d n a 的周围 “7 。“。它们之间的相互作用为d n a 的新生链合成提供了一个温和的分 子反应环境，对于维持染色体d n a 的快速复制起着非常重要的作用 。”，在研究的较多的d n a 聚合酶6 的两个亚基中( 小亚基p 5 0 和 大亚基p 1 2 5 ) ，真正与p c n a 相互作用的是p 5 0 ，而不是p 1 2 5 ，据推 测p 5 0 在p c n a 和p 1 2 5 之间起一个桥梁作用。 在本文中，我们又克隆了一个新的大鼠p d i p i 相关的基因，它和 p d i p i 、t a f a i p i 在结构和功能上具有很大程度的相似性，克隆的该 基因序列和g e n b a n k 上的大鼠p d i p i 同源性达6 5 1 ，与大鼠t n f a i p i 同源性达6 6 7 。这个新基因c d n a 全长2 9 1 3 b p ，开放阅读框编码一个 3 1 5 个氨基酸的蛋白质，在g e n b a n k 上搜索得知是一个新基因，与人 类k c t d l 0 氨基酸序列的一致性( i d e n t i t y ) 达9 7 7 ，与小鼠k c t d l 0 氨基酸序列的一致性( i d e n t i t y ) 达9 8 7 ，所以我们认为它是人类和 小鼠k c t d i o 的同源蛋白，命名为大鼠k c t d l 0 ( r a tp o t a s s i u mc h a n n e l t e t r a m e r i s a t i o nd o m a i nc o n t a i n i n g1 0 ) ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o a y 3 1 8 7 5 6 ) 。 据我们实验室的研究，p d i p i ，t a f a i p i 和k c t d i o 在结构和功能 上都很相似，而且都很保守，在n 端区域，都有一个b t b p o z 的结构 域；而在c 端区域，则是p c n a 的结合基序( q t k v e f p ) 。故我们推测 它们属于同一个基因家族。 通过免疫共沉淀( c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ) 确定了k c t d i o 与 p d i p i 一样，与p c n a 和p 5 0 都有相互作用。而且，我们通过t n f a 诱导n i h 3 t 3 细胞从而使k c t d i o 基因的表达水平升高，得出k c t d i o 同样能够被t n f a 诱导的结论，因而从功能上证明了k c t d i o 与p d i p i 以及t a f a i p i 之间的同源性。n o r t h e r nb l o t 和实时定量p c r 显示 k c t d i o 主要在肺里面表达，其次是心脏和睾丸，为进一步研究p d i p i 家族的功能提供了基础。 第一部分材料与方法 1 材料 1 1 主要仪器设备 5 8 1 0 r 5 8 1 0 ，5 4 1 4 d 冷冻离心机 德国e p p e n d o r f 公司 温度梯度p c r 仪德国e p p e n d o r f 公司 蛋白质核酸检测仪 德国e p p e n d o r f 公司 k s 2 5 0 细胞超声波破碎机宁波市经济技术开发区科生技术公司 d y v i i i 6 b 稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂 d y y - t b 转移电泳仪北京六一仪器厂 d y c 2 4 d 垂直电泳槽北京六一仪器厂 微型同位素检测仪 m i n i i n s t r u m e n t sl t d 真空干燥仪 s a 、，a n t 公司 超净工作台苏州集团苏州安泰空气技术有限公司 8 0 度立式超低温冰箱美国f o r m a 公司 生物安全柜e l a s s i ia b 3美国f o r m a 公司 倒置显微镜a x i o v e r t2 5 z e i s s 公司 实体显微镜s v i i z e i s s 公司 s z 9 3 自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂 s z 9 7 自动三重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂 唧6 恒温水浴锅湖南湘仪 台式t d 5 低速水平离心机 湖南湘仪 漩涡振荡器 太仓市科教器材厂 a e 2 0 0 型电子天平m e t t l e r 公司 p b1 5 0 1 - e 型电子天平 m e t t l e r 公司 d e l t a 3 2 0 型p h 计 m e t t l e r 公司 超纯水器 m i l i q 公司 凝胶成像系统上海天龙公司 t s 型脱色摇床 江苏海门市麒麟医用仪器厂 恒温金属浴杭州大和公司 恒温干燥箱 s h e l l a b 公司 二氧化碳培养箱 s h e l l a b 公司 电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 旋转式培养箱太仓市科教仪器厂 立式圆形压力蒸汽灭菌锅l s b 5 0 l 型上海医用核子仪器厂 s h z d ( i i i ) 循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂 1 2 菌种和细胞株 大肠杆菌( e c o l i ) d h 5 c t ，细胞株n i h 3 t 3 均为本实验室保存。 1 3 载体和工具酶 p m d l8 - t 购自t a k a r a 公司；p c m v - - a 及p c m v - m y c 为 c l o n t e c h 公司产品。 限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶酶a p ) 、t 4 d n a 连接酶、t 7 r n a 聚合酶、末端脱氧核糖核苷酸转移酶( t d t ) 购自n e we n g l a n d b i o l a b s 公司。t a q d n a 聚合酶购自q i a g e n 公司。 1 4 抗体 抗h a - t a g 的多克隆抗体为c l o n t e c h 公司的产品；抗m y e 的单克 隆抗体购自s a n t ac r u z 公司：二抗h r p 耦联的单抗兔i g g 单克隆抗 体和h r p 耦联的单抗鼠i g g 单克隆抗体购于j a c k s o ni m m u n o r e s e a r c h 公司。 1 5 试剂盒 s m a r tr a c ec d n aa m p l i f i c a t i o nk i t 购于c l o n t e c h 公司，s e n s i s c r i p t r tk i t 、o l i g o t e xm r n ak i t 、柱离心式凝胶回收试剂盒购自q i a g e n 公司，c a t r i m o x 一1 4r i g ai s o l a t i o nk i t 、p r o b el a b e l i n gk i t 、p c r 试剂 盒购自t a k a r a 公司，u n i d 一1 0t o t a lr n am i n i p r e p ss u p e rk i t 购于 s a n g o n 公司。 1 6 其它试剂 异硫氰酸胍，柠檬酸钠，p 一巯基乙醇，s d s ，t r i sb a s e ， i p t g ， t r i s 饱和酚，水饱和酚，d e p c ，d t t ，b s a ，d n t p ，n 十二烷基肌 氨酸( s a r k o s y l ) ，琼脂糖，溶菌酶，丙烯酰胺，亚甲双丙烯酰胺，t e m e d ， p m s f ，溴酚蓝，考马斯亮蓝为上海生工的进口分装试剂。d a b ，过 硫酸铵，核酸酶抑制剂( r n a s ei n h i b i t o r ) 购自g i b c o 公司。蛋白质- a g 偶联的s e p h a r o s e 购于s a n t ac r u z 公司。尼龙膜购于 s e h l e i c h e r & s c h u e l l 。d n a 分子量标准，蛋白质分子量标准均购于m b i f e r m e n t a s 公司。同位素a 3 2 pu t p 购于北京福瑞公司。新生小牛血清 为杭州四季青公司产品。基因转染试剂s o - f a s t 购于太阳马公司。多 组织n o r t h e r nb l o t 膜以及h y b 高效杂交缓冲液购于深圳i n n o g e n t 公 司，肿瘤坏死因子( t n f - q ) 以及放线菌酮( c h x ) 购于s i g m a 公司，其 他常规试剂均为国产分析纯。 1 7 所需溶液 ( 1 ) 用于质粒小量提取的溶液 溶液i ：5 0m m 葡萄糖；2 5m m t r i s - c i ( p h8 o ) ：1 0r r me d t a ( p h 8 0 ) 。溶液i i ：0 2mn a o h ；1 s d s 。溶液i i i ( 1 0 0m l ) - 5mk a c6 0m l ； 冰醋酸1 1 5m l ；加水至1 0 0 m l 。 ( 2 ) 用于r n a 抽提的溶液 在含有2 9 3 m l 的h 2 0 ，o 7 5 m o l l 柠檬酸钠p h7 0 和2 6 4 m l1 0 s a r k o s y l 的溶液中加入2 5 0 9 异硫氰酸胍，加热至6 0 6 5 c ，并持续搅拌 配制贮存液。这种贮存液可以于室温保存3 个月。在每5 0 m l 贮存液中 加入0 3 5 m l2 - m e 即配制成一j ：作液一i 作液j ：窀温j 能保存1 个j 。 ( 3 ) 用于蛋白质p a g e 电泳的溶液。 凝胶储液：3 0 丙烯酰胺0 8 亚甲双丙烯酰胺水溶液。 4 t r i s c i s d s ( p h8 8 ) ：在4 0m l 水中溶解6 0 5 9t r i sb a s e ，用h c i 调至p h8 8 ，加水至1 0 0m l 。用o 4 5u m 滤膜过滤后，再加入0 4 9s d s 。 于4 可保存1 个月。 4 x t r i s c l s d s ( p h6 8 ) ：在4 0m l 水中溶解6 0 5 9t r i sb a s e ，用h c i 调至p h6 8 ，加水至1 0 0m l 。用0 4 5l a m 滤膜过滤后，再加入o 4 9s d s 。 于4 c 可保存1 个月。 5 x s d s 电泳缓冲液：t r i sb a s e1 5 1 9 ；甘氨酸7 2 9 ；s d s5 9 ；加水定 容至l l 。 6 x s d s 点样缓冲液( 2 0m l ) ：4 x t r i s c l s d s ( p h 6 8 ) 1 4m l ；甘油6 m l ：s d s2 9 ：d t t1 8 6 9 ；溴酚蓝2 4m g ；分装成0 5m l 于一7 0 。c 储 存。 染色液( 1 0 0 m l ) ：考马斯亮兰r 2 5 00 2 5 9 ；5 0 e p 醇9 1m l ：冰醋 酸9m l 。 ( 4 ) 用于w e s t e r n - b l o t 检测的溶液 电转移缓冲液：在4 l 水中加入1 8 2 9t r i sb a s e 和8 6 5 9 甘氨酸，加 水至6 l ，调p h 约为8 3 8 4 。 t b s ：1 0 0m m t r i s - c l ( p h7 5 ) ；o 9 n a c i 。 封闭剂：含1 0 脱脂奶粉的t b s 溶液。 d a b n i c l 显迹液：5 m l1 0 0 m m l t r i s - h c ip h7 5 ；1 0 0uld a b 贮 存液( 4 0 m g m l ) ：2 5b tln i c i 贮存液( 8 0 m g m l ) 1 5ul3 h 2 0 2 ，临用 前混合。 ( 5 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳溶液 5 x t b e ：t r i sb a s e5 4 9 ：硼酸2 7 5 9 ：2 0m lo 5 me d t a ( p h8 o ) ； 加水定容至1 l 。 6 加样缓冲液：o 2 5 溴酚蓝：0 2 5 二甲苯青f f ；1 5 聚蔗糖 ( f i c o l l4 0 0 ) 水溶液。 ( 6 ) 大肠杆菌培养基 l b ：酵母提取物5 9 ；蛋白胨l o g ：卜池c l5 9 ；加水定容至1 l ( 固体 培养基加入2 终浓度的琼脂粉) 。 9 2 x y t ：酵母提取物1 0 9 ；蛋白胨1 6 9 ；n a c l5 9 ：加水定容至1 l ( 固体培养基加入2 终浓度的琼脂粉) 。 ( 7 ) 细胞培养液 d m e m 高糖培养液( 1 0 0 m l ) ：d m e m 液8 9 m l ，新生小牛血1 0 m l ， p e n i c i l l i ns o d i u ms a l t10 0 u m l ，s t r e p t o m y c i ns u l f a t e10 0 u g m l ， o 2 m 的l - g l u t a m i n el m l ，过滤灭菌，4 c 保存。 ( 8 ) 免疫共沉淀所用的溶液 r i p a 缓冲液：5 0 m mt r i s h c ip h7 2 ，15 0 m mn a c i ，l t r i t o n x 一1 0 0 ，1 s o d i u md e x y c h o l a t e ，0 1 s d s ，l m mp m s f 。 ( 9 ) 用于n o r t h e mb l o t 所用的试剂 2 0 s s c ：3mn a c i o 3m 柠檬酸钠( p h 7 0 ) 洗液1 ：2 s s c 0 0 0 5 s d s 洗液2 ：0 1 s s c 0 】s d s 2 方法 2 1 大鼠k c t d l0 基因的克隆及序列分析 2 1 1 大鼠脑组织总r n a 的提取 采用湖北省疾病控制预防中心购买的s p f 级的1 1 1 2 周龄的 w i s t a r 雄性大鼠为研究对象。按照传统的异硫氰酸胍一步法f 2 田提取大 o 鼠脑总r n a 。具体的提取步骤如下：( 1 ) 将l g 新取的组织材料放于过 的1 0 m l 变性工作液中，于冰上用组织匀浆机匀浆( 离心管事先用 d e p c 处理) ( 2 ) 加入l m l3 m 的醋酸钠及和溶液等体积的水饱和酚： 氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，用力震荡l o 秒，冰上放置1 5 分钟。( 3 ) 4 0 c 环境下，1 0 0 0 0 9 离心2 0 分钟，把上清液小，t l , 转到一个新的用d e p c 处 理过的5 0 m l 离心管中，加等体积的异丙醇，一2 0 c 环境下至少沉淀1 小时。( 4 ) 在4 c 环境下，1 0 0 0 0 9 离心2 0 分钟，弃上清，加入3 m l 变 性工作液，轻轻吸打沉淀，直到沉淀全部溶解，再加入3 m l 异丙醇， 在2 0 c 环境下至少放置l 小时以沉淀r n a 。( 5 ) 4 。c 环境下，1 0 0 0 0 9 离心2 0 分钟，弃上清，加入2 m l 水，溶解r n a ，然后平均转入到3 个1 5 m l 的e p 管内，加入和溶液等体积的水饱和酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ： 2 4 ：1 ) ，轻轻摇匀，冰上放置1 5 分钟。( 6 ) 4 c 环境下，1 0 0 0 0 9 离心 1 0 分钟，取上清到新的e p 管，加入等体积氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻 轻摇匀，46 c 环境下，1 0 0 0 0 9 离心1 0 分钟，取l ：清刽另外的1 5 m le p 管，再用酚：氯仿：异戊醇抽提一次。( 7 ) 在上清中) 9 i k1 1 0 体积3 m 的醋 酸钠，再加入0 6 1 倍体积异丙醇，轻轻摇匀，在2 0 环境下至少放 置3 0 分钟，4 。c 环境下以1 0 0 0 0 9 离心1 5 分钟，去上清，加3 0 1 3 l 此7 0 预冷乙醇，轻轻吸打沉淀，室温下放1 0 分钟。( 8 ) 4 环境下，1 0 0 0 0 9 离心l o 分钟，弃上清，再把离心管在离心机里轻轻甩一下，将管壁上 的液体离心下来，再用1 0 9 l 的枪头吸去液体，将离一t l , 管盖打开，插在 冰上干燥1 5 分钟，根据沉淀的多少加入5 0 2 0 0 9 l 的d e p c 处理过的 无菌水，待沉淀溶解后放入8 0 冰箱中保存( 以上离心管和水均用 d e p c 浸泡2 4 小时以上以使r n a 酶失活) 。 所提取的r n a 的浓度和纯度用e p p e n d o r f 公司的紫外分光光度 计检测仪进行分析。 2 1 2m r n a 的分离 用。o l i g o t e xm r n a k i t 提取m r n a ，操作按试剂盒说明书略加改 进进行。( 1 ) 加1 0 0 t tl 的2 b i n d i n g b u f f e r 到等体积的总r n a 中，加 6l alo l i g o t e x 混匀，6 5 。c 温育3 分钟。放室温l o 分钟结合m r n a 并 且在7 5 c 预热e l u t i o nb u f f e r 。1 4 0 0 0 r m i n 离心3 分钟后弃上清：( 2 ) 用3 0 0plw a s hb u f f e r 两次沈涤o l i g o t e x ，每次轻弹管壁，重悬并离 心3 分钟。之后小心地移去上清。( 3 ) 用6 u l 预热e t u t i o nb u f f e r 从 o l i g o t e x 洗脱m r n a ，通过吸头重悬或振荡，并在7 5 c 温育1 分钟。 离心3 分钟，移去上清至一新管并重复。合并上清，一8 0 。c 保存备用。 2 1 3 反转录合成c d n a 及r t p c r 我们采用的是q i a g e n 公司的s e n s i s c r i p tr tk i t ，以所提取的 w i s t a r 大鼠的脑m r n a 为模板。按照试剂盒中提供操作说明，反转 录合成c d n a 的第一条链。然后以此作为p c r 反应扩增的模板。 在g e n b a n k 的e s t 数据库中搜寻与大鼠的f d i p l 基因( g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r ：a y 3 0 5 0 2 9 ) 有相似序列的e s t ，发现有一组相互之 间有重叠的e s t 序列与大鼠的p d i p i 基因序列有8 1 8 2 的相似度。 这组e s t 的g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r 是c b 5 4 7 0 7 6 ，c b 7 8 6 4 2 5 和 c k 3 6 5 6 7 6 。这些相互之间有重叠的e s t 序列能够整合成一段8 1 4 b p 的重叠群( c o n t i g ) 。为了证实这段c o n t i g 的真实性，设计了一对引物 ( p r i m e rf p r i m e rr ) ，看能否从大鼠脑m r n a 的反转录产物中扩增出 来。我们分别根据c b 5 4 7 0 7 6 的5 末端和c k 3 6 5 6 7 6 的3 ，末端设计 p r i m e r f ( 5 - g t c a g a t a a g c c a g c c g t g a a 3 ) 和p r i m e rr ( 5 - g c c g a a g g a g c c c t a a t a g t c - 3 。) 。采用q i a g e n 公司的 h o t s t a rt a q 聚合酶进行p c r 反应，扩增的条件是：9 5 。c2 m i n ；9 4 。c 3 0 s e c ，6 0 * ( 23 0 s e c ，7 2 。ci r a i n ( 3 5c y c l e s ) ；7 29 c1 0 m i n 。p c r 产物经纯化 后克隆至p m d l 8 - t 上，测序检验其序列。 2 1 4k c t d l0 基因的5 ，一r a c e 反应 根据g e n b a n k 编号c b 5 4 7 0 7 6 的大鼠e s t 序列，用n e t p r e m i e r 免费软件设计5 。r a c e 特异引物g s p l 和巢式p c r 引物n g s p l ( 女! l 1 - 1 ) 。 g s p1 5 - g t c g t c g g a a t t g c t g g t g t a g g a g t a c 3 n g s p1 5 - g t a g a g c a g c t t c a c g g c t g g c t t - 3 5 3 一 r o g j o no lc p , e f l a p 图l 一1k c t d l 0c d n a 克隆 一3 s 在加尾反应之前，采用q i a g e n 的d n a 纯化试剂盒从反转录体系 中去除引物、d n t p s 和反转录酶等底物，有利于提高反应的特异性。 2 1 4 1c d n a 第一链产物同聚物加尾 将以下成分加到o 2 m l 的微量离心管内： d d h 2 0 7 5ul 1 0 反应缓冲液 2 5 ul 2 5 m m o l lm g c l 2 1 5ul 2 m m o l l d a t p 2 5pl 5 c d n a 第一链产物 1 0 ul 稍稍离心将液体收集到管底，9 4 。c 3 h 热2 3 分钟，立即置冰浴1 分钟，再稍稍离心后冰浴。加入1ul 末端转移酶( t d t , 1 0 u ul ) ， 轻轻混匀，3 7 * ( 2 孵育1 0 分钟。6 5 7 0 加热1 0 分钟以灭活t d t ，一2 0 保存备用。m g c l 2 的浓度影响加尾长度，应准确取量。由于加尾缓 冲液不影响t a qd n a 聚合酶，故可直接进行下一步p c r 反应。 2 1 4 25 - r a c e 反应 在o 2 1 n lp c r 反应管中加入 p c r g r a d ew a t e r p c rb u f 梵r d n t p m i x( 1 0 m m ) t a q d n a 聚合酶 5 仂口尾c d n a 引物o l i g o ( d t ) 1 8 l9 8 7 5 u l 2 5l l l o 5ul 0 1 2 5 儿 l 止 o 5ul 里i 物堡曼里!q ：5 丛! = 上 共2 5ul ，充分混匀置于p c r 仪中 9 4 热变性2 分钟 上 按以下程序进行2 5 个循环 9 4 变性4 5 秒 5 6 。c 退火3 0 秒 7 2 。c 延伸1 分钟 土 7 2 延伸l o 分钟 上 置于4 c 结束反应 将得到的p c r 产物稀释1 0 0 倍，取1 止作为模板进行第二轮 p c r 。第二轮p c r 以o l i g o ( d t ) 1 8 和巢式引物n g s p l 为引物，扩增 3 0 个循环。 p c r 产物通过l 2 的琼脂糖凝胶电泳检测，特异性条带经 q i a g e n 的回收试剂盒纯化分离后，克隆至p m d l 8 - t 中，然后测序分 析。 2 1 5k c t d l 0 基因的37 - r a c e 反应 根据g e n b a n k 编号c k 3 6 5 6 7 6 的大鼠e s t 序列，用n e t p r e m i e r 免费软件设计3 。r a c e 特异引物g s p 2 和巢式p c r 引物n g s p 2 ( 如图 1 一n 。 g s p 25 - g t a t g a g t g a g t c t g g c g t