（食品科学专业论文）乙二醇葡萄糖苷及其己酸酯的制备与纯化.pdf

摘要 摘要 本论文利用乙二醇和葡萄糖为原料合成乙二醇葡萄糖苷，研究乙二醇葡萄糖苷的分 离纯化技术；再以乙二醇葡萄糖苷为中间体，研究非水相酶法合成乙二醇葡萄糖苷己酸 酯的合成工艺，并对产物进行分离纯化，结构鉴定和性能分析。主要研究内容如下： 在酸催化剂存在下，以乙二醇和葡萄糖为原料制备得到乙二醇葡萄糖苷。在乙二醇 葡萄糖苷的合成过程中，乙二醇是过量的，因此需要将合成产物中的乙二醇除去，必须 对产物进行分离提纯。本文利用分子蒸馏法脱除产品中的乙二醇，并与萃取法、减压蒸 馏法进行比较。结果表明分子蒸馏法脱醇效果较好。当进料速率8 0 - - 1 0 0 m l h ，刮膜器 转速2 0 0 r r a i n ，预热温度8 0 ，冷凝面温度2 5 ，蒸馏温度1 5 0 ，体系真空度为2 0 0 p a 时，能使残醇率降低到1 以下，解决了乙二醇葡萄糖苷产品中残醇量较高的问题，进一 步扩大了乙二醇葡萄糖苷的应用范围。 以乙二醇葡萄糖苷和己酸为原料，n o v o z y m e 4 3 5 脂肪酶为催化剂，用生物法合成乙 二醇葡萄糖苷己酸酯。并研究反应溶剂、底物浓度、酶浓度、反应温度、反应时间等对 己酸转化率的影响。得到最佳工艺条件为：以正己烷为溶剂体系，乙二醇葡萄糖苷 0 3 m o l l ，正己酸1 8 m o l l ，酶浓度8 0 m g m l ，反应温度7 0 ，反应时间2 4 h ，正己酸 的转化率可达2 3 7 4 。 通过萃取法和硅胶柱色谱相结合的方式，实现酯化产物的分离，并确定了酯化产物 的分离路线。以氯仿：甲醇( 体积比为8 ：1 ) 洗脱水相物质和氯仿相物质，通过薄层层析 色谱、高效液相色谱和质谱鉴定，洗脱产物分别为乙二醇单葡萄糖苷己酸单酯和乙二醇 单葡萄糖苷己酸二酯。 对乙二醇葡萄糖苷己酸酯混合物、乙二醇单葡萄糖苷己酸单酯和乙二醇单葡萄糖苷 己酸二酯的乳化性和h l b 值进行测定。结果表明三种物质乳化性能良好。 关键词：乙二醇葡萄糖苷；乙二醇葡萄糖苷己酸酯；分子蒸馏；非水相；酯化；硅胶柱 层析 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep r e p a r a t i o n , s e p a r a t i o no fg l y c o l g l u c o s i d e s ，t h eb i o l o g i c a ls y n t h e s i so fg l y c o l g l u c o s i d ec a p r o a t e ，a n dt h ea n a l y s i so ft h ec o n f i g u r a t i o na n dc h a r a c t e ro fg l y c o lg l u c o s i d e c a p r o a t ew e r es t u d i e di nt h i sp a p e r t h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w ： g l u c o s eh e a t e d 、砘t l le t h y l e n eg l y c o li nt h ep r e s e n c eo fa l la c i dc a t a l y s ta n df o r m sa m i x t u r eo fg l y c o lg l u c o s e d s i nt h ep r o c e s so fs y n t h e s i sg l y c o lg l u e o s i d e s ，t h eq u a n t i t yo ft h e g l y c o li ss u p e r f l u o u s ，s oi tn e e dt og e tr i do f a l lt h eg l y c o lf r o mg l y c o lg l u c o s i d e s i nt h es t u d y , t h em o t h o do fm o l e c u l a rd i s t i l l a t i o nw a su s e dt or e m o v et h ee x c e s sg l y c o li nt h ep r o d u c t s ，a n d h a dac o m p a r i s o nw i t l lt h em e t h o d so fs o l v e n te x t r a c t i o na n dv a c u u md i s t i l l a t i o n e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h em e t h o do fm o l e c u l a rd i s t i l l a t i o nw a sm o s te f f e c t i v e w h e nt h ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：f e e df l o wr a t e8 0 。1 0 0 m l h ，f e e dt e m p e r a t u r e8 0 9 c ， w i p e rr o l l i n gs p e e d2 0 0 r m i n ，c o n d e n s a t i o nt e m p e r a t u r e2 5 c ，e v a p o r a t i o nt e m p e r a t u r e 15 0 c a n de v a p o r a t i o n p r e s s u r e2 0 0 p a u n d e rt h i sc o n d i t i o n s ，t h er e s i d u a lg l y c o lc o n t e n tc a l lr e d u c e t o1 a n de v e nl e s s s oi te n l a r g e st h ea p p l i c a t i o n so ft h eg l y c o lg l u c o s i d e g l y c o lg l u c o s i d ec a p r o a t ew e r es y n t h e s i z e db yg l y c o lg l u c o s i d e sa n dc a p r o i ca c i da s r e a c t i o nm a t e r i a l s ，n o v o z y m e 4 3 5l i p a s e 嬲c a t a l y s t t h ee f f e c to fs o l v e n t ，c o n c e n t r a t i o no f g l y c o lg l u c o s e d e sa n dc a p r o i ca c i d ，t h eq u a n t i t yo fl i p a s e ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e o nt h ec o n v e r s i o no fc a p r o i ca c i dw e r es t u d i e d t h eo p t i u mc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：i nt h e s o l v e n to fh e x a n e ，g l y c o lg l u c o s i d e s0 3m o l l ，c a p r o i ca c i d1 8m o l l ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n 8 0 m g m l ，r e a c t i o nt e m p r e t u r e7 0 ，r e a c t i o nt i m e2 4 h ，a n dt h ec o n v e r s i o no fc a p r o i ca c i d 2 3 7 4 w a so b t a i n e d t h es e p a r a t i o no fe s t e r i f i c a t i o np r o d u c t sw e r ef i n i s h e db yt h em e t h o d so fs o l v e n t e x t r a c t i o na n ds i l i c ag e lc h r o m a t o g r a p h y t h eg l y c o lg l u c o s i d ec a p r o i ca c i dm o n o e s t e rw a s e l u t e db yc h l o r o f o r m ：m e t h a n o l ( v ：vi s8 ：1 ) i nt h ew a t e rp h a s ea n dt h eg l y c o lg l u c o s i d ec a p r o i c a c i dd i e s t e rw a se l u t e db yc h l o r o f o r m ：m e t h a n o l ( v ：vi s 8 ：1 ) i nt h ec h l o r o f o r mp h a s e t h e c o n f i g u r a t i o n so f t h ep r o d u c t sw e r ei d e n t i f i e db yt l c ，h p l ca n dm s t h ec h a r a c t e ro ft h eg l y c o lg l u c o s i d ec a p r o a t e ，t h e g l y c o lg l u c o s i d ec a p r o i ca c i d m o n o e s t e ra n dt h eg l y c o lg l u c o s i d ec a p r o i ca c i dd i e s t e rw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e yh a v eg o o de m u l s i f i c a t i o nb yt e s tt h ee m u l s i f i c a t i o na n dt h eh l b v a l u e k e yw o r d s ：g l y c o l9 1 u c o s i d e s ；g l y c o lg l u c o s i d ec a p r o a t e ；m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ；n o n a q u e o u s m e d i a ；e s t e r i f i c a t i o n ；s i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：盐歪塑二日 期：递坠垒一 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容乖纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名盐杰望， 第一章绪论 第一章绪论 1 1 多元醇葡萄糖苷 1 1 1 乙二醇葡萄糖苷简介 乙二醇葡萄糖苷是由淀粉或淀粉的水解产物葡萄糖和乙二醇在酸性催化剂的条件下 脱水形成的一种多羟基化合物。乙二醇葡萄糖苷包括乙二醇单葡萄糖苷和乙二醇二葡萄 糖苷，它们的化学结构如图1 - 1 和图1 2 所示。 乙二醇葡萄糖苷具有多个羟基，与水有很强的亲和力，同时又没有毒副作用，可直 接作为化妆品保湿剂使用【1 2 3 1 。7 - - 醇葡萄糖苷不含半羧醛羟基，不具有还原性，对酸、 碱及氧化剂具有比原来的糖高得多的稳定性。可以经受较高温度、较大压力以及酸、碱 催化剂下的化学反应过程，用途也更加广泛，是制备聚醚心5 1 、聚氨酯塑料【6 ，7 ，引、醇酸树 脂【9 1 和生物可降解表面活性剂【1 伽的重要中间体。 ： ；：i g 萋1 ；- 二1 2 二u ：i - i 。c h ：c h ：。h ： ；：i 三二二。c h ：c h ：。- - 。；：i ；：二二鞘h 图1 - 1 乙二醇单葡萄糖苷的化学结构 f i 9 1 一i c h e m i c a ls t r u c t u r eo fg l y c o lg l u c o s i d e 1 1 2 多元醇葡萄糖苷的研究进展 图1 - 2 乙二醇二葡萄糖苷的化学结构 f i g l - 2 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fg l y c o ld i g l u c o s i d e 多元醇葡萄糖苷可通过直接苷化法【11 1 ，溶剂法【1 2 1 ，转糖苷法，间接合成法【1 3 】，酶催 化法，挤压法【1 4 】等合成，且转化率较高。早在上世纪六十年代，国外以o t e y 教授为首 的研究人员利用淀粉和乙二醇首次合成了乙二醇葡萄糖苷【l o l ，结果显示合成产物中1 m o l 的葡萄糖单位含0 7 m o l 的乙二醇。此后l e i t h e i s e r l 5 1 ，m c k i l l i p l 9 j 等又扩大规模合成了乙 二醇葡萄糖苷。上世纪八十年代开始，国内以金征宇教授为首的研究人员利用挤压法合 成乙二醇葡萄糖苷 1 , 1 3 1 ，转化率达到7 5 。此后金欣，吕树祥等也进行了乙二醇葡萄糖 苷的合成及保湿性研究【2 捌。这些研究表明，在合成多元醇葡糖苷时，反应容易发生，淀 粉或葡萄糖的转化率较高，能达到7 0 0 0 - - 9 0 。 多元醇葡萄糖苷传统的纯化方法以减压蒸馏为主。o t e y 等在1 5 0 c ，1 3 3 p a 的条件 下减压蒸馏去除乙二醇，残醇率为l m o l 的葡萄糖单位含0 0 4 m o l 未反应的乙二醇【l 5 。 f e u g e 等在1 2 0 - - 1 3 0 、1 3 3 4 0 0 p a 的条件下减压蒸出丙三醇【l 酬。金欣，吕树祥等分别 在1 2 0 1 5 0 、6 7 0 - 4 0 0 0 p a 和1 2 0 - - 1 5 0 、1 3 3 p a 的条件下除去7 , - - 醇【2 3 j 。这些研究 表明，减压蒸馏不能使乙二醇完全除去( 残醇率 1 ) ，且产品颜色呈琥珀色甚至黑褐 色，不利于产品的应用。 柱分离是多元醇葡萄糖苷纯化的另一种方法。o t e y 教授采用活性碳硅藻土柱分离乙 二醇f 1 7 】，乙二醇完全脱除；金征宇教授采用先正丁醇萃取，再用活性碳硅藻土柱分离 乙二醇1 1 8 】，乙二醇完全脱除。柱分离法虽能使乙二醇完全分离，但分离时间长，得到纯 江南大学硕士学位论文 品少，不利于进一步研究和应用。 综上所述，由淀粉或淀粉的水解产物葡萄糖和多元醇在酸的催化下较易合成多元醇 葡萄糖苷，转化率可达7 0 9 0 ；但多元醇葡萄糖苷的纯化存在残醇率较高，产品色泽 深等问题。本文尝试用分子蒸馏法进行乙二醇葡萄糖苷的脱醇，降低产品残醇率，提高 分离效率，并使产品在颜色上得到改善。 1 1 3 分子蒸馏 1 1 3 1 分子蒸馏技术简介 分子蒸馏( m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ) 是一种在高真空度下进行分离操作的连续蒸馏过程。 在高真空条件下，物料受热从蒸发面逸出，利用不同分子的平均自由程差异导致其表面 蒸发速率不同而达到分离【1 9 1 。分子蒸馏中蒸发面和冷凝面之间的距离很短，理论上应小 于被蒸出成分的分子运动平均自由程，逸出分子可以不经过分子碰撞而直接到达冷凝面 冷凝，因此分子蒸馏也被称为短程蒸馏( s h o r tp a t hd i s t i l l a t i o n ) 或者无阻行程蒸馏 ( u n o b s t r u c t e dd i s t i l l a t i o n ) 2 0 , 2 。由于分子蒸馏是在高真空远低于沸点的温度下进行的， 蒸馏时间很短，所以该过程己成为分离目的产物最温和的蒸馏方法，特别适合于浓缩、 纯化或分离高分子量、高沸点、高黏度的物质及热稳定性极差的有机混合物。目前，分 子蒸馏已成功地应用于食品、医药、精细化工和化妆品等诸多行业。 1 1 3 2 分子运动平均自由程理论与分子蒸馏基本原理 分子之间存在范德华力及电荷作用力。当两分子相距较远时，分子间的作用力表现 为吸引力，但当两分子接近到一定程度后，分子间的作用力会改变为排斥力，并随其接 近程度排斥力迅速增加。排斥力的作用使两分子分开，这种由接近而至排斥分离的过程 就是分子的碰撞过程。 分子运动自由程就是指分子在相邻两次分子碰撞期间所走的路程( 距离) 。分子运动 平均自由程是指就某一种分子来说，在某时间间隔内自由程的平均值。其公式如下： a m ：j l 。三 ( 1 1 ) = 声7 - 、1 2 万d p ( 1 1 ) 式中：2 m 是平均自由程( m ad 是分子的有效直径锄ap 是分子的环境 压强锄夕；丁是分子的环境温度仅土k 是波尔兹曼常数。 从式( 1 1 ) 中可以看到，分子的环境温度，环境压强和分子的有效直径是影响分子 平均自由程的主要因素。在一定的环境温度和压强下，混合物中各组分分子的有效直径 不同，导致自由程不同，轻分子的平均自由程大，而重分子的平均自由程小。如果冷凝 面与蒸发面的间距小于轻分子的平均自由程，而大于重分子的平均自由程，这样轻分子 不经碰撞直接到达冷凝面而凝结收集，而重分子经过碰撞又返回到蒸发面，从而实现了 分离。这就是分子蒸馏的基本原理。图1 3 给出了分子蒸馏基本原理的示意图。 2 第一章绪论 混合液 、 轻分子z 1 热 手粪? i ? 重组分 轻组分 图1 - 3 分子蒸馏基本原理示意图 f i g l - 3s c h e m a t i cd i a g r a mo fb a s i ct e n e t so fm o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n 1 1 3 3 分子蒸馏的优点 1 蒸馏液膜薄，传热效果高 分子蒸馏的液膜厚度与蒸馏器类型和操作条件有关，一般为0 0 1 0 3 e m ，离心式分 子蒸馏液膜厚度在1 0 弓数量级。 2 蒸馏物料受热时间短，减少了物料热分解的机会 蒸馏物料受热时间的长短同分子蒸馏腔体长度、刮膜速度、物料黏度相关。通常在 分子蒸馏腔体内停留1 0 - - - 2 5 秒。 3 与常规蒸馏相比，蒸馏温度大大降低 分子蒸馏温度远低于物料沸点，由于在高真空下进行，分离操作温度相对于真空蒸 馏降低很多。 4 分子蒸馏是非平衡蒸馏 普通蒸馏的蒸发与冷凝是可逆过程，液相和气相之间达到了动态相平衡；而分子蒸 馏过程中，从加热面逸出的分子直接飞射到冷凝面上，理论上没有返回到加热面的可能 性，所以分子蒸馏是非平衡蒸馏。 5 分离程度高 普通蒸馏的分离因子由各组分的蒸汽分压决定，而分子蒸馏时影响分离因子的因素 还包括分子量的大小。从公式1 2 中可以看出，与普通蒸馏相比，分子蒸馏理论分离因 子增加了( m b m a ) 仉5 倍。其公式如下所示： t 占：p a p b 丝 ( 1 2 ) vm a ( 1 2 ) 式中：8 是分子蒸馏理论分离因子；尸口是a 组分的蒸汽分压锄ap 6 是b 组分的蒸汽分压锄夕；m b 是b 组分的分子量( g m 0 1 ) ：m a 是a 组分的分子量( g m 0 1 ) 。 1 2 多元醇脂肪酸酯 1 2 1 多元醇脂肪酸酯简介 多元醇葡萄糖苷脂肪酸酯是一种新型的淀粉基非离子表面活性剂，由多元醇和脂肪 江南大学硕士学位论文 酸反应生成的一大类有机化合物的总称。图1 4 是乙二醇单葡萄糖苷脂肪酸酯的化学 结构，从图中可见，多元醇脂肪酸酯的亲水基是多元醇( 即乙二醇葡萄糖苷) ，具有多 个羟基；而亲油基是具有较长碳链的脂肪酸( 即r - c o o h ) 。多元醇脂肪酸酯是极好的 表面活性剂，且具有卓越的生物可降解性，不会造成环境污染，被广泛应用于食品、化 妆品、洗涤剂等各个领域。 o c h 2 c h 2 0 h 图1 4 乙二醇单葡萄糖苷脂肪酸酯的化学结构 f i 9 1 - 4c h e m i c a ls t r u c t u r eo fg l y c o lm o n o g l u c o s i d ef a t t ya c i de s t e r s 1 食品工业 目前国际上最常用，其安全性比较明确的五种食品乳化剂除大豆磷脂外，其它4 种 均为多元醇脂肪酸酯。多元醇脂肪酸酯是极好的水包油型乳化剂，且易于被消化，已广 泛用于口香糖、冰激凌、糖果、人造奶油、巧克力、布丁、烘烤食品、婴儿食品、肉类 产品、面条、豆腐、奶酪等食品及食品生产中【2 2 2 3 】。多元醇脂肪酸酯还具有抗老化，防 腐抑菌的作用，可用于食品的防腐保鲜【驯。 2 化妆品 多元醇脂肪酸酯有极好的皮肤学和毒理学特性，无毒、无刺激，可快速的生物降解， 有优良的乳化特性，不改变皮肤的脂肪膜及p h 值，有极好的润肤和保湿特性【2 5 1 。由于 多元醇脂肪酸酯的这些特性，它作为乳化剂和保湿剂，广泛应用在润肤洗剂，霜膏，香 波，眼部卸装剂和香皂等化妆品中【2 6 】。 3 洗涤剂 多元醇脂肪酸酯对人体无害，可配成洗涤剂清洗水果、蔬菜、肉类和餐具【2 7 1 。多元 醇脂肪酸酯还具有防止再污染作用和消泡作用【2 引，能有效抑制阴离子表面活性剂起泡， 可作为洗涤剂的添加剂。 4 其它 多元醇脂肪酸酯可用作制药辅剂【2 9 】，作为脂肪替代品等【3 0 1 。 1 2 2 多元醇葡萄糖苷脂肪酸酯的研究进展 多元醇糖苷脂肪酸酯可通过化学法和酶法合成。1 9 7 1 年m y h r e 先由糖苷和短链酸 在氢氧化钾催化下制备短链多元醇糖苷酯，再进一步和长链脂肪酸转酯合成长链多元醇 糖苷酯【3 l 】。1 9 7 3 年h a r r i e s 以多元醇糖苷和c 6 c 2 2 的脂肪酸为反应物，碳酸钠为催化剂 合成一系列多元醇糖苷酯【3 到。上世纪8 0 年代末国内以金征宇教授为首的科研人员用直 接酯化法，微乳化法和转酯法合成长链多元醇糖苷酯【3 3 1 。经过多年的研究，多元醇糖苷 酯的化学合成方法基本已定型，通常在高温下加入特定溶剂以促使两种不同性质的底物 ( 脂肪酸和多元醇) 相溶，以氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠等作为催化剂催化合成。化学法 合成多元醇糖苷酯一般会引起底物糖的碳化，且单酯含量不高。 4 第一章绪论 自从z a k s 和k l i b a n o v 于1 9 8 4 年首次发表非水介质中脂肪酶的催化行为及热稳定性 的研究后【4 3 j ，酶在有机介质中的性质和催化作用的研究倍受重视。近年来非水相酶法合 成多元醇糖苷酯引起了大家广泛的兴趣，国内外学者在糖和糖苷酯的酶法合成方面做了 不少研究，具体见表1 1 。这些研究表明酶法合成方法简单、转化率高、条件温和、不 引入有毒化学试剂，产物的分离纯化较容易，且合成的产品可近似看成是“天然的”，符 合当代人的消费要求。前人虽在多元醇脂肪酸酯的合成中做了大量工作，但通过酶法合 成乙二醇葡萄糖苷己酸酯未见报道。本文利用非水相酶法合成乙二醇葡萄糖苷己酸酯， 并通过工艺优化，提高己酸的转化率。 表1 - 1 酶法合成糖苷( 糖) 脂肪酸酯 t a b l e l - 1e n z y m a t i cs y n t h e s i so fg l y c o s i d e ( s u g a r ) f a t t ya c i d ee s t e r s 醇基供体酰基供体溶剂体系作者 蔗糖，葡萄糖，果糖，山梨醇硬脂酸，油酸，亚油酸 缓冲液体系 s e i n oh i 1 甲基葡萄糖苷油酸甲酯 苯比啶，正己烷 m u t u aln l j 纠 甲基葡萄糖苷 油酸 苯吡啶( 2 ：1 ) a k o n cc p o j 乙基葡萄糖苷油酸甲酯苯比啶，正己烷 a d e l h o r s tk i j 7 j 葡萄糖正癸酸，辛酸，己酸叔丁醇degn p i j 卅 c 2 一c 6 烷基糖苷c 4 一c 2 4 脂肪酸甲乙酮，正己烷p o u l i n a r r i j 川 果糖，甘露糖，阿拉伯糖月桂酸正己烷t s i t s i m p i k o u c 4 0 ! 丙基糖苷乳酸 乙腈，丙酮，叔戊醇，正己烷w e idz j 葡萄糖 c 6 c 1 6 乙烯基丁酸酯 双相体系 g a n s k ef 1 4 2 1 多元醇糖酯的纯化主要有溶剂沉淀、法【4 钉、萃取法【删、色谱法分离法。溶剂沉淀法和 萃取法纯化后的糖酯通常是单糖酯和多糖酯的混合体，很难得到纯品。色谱法分离糖酯 主要有硅胶柱分离法【4 5 1 、半制备型高效液相分离法【蛔、以白土和硅藻土作为填料的层析 分离法h 刀。由于色谱法分离得到的样品纯度较溶剂沉淀法和萃取法高，有利于进一步研 究单酯和多酯的性质，且硅胶属于刚性填料，以硅胶装柱，柱床不易坍塌，处理量更大， 有利于实现工业化生产。所以本文选用硅胶柱分离法分离酯化后产物，以达到单酯和二 酯完全分离的目的。 1 2 3 非水相酶法反应 1 2 3 1 非水相酶法合成简介及酶促反应影响因素 非水相酶法合成是指在合适的条件下，酶可以在水与有机溶剂互溶体系，水与有机 溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。 水和有机溶剂的作用是非水相酶法合成酯的主要影响因素。 1 水的作用 非水相酶促反应体系中酶分子周围必须要有一定量的水分。水分子直接或间接地通 过氢键、疏水作用、范德华力等维持着酶分子催化活性所必需的三维构象，水的除去将 导致这些构象的改变而使酶失活。研究表明，酶分子需要有一单分子层的水化层将其包 裹1 4 引。但是水含量较高时，对反应的热力学平衡不利，会阻碍酯化合成反应地进行；水 与大部分酶的“热失活”有关【4 3 1 ，在导致酶在高温下不可逆变性失活的一系列热降解反应 5 江南大学硕学位论文 中，水不仅是反应试剂，而且易促进蛋白质的流动，导致热不折叠和热诱导的不正确构 型形成以及热聚结。 2 有机溶剂的作用 有机溶剂可作用于酶的水化层，极性溶剂能溶解大量的水并可剥去酶的结合水，从 而间接地影响酶活。有机溶剂也可能直接作用于酶，破坏酶蛋白活性中心构型的氢键、 疏水作用等而使酶失去活性。另外，有机溶剂会影响底物和产物的分配和扩散，从而影 响酯化率。 1 2 3 2n o v o z y m e 4 3 5 非水相酶法合成酯的机理 1 c a l b 简介 c a l b 全称为南极假丝酵母b 脂肪酶。n o v o z y m e 4 3 5 就是由c a l b 固定在大孔丙烯 酸树脂上形成的一种固定化脂肪酶。南极假丝酵母( c a n d i d a a n t a r c t i c ) 首先在南极洲分 离得到，这株菌可以产生两种性质完全不同的脂肪酶a 和脂肪酶b 。c a l b 的三维立体 结构和氨基酸顺序已被u p p e n b e r g 等在1 9 9 4 年研究得到阳1 。c a l b 是一个球状蛋白， c a l b 的大小为3 0 x 4 0 x 5 0 a ，分子量为3 3 k d ，由3 1 7 个氨基酸组成，主要为a b 折叠， 其立体结构见图l 一5 。 囤i - 5c a l b 的分子立体结构图 f i g l 一5 t h r e e _ 【l i m e n s i o n a ls t r c t u r e o f c a l b 2c a l b 的催化机制 c a l b 的催化主要由s e r l 0 5 - h i s 2 2 4 a s p l 8 7 三联体负责，其催化反应过程遵从“双 双乒乓”机制。此反应有一酰基，酶中间体和两个过渡态。一个用于酶的活性丝氨酸的酰 基化，另一个用于中间体丝氨酯的脱酰化，具体催化机制如图1 - 6 所示。 决定底物选择性的最重要因素是活性口袋的空间限制和疏水性质以及四面体中间 体的稳定方式。与其它脂肪酶相比，脂肪酶b 的活性“口袋”的可利用空间非常有限，因 此显示出较强选择性，x 结晶衍射研究表明活性口袋有两个凹槽；一个凹槽接受酰基， 另一个凹槽接受醇基。其中，酰基凹槽比醇基凹槽更宽，因此c a l b 对酰基供体的专一 性较弱，而对醇基底物有较高的选择性，反应大多发生在伯醇的羟基上。由于活性位点 可利用空间有限，c a l b 就表现出了对碳水化合物6 - o 位的伯羟基的高度选择性酰化。 ，i 第一章绪论 图1 - 6c a l b 催化酯化反应的乒乓机制 f i g l - 6r e a c t i o n sc a t a l y z e db yc a l bf o l l o wap i n g - p o n gb i - b im e c h a n i s m 1 2 3 3 非水相中酶催化的特点 与传统的水相中酶催化相比，有机相中的酶催化具有以下主要的优点：【5 0 5 1 1 1 可以催化水相中酶催化反应的逆反应，如脂肪酶可以催化酯的合成，酯交换反 应，从而大大拓展了酶的应用领域。 2 酶的热稳定性可得到明显提高。 3 酶不溶于有机相，因而容易回收再利用。 4 没有微生物的污染。 5 可以减少由水引起的副反应，抑制与水有关的副产物。 6 固定化酶在有机相中酶不易脱落。 7 产物的分离纯化较为容易。 1 3 本课题的立题背景和意义 我国淀粉资源十分丰富。淀粉的天然原料玉米及薯类的产量都很高。2 0 0 6 年我国玉 米总产量达1 4 5 5 亿吨，约占世界玉米总产量的2 0 。另外，石油资源的减少和价格的 上涨以及环保问题，使淀粉这种天然可再生资源的开发利用显得尤为重要。乙二醇葡萄 糖苷和乙二醇葡萄糖苷酯可由淀粉或其水解产物葡萄糖为原料合成，它们的开发利用可 促进淀粉深加工行业的发展。 早在2 0 世纪6 0 年代，以o t e y 教授为首的研究人员首先合成乙二醇葡萄糖苷，发现 糖苷具有比葡萄糖高得多的稳定性，更耐酸耐碱，用途更广；以后的研究不断表明合成 多元醇葡萄糖苷时，淀粉或葡萄糖的转化率可达7 0 9 0 0 9 , 1 0 , 1 3 j 。多元醇葡萄糖苷的广 泛用途和高转化率，为它的产业化提供了可能性，使得研究更有价值。多元醇葡萄糖苷 纯化时，产物脱醇不彻底是影响其进一步应用的关键。本文通过分子蒸馏法解决多元醇 葡萄糖苷残醇量较高的问题，扩大乙二醇葡萄糖苷的应用范围。 多元醇脂肪酸酯作为一种淀粉基非离子表面活性剂，具有良好的生物降解性，不污 7 江南大学硕士学位论文 染环境，且性质温和、低毒、对皮肤无刺激，在食品、化妆品、洗涤剂和制药等行业有 着极为广泛的应用。从1 9 8 4 年z a k s 和k l i b a n o v 发表了非水介质中脂肪酶的催化行为及 热稳定性的研究后m 】，就陆续有研究者进行酶法合成多元醇脂肪酸酯的研究，但大多集 中在长碳链糖苷酯的研究，关于己酸糖苷酯的报道很少。魏东芝【4 1 1 ，y o n g m e ix i a o 5 2 】 等利用非水相脂肪酶分别合成了乳酸糖苷酯，己酸葡糖酯，说明非水相酶法合成己酸糖 苷酯具有可行性。本文利用非水相酶法合成短碳链糖苷酯( 乙二醇葡萄糖苷己酸酯) ， 并对其进行纯化，研究其性质，为7 , - - 醇葡萄糖苷己酸酯的应用提供理论依据。 1 4 本论文研究的主要内容 基于上述理由，本论文主要从以下几个方面进行研究： 1 分子蒸馏法精制乙二醇葡萄糖苷 2 非水相酶法合成乙二醇葡萄糖苷己酸酯 3 酶法合成产物的分离及分析方法研究 4 乙二醇葡萄糖苷己酸酯的性能测试及应用价值研究 8 第二章乙二醇葡萄糖苷的制备与纯化 第二章乙二醇葡萄糖苷的制备与纯化 2 1 引言 石油资源的减少和价格的上涨以及环保问题，使淀粉这种天然可再生资源的开发利 用显得尤为重要。乙二醇葡萄糖苷是淀粉多羟基化合物的一种，这种淀粉多羟基化合物 不但可以作为化妆品的成分之一【1 2 , 3 1 ，还可以代替多元醇作为中间体制备聚醚1 4 、聚氨 酯塑料 6 , 7 1 、醇酸树脂油漆及生物可降解表面活性剂f 1 0 1 ，从而减轻化学品对石油的依赖。 关于乙二醇葡萄糖苷的合成已有大量文献进行过报道【1 a 3 , s 3 1 ，可通过直接苷化法， 溶剂法，转糖苷法等得到，反应容易发生。而乙二醇葡萄糖苷的纯化方面报道较少，其 传统分离方法是以减压蒸馏为主【2 ，3 。由于乙二醇的沸点较高，减压蒸馏时7 , - - 醇不易 完全除去，且蒸馏时间长，所需温度高，易使未反应的葡萄糖发生焦化，使分离后的糖 苷呈琥珀色甚至黑褐色。乙二醇的存在及产品颜色的加深，限制了其在化妆品领域及化 工等领域的应用，因此急需一种新的分离方法。分子蒸馏技术是一项较新的分离技术， 它根据分子运动的平均自由程的差别实现物质的分离 1 9 1 ，具有分离效率高，分离时间短， 环境污染小，易于工业化连续生产的特点，发展前景良好。 本章首先制备乙二醇葡萄糖苷，然后通过分子蒸馏对其进行纯化，并与减压蒸馏法 和正丁醇萃取法进行比较，结果表明分子蒸馏法脱醇效果较好。 2 2 材料与仪器 2 2 1 实验材料 无水葡萄糖 a r 乙二醇ar 磷酸 a r 氢氧化钠 a r 正丁醇 a r 丙酮 a r 2 2 2 实验仪器 10 0 0 m l 调温恒温电热套 j j 1 型数显电动搅拌器 s h z 3 循环水多用真空泵 2 x z 2 型旋片真空泵 i 也5 2 3 旋转蒸发器 c r 一4 0 0 色差计 p o p e 2 # 舌l j 膜式分子蒸馏仪 w a t e r s 6 0 0 高效液相色谱仪 9 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海振企化学试剂有限公司 深圳市沙头角国华仪器厂 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海贺德实验设备有限公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 k o n i c am i n o l t a 公司 美国p o p e 公司 美国w a t e r s 公司 江南大学硕士学位论文 w a t e r sp l a t f o r mz m d4 0 0 0 质谱仪 美国w a t e r s 公司 2 3 实验方法 2 3 1 乙二醇葡萄糖苷的制备 2 3 1 1 反应原理 c h 扣hc 。o ho h c h | 2 0 h 礴h 犁o h 。憾当礴令u no c h 2 c h 驯+ 蹲u n 令i u no c 邺“喇h + 3 h 一 葡萄糖是一种环状半缩醛，在酸性催化剂作用下可与乙二醇反应生成更为稳定的缩 醛一乙二醇葡萄糖苷。乙二醇葡萄糖苷组成复杂，是由乙二醇单葡糖苷( 包括a ，1 3 异构 体) 和乙二醇二葡萄糖苷( 包括( 1 - 0 t ，0 - 1 3 ，a - b 异构体) 组成的混合物【l “。 2 3 1 2 乙二醇葡萄耱苷的制备过程 在四口烧瓶中加入乙二醇和无水葡萄糖( 摩尔比为4 ：1 ) ，升高温度至8 0 9 0 c ，搅 拌至葡萄糖完全溶解，溶液呈透明状态，取出机械搅拌器，各烧瓶口塞上橡皮塞。加入 催化剂磷酸( 用量为葡萄糖质量的15 9 计，控制反应温度1 2 0 1 3 0 、反应压力为5 0 0 0 6 0 0 0 p a ，加入催化剂时开始计时，反应12 5 h 后，停止反应。待温度降到9 0 时，加入饱 和氢氧化钠水溶液中和至p h 7 8 ，得到透明的浅黄色粘稠液体，即乙二醇葡萄糖苷粗产 品口i 。 2 3 1 3 乙二醇葡萄糖苷的制备装置 乙二醇葡萄糖苷的制备装置如图2 - 1 所示： 机械搅拌温度计 图z - i 乙二醇葡萄耱苷剖备蓑王示意匮 n 9 2 - 1s c h e m s f i c d i a g r a m o f p r e p n r a f l o no f g l y lg l u c o s i d e 2 3 2 乙二醇葡萄悖苷的纯化 2 3 2 1 分子蒸馏法 1 分子蒸馏法精制乙二醇葡萄糖苷试验装置 试验采用p o p c 2 型刮膜式分子蒸馏仪，装置流程图如图2 - 2 所示1 5 ”。 第二章乙二醇葡萄糖苷的制备与纯化 图2 - 2 刮膜式分子蒸馏装置示意图 f i 9 2 - 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fw i p e d - f i l mm o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n 1 电动机2 进料口3 刮板4 真空泵5 冷阱6 二级冷凝水出口 7 二级冷凝水进口8 馏出液口9 一级冷凝水出口1 0 一级冷凝水进口1 1 残余液口 2 分子蒸馏工艺参数的选择 预脱气压力的选择：带气原料在分离腔体内会因气体迅速膨胀而使原料飞溅，影响 分离效果【5 6 1 ，必须脱除物料中的气体。乙二醇在低压下的沸点较低，为了防止其进入冷 阱，又能达到脱除糖苷中的气体和极少量水的目的，选择预脱气压力5 0 0 p a 。 预热温度的选择：c v e n g r o 等认为预热温度较低时，料液黏度较大，在蒸馏器中用 于预热原料的蒸发面积较大，导致有效蒸发面积的减小【5 7 】。由于乙二醇葡萄糖苷料液的 黏度较大，适宜选择较高的预热温度，当蒸馏温度7 0 c ，选择预热温度为7 0 c ，其余情 况为8 0 。 进料速率的选择：进料速率越低，物料在分离腔体内的受热时间越长，乙二醇的去 除越完全。所以试验选择进料速率较低，为8 0 - l o o m l h 。 刮膜器转速的选择：据报道 5 8 】，刮膜器转速过高，物料在加热面上分布的均匀性下 降，同时对设备主体产生不利影响。刮膜器转速过低，又不利于液膜的传热。所以选择 中等转速，为2 0 0 r m i n 。 蒸馏温度的选择：蒸馏温度是分子蒸馏过程中的一个关键性参数。在分子蒸馏脱除 乙二醇的工艺过程中，乙二醇在特定的真空条件下具有不同的沸点 5 9 】。考虑乙二醇在高 真空度下沸点较低，而冷凝面和蒸发面的温度差一般要5 0 以上，冷凝面温度为2 5 。 所以选取蒸发面温度分别为7 0 、9 0 、1 1 0 、1 3 0 、1 4 0 、1 5 0 。 体系压强的选择：体系压强是分子蒸馏过程中的重要参数。根据分子蒸馏的基本原 理可知，乙二醇从蒸发面飞射到冷凝面的过程中，只要使其平均自由程大于或等于蒸发 面与冷凝面之间的距离即可达到分离的效果，没有必要过分提高真空度。所以试验选择 的压强范围较宽，分别为5 0 p a 、2 0 0 p a 、3 5 0 p a 、5 0 0 p a 。 3 分子蒸馏工艺流程 取l o o m l 未脱醇的乙二醇葡萄糖苷于物料瓶中，通冷却水，在冷阱中加入液氮。 原料预热后，开启真空泵进行脱气至物料瓶中只有极少量气泡冒出，脱气完毕。调节压 强到预定压强，升高温度到蒸馏温度，打开刮膜器至2 0 0 r m i n ，进料速率控制在8 0 江南大学硕士学位论文 l o o m l h ，开始蒸馏。乙二醇馏出物被轻组分收集瓶收集，脱醇后的乙二醇葡萄糖苷被 重组分收集瓶收集。工艺流程如下所示： 未脱醇的乙二醇葡萄糖苷 上 厂残留物( 脱醇后的乙二醇葡萄糖苷) 物料瓶真空脱气设定参数分子蒸馏l 馏出物( l - - 醇) 2 3 2 2 溶剂萃取法 取l o o m l 乙二醇葡萄糖苷粗产品，加入1 5 0 m l 正丁醇和1 5 0 m l 水，置于分液漏斗 中，反复摇晃5 m i n 后，静置分层。收集下层水相，加入等量的正丁醇进行第二次、第 三次萃取。将经过三次萃取后的水相浓缩，得到较纯的乙二醇葡萄糖苷样品，用高效液 相测定残醇率。合并上层有机相在2 0 0 0 3 0 0 0 p a 下，7 0 c 下蒸出正丁醇，回收乙二醇。 2 3 2 3 减压蒸馏法 传统的减压蒸馏法分离乙二醇，报道的工艺参数稍有不同，但基本都在温度1 4 0 - - - 1 5 0 ( 2 ，压强5 0 0 , - 一4 0 0 0 p a 下分离，1 6 1 。本章采用的减压蒸馏分离方法与传统减压蒸馏 法一致，工艺参数如下：取l o o m l 乙二醇葡萄糖苷粗产品，在1 3 0 1 5 0 ，3 0 0 0 5 0 0 0 p a 下蒸馏6 h 。减压蒸馏后产品，置干燥器内保存，得琥珀色透明质脆固体。 2 3 3 乙二醇葡萄糖苷的鉴定 2 3 3 1 高效液相色谱分析残醇率 各样品分别取o 5 9 用蒸馏水稀释至