（生物化学与分子生物学专业论文）高等植物基因上游可译框架（uorf）分析和tapsg719基因uorf对其翻译水平影响的研究.pdf

高等植物基因上游可译框架( u o r f ) 分析和t 日p s g 7 1 9 基因u o r f 对其翻译水平影响的研究 第一部分 文献综述与实验设计方案 4 高等植物基因上游可译框架( u o r f ) 分析和t a p s g7 1 9 基因u 0 r f 对其翻译水平彭响的研究 第一章上游可译框架( u o r f ) 对翻译的调控作用 真核生物的m r n a 主要可译框架( o r f ) 在大部分情况只编码一条多肽链。o r f 的两旁的序列有可能剐m r n a 的翻泽效率、稳定性和弧细胞的分布起到一定的调 节作月j 。传统称真核生物m r n a 甲基鸟营帽子结构和o r f 的起始密码子a 【j g 之间 的l n a 核苷酸序列为5 非编码区( 5 u t r s ) ，尽管当这个术语用于含有具有上 游a u g ( u a u g ) 作为翻译的起始点的转录前导链m r 时并不是很确切。有相当 数量的真核细胞m r n a5 u t r s 会有u a u g 。 根据u a u g 密码子和它们对应的终止密码子的位置可以把o r f 分成三种结构 类型( 图1 所示) 。第一种是终止密码予在57 菲编码区，被称作菲交叉u o r f ： 第二种是终止密码子在大0 r f 内，u 0 r f 与大o r f 有部分序列交叉，被称作交叉 u o r f ；第三种u 0 r f 是u a t g 起始，与主要o r f 有部分相同的读码框，终止密码子 相同，被称作框内u o r f 。 f 辔，t h l e cp o s s i b kc o n t j g u r a t i o n s o fo r f sf ol 】c i 、? i n gu p s l r e a l l l c o d o l l ) 幽lu o r f 存在的三种可能形式 1 1 含上游起始密码子的真核生物基因 尽管现在有大量核酸序列数据库和5 非编码区序列数据库“，但要鉴别核 苷酸序列中是否含有u a t g 仍旧存在不少问题。因为得不到m r n a 末端加帽的数据， 或者因为在c d n a 序列中存在克隆的人为序列，导致我们得到的真核生物m r n a 5 非编码区序列往往是不精确的。在一些基因中，由于不同的选择性剪切或者转 高等植物基因上游可译框架( u 0 r f ) 分析和n p s g 1 9 基因u o r f 对其翻译水平影响的研究 录起始点的不同会转录产生大量的具有不同5 非编码区的m r 。而且虽然大部 分基因的起始密码子是a u g ，但有时也存在非 u g 密码子具有起始密码予功能。 另外，数据库往往不能准确给定5 非编码区的边界。因此，现在还没有 i i ；靠的 方法通过测定较大范围的核酸序列来识别基凼的转录产物中是否含u g 。 统计表明真核生物 r l 中普遍存在u 。在1 9 8 9 年，人们经过统计认为大桫 1 0 的真核生物m r n a 含葡j a u g ( “，然而后来的统计分析表明这个数字是偏高的卯。 在酵母中至少有l 羹的基因禽有u a u g ( “，同时在真菌基因中也发现了u a u g ( ”。在一 些核酸序列如果蝇m r 【8 和癌基因i r ( 9 中，u a u g 出现的频率更高。 尽管测序表明，许多真核生物序列中存在u o ，但是u o r f 对大编码框翻译的 影响的研究，仅仅只局限在很少一部分基因。表1 列出了部分含有u o e 0 的m r l l ， 通过对它们的u a t g 进行点突变去除它的起始密码子的功能，来研究u o r f 对0 r f 编 码框蛋白翻译的影响作用。尽管这些基因的功能是完全不同的，但是对含有功能 性u o r f 基因如c 9 9 3 ( 1 m ，b c 卜2 ( 1 ”，m d m 一2 ( 1 ，c m o s ( 1 3 的研究表明功能性u o r f 对细胞 的生长有调控作用。在酵母m r 中编码g 期细胞周期蛋白u o r f ，在细胞的生长调 节过程中起着特殊的作用，因为剔除这段u 0 r f 序列能显著加速细胞分裂i ；山：另外 有实验已经证明了u o 是作为一种调控因子来调节c 3 基因翻译t ”) 。含有u o e e 但是在表l 中没有列出的基因也会对蛋白表达产生影响，但剔除这些基因的u 0 9 0 起始密码子后对o 的翻译的影响作用很少见于报道。锾如当拟南芥| | r i 转录因 子m r n a 含有的u o r f 经突变被提前终止，它的翻译效率会得到了提高! ”。另外在 较小的核糖体中，含有u o 的m r 要比经过剪切后不含l o r f 的m r n a 要多；i ；i ；。 除了分析蛋白质在体内的表达之外，r l l 表达量也是评价u 0 r f 功能的一个重 要指标。表1 的中大量数据表明，含有u o r f 野生型的和u a t g 突变型它们的r l l 表达 量相差无已( 可能具有相似的结构) ，表明u o g 的调控作月贯穿于整个翻译过程。 在某些情况下，u o 的翻译产物能调控m r 的稳定性：这种现象表明u o e e 在翻译 调控中起到了重要的作用。 6 高等植物撼因j 游可译框架( l ；o r f ) 分析和n p s ( ：7 1 9 菠匹l u ( ) r f 对j ；黼译水平影响的研究t h b j e1u o r f st h a t a f k c t ( j o w n s 打e a j nt r a n s 】a t j o n j nv j v o1 n r n a r c r c n c e s v i l u s e sb a c u l o v i r u 8g p 6 4c a u l m o w e r nlosaicv i r u sc y t o m e g a l o v i r u sg p u l 4 8j nnuenzan b ，n ar e o v i r u ss lr o u ss a r c o m av i r u ss v 4 0 16sa n d1 9 sr n a sf u n g ia 唱一2 8c l n 3c p a l 8 cvcl362g c n 4 h o l ls t u ay a p 2p 1 a n t sl co p a q u e 一2 p m a lp m a jt a b i e1 ( c o n “n u e d )c h a n gm l d biissard(19 9 7 )f n t t e r e r a n d i i o h n ( 1 9 9 型) ；p o o g g i n t i ta l 。( 1 9 9 8 )s c h l e i s se ta 1 ( 1 991)：de911ine ta 1 ( 1 9 9 3 ) ；a l d e r e t ee t a1(1999)w i l l i a m sa n dl a m b ( 1 9 8 9 )f a j a r d o a n d shatkin(1 9 9 0 ) ；b e l l i8 1 1 ds a m u e 】( 】9 9 3 )d o n z a n d spallr(19 9 2 ) ；m o u s t a k a se ta 1 ( 1 9 9 3 b ) gfassa n dm a n l e y ( 1 9 8 7 ) ；p e r e ze ta 1 ( 1 9 8 7 ) ；s e d m a n a n dm e r t z ( 1 9 8 8 ) ；s e d m a l le ta 1 ( 1 9 8 9 )f r e i t a ge t al_(1996)：luoa n ds a c h s ( 1 9 9 6 )p o l y m e n i sa n d schmidt(19 9 7 )w e m e re ta 1 ( 1 9 8 7 )p i n t o et a 1 ( 1 9 9 2 )h i n n e b u s c h ( 19 9 7 )w r i 曲te t a1(1996) w ua n dm i l l e r ( 1 9 9 7 )v i l e l ae ta 1 ( 1 9 9 8 ，1 9 9 9 ) w a n g a 1 1 dw e s s l e r ( 1 9 9 8 )l o h m e r e ta 1 ( 19 9 3 ) michelete ta 1 ( 1 9 9 4 )l u k a s z e w i c ze ta i ( 1 998) 7 高等植物基因上游可译框架( u 0 r f ) 分析和t a p s g 7 j 9 魅园u o r f 对其翻译水平彭响的研究 m r n a h y d r o x y m e t h y l l r a j l s f e r a s e t h r 。m b p o i e t i n t i a n s f o r m i n gg r o w t l 】 亿c t o rb 3 r c f e r e n c e s g 1 1 i l a r d ie ta 1 ( 1 9 9 8 ) a l “c ke ta 】( 】9 9 1 ) 也存在些含u o r f 的基因，它们u o r f 的起始密码予被突变后，下游的蛋白 表达量却没有变化( 1 8 ) 1 9 ) ( 2 0 j ( 2 “。这有可能是因为u o r f 得不到有效的识别，或者 也可能是u 0 r f 的翻译被终止后核糖体能有效重新起始作用。另外，核糖体可能 绕过u a u g 或利用核糖体内在进入位点启动下游序列的翻译。 1 2u 0 r f 调控翻译的机制 1 2 1 决定u a u g 起始作用的因素 虽然真核核糖体可以通过不同的途径来选择翻译的起始位点，但是通过扫 描决定m r n a 翻译起始位点的是其中最主要的机制。核糖体通过扫描r n a 选择 a u g 作为起始密码子，这个过程受到很多参数的影响而与密码子是否是u a u g 或者是主要编码框的起始密码子a u g 无关。a u g 两侧的序列对它的起始效率起着 决定作用”，在非a u g 作为起始密码子的情况下，它两侧的序列也是起到了重要 的作用3 ) ( 2 2 ) ( 2 3 1 。当a u g 附近有加帽位点，或者r m 与调节因子结合的情况下， 或者在a u g 前形成显著的二级结构时，a u g 作为起始密码子的概率就会大大的降 低3 ) ( 2 钔。这种现象会带来一个值得注意的结果就是按糖体绕过m r n a 的第一个 a u g ( 当这个a u g 启动大编码框的翻译的情况下) ，而识别下游的a u g 作为起始密 码子，这个时候短的o r f 有可能行使表1 中例出基因在正常情况下的o r f 的功能， 例如影响r n a 的稳定性2 舶，或者编码多肽链2 们。与其缝干扰a u g 密码子的识别 效率不同，m r n a 中a u g 的下游的二级结构能降低核耱体扫描序列的速度，并在 低效率起始位点启动翻译( 3 ) 。 要调节下游o r f 的翻译，核耱体对u a u g 位点的识别是必须的，但仅仅只有 这一点还不是够的。u o r f 的翻译和终止效率，u o r f 编码的蛋白顶的性质，以及 翻译终止后再起始的效率，u o r f 的这些性质都会对下游的翻译产生影响a 因为 “ 一 b 一一 一 l | | | | 高等植物基因上游可译框架( u 0 r f ) 分析和n p s g 1 9 基因u o r f 对其翻译水平影响的研究 录起始点的不同会转录产生大量的具有不同5 非编码区的m r n a 。而且虽然大部 分基因的起始密码子是a u g ，但有时也存在非 u g 密码子具有起始密码予功能。 另外，数据库往往不能准确给定5 非编码区的边界。因此，现在还没有i f ：f 靠的 方法通过测定较大范围的核酸序列来识别基凼的转录产物中是否含u a u g 。 统计表明真核生物n 1 r n a 中普遍存在u u g 。在1 9 8 9 年，人们经过统计认为大桫 1 0 的真核生物m r n a 含葡j a u g ( “，然而后来的统计分析表明这个数字是偏高的卯。 在酵母中至少有3 的基因禽有u a u g ( “，同时在真菌基因中也发现了u a u g ( ”。在一 些核酸序列如果蝇m r n a 【8 和癌基因j 】r n a ( 9 中，u a u g 出现的频率更高。 尽管测序表明，许多真核生物序列中存在u o r f ，但是u o r f 对大编码框翻译的 影响的研究，仅仅只局限在很少一部分基因。表1 列出了部分含有u o r f 的m r n a ， 通过对它们的u a t g 进行点突变去除它的起始密码子的功能，来研究u o r f 对0 r f 编 码框蛋白翻译的影响作用。尽管这些基因的功能是完全不同的，但是对含有功能 性u o r f 基因如c l n 3 ( 1 m ，b c 卜2 ( 1 ”，m d m 一2 ( 1 ，c m o s ( 1 3 的研究表明功能性u o r f 对细胞 的生长有调控作用。在酵母m r n a 中编码g 期细胞周期蛋白u o r f ，在细胞的生长调 节过程中起着特殊的作用，因为剔除这段u 0 r f 序列能显著加速细胞分裂 l 山：另外 有实验已经证明了u o r f 是作为一种调控因子来调节c 3 基因翻译t ”) 。含有u o r f 但是在表l 中没有列出的基因也会对蛋白表达产生影响，但剔除这些基因的u 0 r f 起始密码子后对o r f 的翻译的影响作用很少见于报道。锾如当拟南芥a t r i 转录因 子m r n a 含有的u o r f 经突变被提前终止，它的翻译效率会得到了提高( i ”。另外在 较小的核糖体中，含有u o r f 的m r n a 要比经过剪切后不含l o r f 的m r n a 要多( 1 6 ) ( 1 7 ) 。 除了分析蛋白质在体内的表达之外，r n a 表达量也是评价u 0 r f 功能的一个重 要指标。表1 的中大量数据表明，含有u o r f 野生型的和u a t g 突变型它们的r n a 表达 量相差无已( 可能具有相似的结构) ，表明u o r f 的调控作月贯穿于整个翻译过程。 在某些情况下，u o r f 的翻译产物能调控m r n a 的稳定性：这种现象表明u 0 r f 在翻译 调控中起到了重要的作用。 6 x 新等植物基因上游i u 译框架( u o r f ) 分析和t r s ( j 7 1 9 基因1 1 0 r f 对其翻译水平影响的研究 似，但u o r f s 精确的作用机制并不完全相同。核糖体滞留发生于a r g2 和c m l u o r i ? s 翻译后，即使消除了终止密码子也一样存在这种情况h 1 ) ( 4 6 、。与u l ，4 u o 】 f 不同，a r g2 c p a l l ，0 r f 在延伸和终止时可以诱导核糟体的停滞。这些事实表明， 不管是在核糖体的延伸或者终止过程中影响核糖体在r n a 上的前进过程，是序列 依赖u o r f 对下游进行抑制的一种普通的机制。 l j o r f s 表达的半数初生多肽能干扰核糖体组分或翻译因子和r n a 的结合，而这 二者是翻译高效终止所必须的。因此，新生肽酰t r a 的水解作用受到干扰，核糖 体长时间滞留在u o r f 末端位点，到达下游顺反子的途径受到了阻遏。虽然现在还 不确认u o l f 中的哪一个蛋白起着干扰作用，但是核糖体r n a ，核糖体蛋白质，和 翻译网子都有可能是起着干扰作用。在大肠杆菌中，氯霉索乙酰转移酶基因编码 的多肽能改变核糖体肽基转移酶的空间结构从而抑制它的中心活性( 3 ”。肽基转 移酶中心的作用是延伸和终止肽链，它可能是a r g 一2 和c p a lu o r f 的作用靶位点。 因此a d o m e t d c 和u l 4u o r f 只抑制肽链的终止，而不抑制肽链的延伸，u o r f 的作用 靶位可能是终止特异性因子。在原核生物中，核糖体再循环因子( r f 4 ) 能够把 核糖体从r n a 中释放出来4 7 ) 。虽然在真核生物中没有发现类似因子( 除了原核性 细胞器) ，但可能存在另外的u o r f 肽链的靶位点。这些u o r f 的序列存在差异，说 明它们可能是通过不同的方式来干扰翻译的终止效室的。 在高含量的多胺和精氨酸的环境下，a d o m e t d c 和a 增2 硎u o r f 才能完 全发挥抑制作用。在大多数情况下。调控因子能通过很多途径发挥作用。它们可 能通过调节u o r f 编码多肽和核糖体或核糖体相关翻译因子之间的稳定性，从而 干扰下一步翻译步骤。另外与多胺调控翻译功能相一致的是贬精胺引起的核糖体 移码h 8 ) ( 4 叭。不管是序列依赖或非依赖u o r f ，翻译起始密码子识别效率的改变对 u 0 r f 的抑制作用具有调节作用。在一些细胞中，s 一腺苷甲硫氨酸脱羧酶u a u g 识 别的改变会引起u 0 r f 活性丧失5 们，但这不能用来解释多胺水平的调控机制筘”。 1 2 4 翻译再起始的控制机制 不考虑u o r f 编码多肽对下游翻译的影响，终止u o r f 翻译的核糖体将从m r n a 脱落或者继续在同一条m r n a 上扫描并在下游a u g 处重新起始( 图2 ) 。基因表达 可以通过调节重新起始效率来进行调控，这在g c n 4 翻译控制机制的研究中已经 有清楚地阐述。上面提到，如果翻译的再起始效率( 编码基因产物的0 r f 的起始 1 2 高等植物基因上游可译框架( u o r f ) 分析和n p s g 1 9 基因u 0 r f 对其翻译水平影响的研究 染性病毒的产生，表明病毒的壳体化需要l ，o r fj e 常翻译。但是最近的研究发现， 第三个u a u g 的突变会干扰r n a 次级结构从使病毒1 ；能形成壳体( 7 。因此，u 0 r f s 翻译在病毒形成壳体中所起的作用仍未被搞清楚。 1 3 4u a t g 起始的多肽产物 在真核生物中双顺反子模板中上游序列编码的多肽对翻泽不起调控作用的 情况是非常少见的_ ”。在很多情况可以检测到短u o r f s 编码的肽链，尤翼是无 细胞翻译试验0 2 ) ( 5 5 ) ( 7 ) ( 7 ”。含有u o r f 的报告基因，通常可以在体内检测到两者 的融合蛋白，这表明u o l ：f 是被翻译的。一些u o r f s 所缤码的多肽具有高度保守 性5 4 ) ( 7 5 ) ( 7 6 ) ( 7 7 ) ( 78 1 。u 0 r f 的这种多肽序列的高度保守在琵译调控或其它功能中是 否起着重要作用还有待研究。 1 4 总结 在不同系统不同基因普遍存在u o r f ，表明u o r f 广泛参与生物学过程。u o r f 大量存在于控制细胞生长基因的m r n a 中，如癌基因、生长因子和细胞受体，其 中的有些u o r f 具有调控基因表达的作用( 表1 ) 。这些发现表明u o r f 通过监控 x 高等植物基因上游可译框架( u o r f ) 分析和n p s g 1 9 基因u 0 r f 对其翻译水平影响的研究 染性病毒的产生，表明病毒的壳体化需要l ，o r fj e 常翻译。但鲥鸶 蛭醚不嬲； 澎并j 4 # 黼磁超前备矗l 孙掣甄涮丽卞游顺反i i 陶礞爨萄甄i i 簧。融珊；蕃 # 丝缮船型科耍秘量剧磐黧矧鞭糟锑崩静磊聪。 i ，g ? g 囊j 嘲誊鞋劳墅薷m 磋骄憨为强蓖搬镬级构象元素( 鲥j 。尽管缺少第一个u a u g 的突变品 种仍具有传染性，仍然 能够在植物中繁殖下一代，但是在这过程中往往会出现突变回复体，从而使第一 个u 0 r f 的翻译功能得到了恢复。这说明u o r f 有利于病毒的生酶( 。现在有一种 机制的调控假说，当第一段u o r f 翻译后，r n a 次级结构能延迟核糖体下游o r f 的翻 译。为了进一步阐明这种机制，需在无细胞的翻译产物和酵母中构建延迟机制( 6 ” ( 6 孙。 1 3 2 对r n a 稳定性的影响 真核生物m r n a s的稳定性和翻译表达在某种程度上是相辅相成的。u 0 r f s 有 关基因的调控是一种无义介导的衰退现象，0 r f 靠近j 端基因的无义突变破坏 了m r n a s 的稳定性。下游序列元素和反式作用因子( 立三酵母u p f 基因编码因子) 对无义介导的衰变也很重要。u o r f s 能模拟含有提前终止密码予的m r n a s 结构， 从而引发m r n a 的衰退。例如，在含有一个或多个g c n 4u o r f s 中加入下游功能元 素能引起m r n a 无义介导的衰退( 6 舢。当c y c 卜3 6 2 等位基因的模板领头链中出现 异常起始密码子，就会在m r n a 中产生一个u o r f ，从而导致翻译效率降低到原来 的百分之( 6 。 y a p 2m r n a 含有两个u o r f ，每个都能导致m r n a 不稳定，但u o r f 的作用不依赖u p f l，暗示u 0 r f 导致m r n a 不稳定是由多重机制控制的。虽然 并不是表l 中的列出的所有u o r f 的翻译表达都能改变其m r n a 的稳定性。但至少 有一部分u 0 r f 能对m r n a 的稳定性产生影响。 1 。3 。3 在病毒包装中所起的作用 在一些病毒中，转录的模板既可以是基因组也可以是m r n a 。决定一个特异 m r n a 分子是否装载入新的病毒体或翻译表达的机制尚未知道。因为病毒r n a s 5 端对病毒的复制、翻译和装载都很重要，所以对这些序列的不同功能进行试验性 分析是比较复杂的。 在一些病毒中u a u g 影响病毒基因组形成壳体6 7 j 6 8 ( 6 9 ) ( 7 。鸟肉瘤逆转录病 毒的5 u t r s 含有三个长度和位置非常保守的u o r f ，但它所编码的氨基酸并不 保守。核糖体首先通过第一个和第三个u a u g 启动翻译，至少在无细胞翻译试验 高镣植物基幽l 游可译框架( u 0 r f ) 分析和t a p s g 7 1 9 基因u o r f 对其翻译水平影响的研究 第二章实验设计 2 1 本实验的目的和意义 尽管有大量的核苷酸序列和57 = 暇骗码区序列数据，鉴定含u a t g 的n 1 r n a 还存在不少问题。反转录酶到达r n a 模板5 末端，会表现出末端转移酶的活性， 导致引物延伸方法鉴定m r n a 转录起始点也可能出错i 9 ) ；一些基因剪切或转录 起始位点的不同导致具有不同的57 非编码区序列的多重m r n a ：克隆的c d n a 序列还可能含载体或其它人为序列；染色体中蛋白质编码基因大部分是通过生物 信息学预测的结果，只有少数是通过实验方法验证的，因此，基因库基因的5 7 非编码区边界也不是很准确。但随着对全长c d n a 文库构建策略和方法的改进， 获得更为完整更准确5 和37 非编码区序列成为可能任“。 本实验以拟南芥a m 6 呦抽纳口f 曲h 口) 的全长c d 咐a 数据库 ( h t t p ：s i g n a l s a lk e d u ) 为基础，对c d n a 5 非编码区进行分析，对于相同的基 因取较长c d n a 5 非编码区进行分析。u o r f 和o r f 采用 h t t p ：u s e x p a s y o r 虮o o i s d n a h t m l ， 同源 生比较采用 h t t p ：w w w m c b i n l m n j h g o v b l a s t 和 h t t p ：，、v w e b i a c ，u u c g i - b i n c l u s t a l w c l u s t a l w p l 。对来自( 论1 1 b a l l k 的植物2 2 0 0 多 个c d n a5 非编码区进行分析，非编码区长度1 2 1 3 8 0 b p 之闯，平均长度为 1 0 9 7 b p ，其中5 2 基因57 非编码区长度集中在5 0 1 5 0 b p 之间，1 6 基因5 非 编码区长度在1 5 1 3 0 0 b p 之间，约5 基因5 非编码区长度超过3 0 0 b p 。对5 非编码区的u a t o 进行统计，结果表明含u a t g 的基因比例高达1 8 o ，比原先 估计的1 0 高得多。大多含u o r f 基因基因属于调节基因，因此在调节基因中这 个比例会更高。 珊s g 7 1 9 ，g e n b a n k ：a y 4 5 1 2 3 8 ，该基因全长1 ，1 7 2 b p ，5 非编码区序列长 达3 2 9 b p ，包含多个上游可译框架( u o r f ) ；该基园编码1 8 8 个氨基酸的蛋白质， 大小约为2 0 k d ，等电点为1 2 1 。通过n o n l l e mb l o t 和r t - p c r 分析得到1 世s g 7 1 9 为花粉特异表达蛋白，s o u t h e mb l o t 分析表明瑚s g 7 1 9 可能是多基因家族中的 一员。为研究t a p s g 7 1 9c d n a5 非编码区序列的u o r f 对可译框架的翻译的影 响，构建不同缺失或突交的表达载体，采用麦胚体外翻译系统，结果表明含u o r f 】7 高等植物基网l 一游可译框架( u o r f ) 分析和1 _ p s g 7 1 9 基因u 0 r f j c j 其翻译水平影响的研究 的5 7 非编码区序列能显著抑制蛋白质的翻译水j | ，唁示+ l _ a p s g 7 1 9 基因：获达至 少部分是在戤泽水平上调控。 本文剥植物u a r g 和l l o r f 的统计分析数据构建t a p s g 7 1 9 基凶的不同缺失 和突变表达载体，来研究上游l 可译框架( u o r f ) 对f 游o r f 翻译的鼢帆为进 一步研究u o r f 对蛋白翻译调控提供一定的依据。通过对1 、a p s g 7 1 9 基因在小麦 体内的表达的研究，说明它是一个花粉中期特异性表达的基因，并且可能是多基 因家族中的员。对小麦有性繁殖的基因调控机制作出了定探索性的研究。 高镎植物基因上游可译框架( u o r f ) 分析取、t a p s g 7 1 9 基因u o r f 对其翻译水平影1 1 _ = i 的研究 2 2 实验流程阁 2 2 1 高等植物基因上游可译框架的分析 拟南芥数据厍坦p ；丛i 业j ! ：趔k ：鲴女凶整! 耋夔缨 型直莶! 型序列 在塾她；地! 狸! y ：q ! g 丛q 塑；塑n b 丛塑! 圈土复圭匠压 签! ! 丛曲竖立星歪! q 塞! ： u a t g 两边序列分析 含u o r f 的基因的功能分析 u o r f 编码多肽分析 1 9 iy + 高等植物基因上游可译框架( u o r f ) 分析和卧p s g 7 1 9 基堋u o r f 对其翻译水平影响的研究 hh-_-一 2 2 2 t a p s g 7 1 9 基因u o r f 对其翻译水平影响的研究 酶切 叵叵叵 i r i r 高簿植物基幽】：游可译框架( u o r f ) 分析癣1t a p s g 7 1 9 基因u 0 r f 对其翻译水平影响的研究 2 3 本研究要解决的关键性问题 1 ) ( e n b a l l l ( i _ l _ 12 2 0 0 多个植物基冈的获得。 2 ) 对所歌得基因进行u o r f 和o r i ? ，u a r l l g 的分析。 3 ) 构建含有目的基凶的重组转移载体p i i e l i x 7 1 9 2 ，p h e l i x 7 1 9 一，3 ，和p h e l i x 7 1 9 4 。 4 ) 利用麦胚体外翻译系统( t n t w 1 1 e a tg e r me x t r a c ts ) 。s t e i n ) 分析三种构建载体的 黜译效率。 2 l 高等植物基因上游可译框架( u o r f ) 分析和弘p s g 7 1 9 基因u o r f 对其翻译水平影响的研j 宄 第二部分 高等植物基因上游可译框架( u o r f ) 和t a p s g 7 1 9 基因u o r f 对其翻译水 平影响的研究 高等植物基因上游可详框架( u o r f ) 分析和1 _ p s g 7 1 9 基因u o r f 对其翻译水平影响的研究 第三章高等植物基因上游可译框架( u o 砌d 分析 3 1 材料和方法 本文以拟南芥叫r 口6 f 咖舻括， 口胁”“) 的全，长c d n a 数据库 ( h t t p ：s 吨。a 1 s a l k e d u ) 为基础，对c i ) n a 5 非编码区进行分析，对于相i 司的基 因取较长c d n a 5 非编码区进行分析：u o r f 和o r f 采用 h t t p 肌l s e x p a s 弘o r 卧0 0 1 s d n a h t m l ，同源性比较采 用 h t t p ：，w 砒n c b i n l m m i h g o v ，b l a s t 和 h t t p ：，n v w e b i a c u k c g i - b i n c l u s t a l w ，c l u s t a l w p l 。由于所有序列来自c d n a ，因此 所有序列中的u 用t 表示。 3 2 结果和分析 3 2 1u a t g 出现的频率 本文对来自g e n b a n k 的植物2 2 0 0 多个c d n a 57 荨编码区进行分析，5 非 编码区长度1 2 1 3 8 0 b p 之间，平均长度为1 0 9 7 b p ，其中5 2 基因5 非编码区 长度集中在5 0 1 5 0 b p 之间，1 6 基因57 非编码区长度在1 5 1 3 0 0 b p 之间，约5 基因57 非编码区长度超过3 0 0 b p 。对5 非编码区的u 玎g 进行统计，结果表 明含u a t g 的基因比例高达1 8 ，0 ，比原先估计的1 0 鬲得多4 1 。其中单个m 虹g 的基因约占5 0 ，有2 个u a t g 的基因约占2 0 ，有；个和3 个以上u a t g 的 基因约占3 0 ( 图3 ) 。u a t g 出现的频率往往与5 非编码区的长度正相关，含 u a t g 的5 非编码区的平均长度为2 0 6 6 b p ，显著高于j 非编码区的平均长度。 但也有部分基因5 非编码区的长度超过3 0 0b p ，但未发现有u a t g ，如 a f 3 6 7 2 5 6 。 高等植物基因上游可译框架( u o r f ) 分析和t a p s g 7 1 9 基因u 0 r f 对其翻译水平霄三晌的研究 3 3 讨论 尽管有大量的核苷酸序列平u57 非编码区序列兹掘，鉴定含u a t g 的m r n a 还存存不少问题。反转录酶到达r n a 模板5 味端，会表现出末端转移酶的活性， 导致引物延伸方法鉴定m r n a 转录起始点也可能出错。外；一些基因剪切或转录 起始位点的不同导致具有不同的5 非编码区序列的多重m r n a ；克隆的c d n a 序列还可能含载体或其它人为序列；染色体中蛋白质编码基因大部分是通过生物 信息学预测的结果，只有少数是通过实验方法验证的，因此，基因库基因的5 非编码区边界也不是很准确。但随着对全长c d n a 文库构建策略和方法的改进， 获得更为完整更准确5 和3 非编码区序列成为可能( 8 0 ) 。 我们的统计表明u a t g 出现的基因频率超过1 8 ，比原先估计的1 0 高的多“。 由于上面提到的原因，估计真正的频率还可能会比1 8 略高。大多含u o r f 基因 基因属于调节基因，因此，调节基因含u o r f 基因基因的比例会更高，例如，2 3 的原癌基因具有u a t g ，在一些情况下，这些u a t g 会抑制蛋白质翻译( 8 4 ) 。蛋白激 酶，蛋白磷酸酶，结合蛋白，受体蛋白，转录因子，翻译起始因子，生长因子， m a d s 盒蛋白，诱导蛋白和各种特异蛋白等基因都存在u o r f ，表明u o r f 广泛参与 生物学过程，u o r f 的作用可能是通过调节细胞翻译能力参与细胞生长和分裂的 调控。 不同植物蛋白序列具有一定的同源性，但大多数植物不同种属m r n a 5 7 非 编码区u o r f 编码多肽并不具有显著的同源性，康乃馨、烟草、豌豆精氨酸脱羧 酶u o r f 氨基酸序列分别为m q k s l h i ( a f 0 0 2 0 17 ) ，m v l c c f d s ( a b o l 2 8 7 3 ) ， m l c f p l r a ( z 3 7 5 4 0 1 。并不具有显著的同源性，人和小鼠精氨酸脱羧酶u o r f 氨 高等植物基因上游可译框架(uorf)分析和rrapsg719基附uorf对其翻泽水平影响的研究 表2植物uatg和atg的两边核苷酸序列的偏爱性比较。t a b l e2 c o n l p a r i s o n o fn u c k o t i d e f r e q u e n c i e s a tp o s “i o n s 力a n k i n gt h eu a r gc o d o n a n d a t g i n p l a n t p o s ，一65 432 一l1 23456 1 1 1 。1 _ 。_ _ _ _ _ _ _ - _ _ - 。- _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - - - _ _ _ _ - _ _ 一 u a t g2 7 82 2 5 2 91 8 - 32 3 73 6 7 +1 0 00l o 耋量喜s薹季；0 “ 尹舅一麦 虿：麓熹；精譬一：鍪董。童。墨耄：毫2重善；委；嚣i ；毳5蓝薹! 菁7期型? 妻37 耄妻i 二二_妻季j 芎0 _ 。： 量蠡嘉一美尊呈。争5二 。堇?善誊薹i馨誉： 5；。i i譬室一母ij ? 妻 嘉孽i g ? 童至 鼍量瑟，箩 萎羹萋， 剿塾囊璧、l m 瞪囊矾艇羹￥j 鬟囊奉墓副擘嚣毒旧盘囊1 薹蓬j 炙熬鼙h 8 o ) 1o m m o l l1 i s c l ( p h8 o ) 1o m m o l le d t a ( p h 8 o ) 4 1 1 6 溶液i 5o m m o l 几葡萄糖 25m m 0 1 l t r i s c l ( p h 8 0 ) lo m m o l le d l a ( p h8 0 ) 12 1 。c 、1 5 磅高压蒸汽灭菌2 0 分钟，贮存于4 0 c 。 4 1 1 7 溶液i i o 2 m o l l n a o h ( 用l o m o l ，l n a o h 稀释) 1s d s ( 用1 0 s d s 稀释) 现 x 高等植物基川匕游可详框架( u 0 r f ) 分析和b p s g 7 1 9 基因u o r f 对其翻泽水平影响的研究 明一些u o r f 的翻译能通过衰减作刚( a t t t e n u a t i o n ) 抑制大o r f 剥泽，在这些 情况，u o r f 多肽序列显得不臻誊；蕊社籀h ；拯骛墨项墨奄嚼圳蘑辜囊羁烈锄罐雾 电撼型艇墼掘颁阿阉产i 嚣瓣蠖美丽：黼铲警鱼鬻削蟛稀联攀j 龀鞭意型独， j l 尊螽童琵已曩戮鬲国产a g a rp o n d e f ) 1 9 加入l o o m l l 蛋白电泳缓冲液，加热溶解。 4 1 1 3 05 t r i s - 甘氨酸电泳缓冲液 t r i s 碱 1 5 1 9 甘氨酸9 4 2 1 0 s d s ( 电泳级) 5 0 m l 用90 0 m 1 去离子水溶解后补至1 0 0 0 m 1 。使用前用双蒸水稀释l o 倍。 4 1 1 _ 3 l 考马氏亮蓝染色液 o 2 5 9 考马氏亮蓝r 2 5 0 用9 0 m l 甲醇：水( 1 ：1 ，v ) 和冰乙酸的混合液溶解 后，用w h a m a i l l 号滤纸过滤染液，以除去颗粒状物质。 4 1 1 3 2 ( 预) 杂交液 2 0 s s c3 m l ，5 0 甲酰胺5 m l ，l o s d s2 0 u l ，1 0 封闭液2 u 1 ，d d h 2 04 8 0 u l 。 4 1 1 - 3 32 0 s s c n ac l 1 7 5 3 9 柠檬酸钠 8 8 2 9 溶于8 0 0 m 1 水中，用1 0 m l l n a o h 调p h 至7 0 ，定容至l l ，高压灭菌。 411 3 4d 一3 2 p d a t p 放射性比浓度3 7 0 m b p m l ，1 0 m c i m l ，购自北京亚辉生物医学工程公司。 4 1 1 3 57 5u m o l l d n t p ( d g t p 、d c t p 、d t t p ) m i x m r e 。 4 1 2 1 5 阳离子尼龙膜( b o e 1 r i n g e r m a n n h e i m 公司产品) 4 1 1 3 6 脱色液 9 0m l 甲醇：水( 1 ：l ，v 厂v ) 和1 0 m l 冰乙酸混合。 4 1 1 3 72 s d s 凝胶加样缓冲液 高等扭物基因上避删硅攀“! ；拜摹善i 谢俑打嚣曼巷_ ；j 衙搓h - 鍪群茹嚣幕牮出晶甜懿嚣趟 豸冬堕臻誊( ) n ii 鏊鱼撵域黧蚕i q 引i ；鬟霉l 蔓薹喜羹萋薹雾貅；爨鎏薷 委蠢万崴夯箍霜塑h 嚣鲶菇翟骚琵娃h i 餮i 磊醢攀簧霸 镯引剃碥掰理隹漆滋谳 蜀羹蠹牡蒯鳓科f 雕季捅碾蕊i 会形成可详框架堑篓i 弋 干i 獭镩型瀵i 坞急 k 啪莒节矫试兰1 羹羹像】 嘻劈荫非编码区含有u a t g ，相应地会形成可译框架( u o r f ) ， 根据终止密码子的位置可形成三种u o r f 结构类型。第一种是终止密码子在5 非编码区，被称作非交叉u o r f ；第二种是终止密码子在大o r f 内，u o r f 与大 o r f 有部分序列交叉，被称作交叉u o r f ；第三种u o r f 是山盯g 起始，与主要 o r f 有部分相同的读码框，终止密码子相同，被称作框内u o r f 。从u 0 r f 类型 统计，大部分u o r f 是属于第一种非交叉u o r f ，约占8 5 ，其余属于交叉u o r f ， 而属于框内u o r f 极少数。从含u o r f 的基因类型看，只含非交叉u o r f 的基因 占7 5 ，只含交叉u o r f 的基因占1 2 5 ，既含非交叉u o rf 又含非交叉u o r f 的基因占1 2 5 。编码1 5 个氨基酸的u o r f 占3 0 以上，有近5 的u a t g 直 接与终止密码子相连，编码5 1 0 个氨基酸的u o r f 占2 3 8 ，编码1 0 5 0 个氨基 酸的u o r f 占18 7 ，5 0 个以上氨基酸的u o r f 占3 7 。大部分u o r f 编码多 肽是小于2 0 个氨基酸，占7 7 6 ( 图4 ) 。也有m r n a 的57 非编码区特别长，u o r f 编码多肽可能是有功能的蛋白，如拟南芥菜腈水解酶4 ( a y 0 3 9 54 0 ) 的5 非编 码区为1 3 8 0 b p ，编码4 7 7 个氨基酸的3 磷酸甘油醛脱氢酶；拟南芥菜类b e l l 同 高等植物基因 游可译框架( u o r f ) 分析和b p s g 7 1 9 基嘲u o r f 对j # 翻译水平影响的研究 4 1 1 8 溶液i i l 5 m o l l 乙酸钾6 0 m 1 冰醋酸1 1 5 m l 无菌水2 85 m l 1 2 l 。c 、15 磅高压蒸汽灭菌2 0 分钟，贮存于4 。c ： 4 1 1 95 t b e 电泳缓冲液 t r j s 碱( b o e h r i n g e rm a n n l l e i m 公司产品)5 4 9 硎酸2 7 5 o5 m 0 1 l e d t a ( p h 8 o ) 2 0 m l 用去离子水定容至1 0 0 0 m 1 ，室温贮存。 4 1 1 1 0 溴化乙锭( e b ，1