（物理电子学专业论文）双色激光共聚焦生物芯片扫描仪测控和图像采集系统研究.pdf

摘要 生物j 邕：片技术是影响深远的一项技术，它广泛应用于d n a 序列测定、基因 表达检测、新药开发、杂交测序等领域。其市场前景广阔，各国都在深入研究和 开发生物芯片产品。生物芯片扫拙仪作为生物芯片的检测分析设备，发展十分迅 速。生物芯片及其扫描仪的研究，对我国精密仪器的发展具有深远意义。 文章介绍了生物芯片及生物芯片扫描仪的特点和研究意义，并对比国内外扫 描仪的发展现状，提出开发双色激光共聚焦生物芯片扫描仪的必要性和紧迫性。 课题采用两个光电倍增管同时收集红绿荧光信息，两路信号分别进行数据采集， 一次扫描得到两种信息，减小了扫描时间。针对扫描仪实时快速的特点，设计了 位置检测模块、电机驱动模块、图像采集模块。位置检测模块实时检测扫描台位 置，电机驱动模块根据扫描台位置决定是否驱动电机转动，图像采集模块在采集 点将模拟信号数字化，并在f p g a 和u s b 控制器控制下传送到p c 机。三个模 块并行执行，提高了扫描仪图像采集的速度。采用的主要技术包括：共聚焦技术、 微弱荧光信号的采集、位置实时测量和电机驱动、高速数模转换、图像信息乒乓 存储、高速数据传输，使扫描仪在5 0 # m 分辨力下扫描时间5 r a i n 。 文章最后对课题进行总结，并提出以后研究的目标和方向。 关键词：双色共聚焦并行性电路殴汁实时性 本文作者签名 a b s t r a c t w a n gh a o j i e ( p h y s i c a le l e c t r o n i c s ) d i r e c t e db yl u oz h e n g q u a n b i o c h i pt e c h n o l o g yi s a f a r r e s e a r c h i n gi n f l u e n c et e c h n o l o g y , w h i c hi sw i d e l y a p p l i e di n d n as e q u e n c em e n s u r a t i o n ，g e n e - e x p r e s s i o nd e t e c t i o n ，n e wm e d i c i n e d e v e l o p m e n t ，c r o s s b r e e ds e q u e n c e d e t e c t i o n ，a n ds oo n i t sm a r k e tf o r e g r o u n di sw i d e ， a n db i o c h i pi sr e s e a r c h e da n dd e v e l o p e di ne v e r yc o u n t r i e s a sd e t e c t i n gi n s t r u m e n tf o r b i o c h i p ，b i o c h i ps c a n n e rd e v e l o p ss u f f i c i e n t l yf a s t t h er e s e a r c ho fb i o c h i pa n dr e l a t i v e s c a n n e ri sf a r r e a c h i n gm e a n i n gt oe x a c ti n s t r u m e n t s t h ec h a r a c t e r sa n dr e s e a r c hs i g n i f i c a n c eo fb i o c h i pi si n t r o d u c e di nt h et h e s i s ， m e a n w h i l et h ea c t u a l i t yo fb i o c h i pi sc o m p a r e db e t w e e nh o m ea n da b r o a da n dt h e d e v e l o p m e n to fd o u b l e - c o l o rc o n f o c a lb i o c h i ps c a n n e ri s e s s e n t i a la n dn e e d e d i nt h e p a p e r ，i ti sa d o p t e dt w op m t s t oc o l l e c tt w ok i n d so ff l u o r e s c e n c e ( r e df l u o r e s c e n c ea n d g r e e nf l u o r e s c e n c e ) ，e a c ho fw h i c hc o l l e c ti n f o r m a t i o nd i v i d u a l l y s ot h et w ok i n d so f i n f o r m a t i o ni sc o l l e c t e do n et i m e ，w h i c hs h o r t e n st h es c a n n i n gt i m e d u et os p e e d i n e s s a n dr e a lt i m ec h a r a c t e r s ，i ti sd e s i g n e dp o s i t i o nd e t e c t i n gm o d u l e ，m o t o rd r i v i n gm o d u l e ， i m a g ec o l l e c t i n gm o d u l e p o s i t i o ni sd e t e c t e di nr e a lt i m eb yp o s i t i o nd e t e c t i n gm o d u l e t h em o t o ri sd r i v e nb ym o t o rd r i v i n gm o d u l ed u et ot h es c a n n e r sp o s i t i o n t h e i n f o r m a t i o no fc o l l e c t i n gp o i n ti st r a n s i t e di n t od i g i ti ni m a g ec o l l e c t i o nm o d u l e t h e t h r e em o d u l e sa r eo p e r a t e di np a r a l l e l ，w h i c he n h a n c et h es p e e do fi m a g ec o l l e c t i o n t h e m a i nt e c h n i q u e sa d o p t e da r ec o n f o c a lt e c h n i q u e c o l l e c t i o no fw e a kf l u o r e s c e n c es i g n a l ， d e t e c t i o na n dm o t o rd r i v i n gi nr e a lt i m e ，h i g h s p e e da n a l o gt od i g i tt r a n s i t i o n ，p i n g p o n g s t o r eo fi m a g e ，h i g h - s p e e dt r a n s m i s s i o n ，w h i c hr e a c hl e s st h a n5m i n u t e si n5 0 9 m r e s o l v i n gp o w e r a tt h ee n do ft h e p a p e r ；t h e r e s n l t sa n ds h o r t n e s so ft h ep a p e ra r e d i s p l a y e d ， m e a n w h i l et h ed i r e c t i o na n do b j e c t i v ei sb l o u g h tf o l w a r d k e yw o r d ：d o u b l e c o l o r , c o n t b c a l ，p a r a l l e l i l y , c i l c u i ! d e s i g n ，r e a lt i m e 本人申明 本人郑重申明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律责任由本人承担。 论文作者签名：墨生态 日期：坠“；i ：8 ： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解中国科学院光电技术研究所有关保留、使用学位论文的 规定，同意中国科学院光电技术研究所保留或向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权中国科学院光 电技术研究所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：立尘导师签名：遂兰篁!日期： w 彳舌2 3 第一章，“击 第一章引言 2 1 世纪是生物科学的世纪，是生物技术广泛研究和应用的世纪。其中，生物 芯片技术在分子生物学、医学基础研究、疾病基因诊断、临床治疗、药物丌发、 农作物优育和优选、环境检测和防治、食品卫生监督、司法鉴定等领域广泛应用， 影响着生命科学许多领域的研究方法与途径的实现，它将有力促进当代生命科学 的发展。 1 1 课题来源及研究意义 1 1 1 课题来源 本课题来源于中科院“西部之光”计划双色激光共聚焦生物芯片扫描仪 研制。 目前的生物芯片检测仪主要是c c d 生物：占片检测仪和激光共聚焦生物芯片 扫描仪。c c d 扫描仪一次成像，成像速度快，但成像质量不高，主要用于低密 度芯片的检测；共聚焦扫描仪分辨力高，但需要逐点采集图像，扫描速度慢，对 于需要多色激光逐次采集的生物芯片，所需i i 寸f t q 更长1 1 1 。为提高共聚焦扫描仪扫 拙速度，提出将双色激光同h , 1 - j ! , 口& l - 生物芯片，同步采集图像的方法，来提高- ；l 聚 焦扫描仪的扫描速度。以期达到如下的f i 标： ( 】) 扫描分辨力：2 0 0 # m ，1 0 0 p m ，5 0 p r o ，4 0 p r o ，2 0 # m ，】0 , u r n ，5 加1 ；( 2 ) 探测灵 敏度：0 2 荧光分二i - x n a2 ( 3 ) 扫椭速度：5 0 p , m 分辨力下全片扫扪所需时问、 5 m i n 。 11 2 研究意义 生物芯片从其产生7 i ：始，就以高效、快速而迅速发展起来。 最早的生物：占片是由美国旧金l 1 i 以南的一个新型生物公司a f f v m e t r i x 发展 起来n 。sp af o r d e r 及其同事于9 0 年代初期发明了一种利用光刻技术在固相支 持物上光导合成多肽的方法，并在此基础上于19 9 3 年设计了一种寡恢：i ：酸生物 芯片，阻至1 9 9 6 年制造出世界上第块商业化的j 卜物芯片。在此j i j 叫，引蕲上 曾掀起i l k ( i - 物：占片发计i t q t , 4 i _ , i , i j j ，t l ：l ：1 1 ) l t 多种类型的_ i 物芯片技术。! l 物：出片z f ： 问i j i ：i l jl o 多f 内技术刁i 断究蔷，它结介了寡核计酸合成、吲棚合成、p c r 技术、 探针杠j ： 己、分子杂交、大规腆集成1l t l ：1 1 i l i l j 造技术、荧光混做技术、t i d e s 誊器及 “稚【，i 吲州村f 旧像处理1 多仲j 土术，危分休j m 丁乍物j 支1 和i j 他一学科4 f 纳仟 i qj ：i 敏也激光共聚焦生物芯” j 描仪测拄和幽像采集系统l l j f 究 大潜力。 在产业化方面，以生物芯片为核心的相关产业正在全球崛起，各种生物芯片 设计和配套设备产业得到了迅速发展。生物芯片从诞生到现在只有短短几年时 间，但其增长势头非常迅猛，每年以6 5 以上的速度增长，到2 0 0 0 年全球的市 场总值已经达到5 3 1 亿美元，据预t 钡l l ( f r o s t s u l l i v a nr e p o r t7 7 6 10 6 0 1 ) ，今年 估计为6 0 亿美元”“。生物芯片的巨大市场也必然给芯片检测仪器带来无限商机， 其市场前景非常诱人。在生物芯片制备和研究方面，国外的一些研究机构和企业 如a f f y m e t r i x 、b r a x 、h y s e q 等，依靠其强大的科技能力和经济实力，在该领域 的研究丌发中处于领先地位，丌发出的多种芯片已经进入商业应用。在国外，生 物芯片扫描仪的研制主要集中在美国，技术水平也最高。欧洲、加拿大、同本也 有少量研制单位。鉴于生物芯片技术具有巨大的理论意义和实用价值，同时为了 我国生物芯片技术不再重蹈计算机芯片的覆辙，我国政府、科技界和商业界几乎 同时意识到生物芯片技术的重大战略意义和蕴减的无限生机，开展了生物芯片技 术研发。目前，已有近十家单位在开展此类仪器研制。如哈尔滨生物芯片开发有 限公司、江南生物科技有限公司、北京华大基因生物，以及清华大学、中科院微 电子中心、中科院光电所等都在进行生物芯片或相关扫描仪的开发研制。 生物芯片仪器的发展与生物芯片的发展息息相关，保持生物芯片检测仪器研 究水平与国际同步并实现产业化不仅有明显的经济效益，更重要的是其政治意义 和社会效益。因为在2 1 世纪是生命科学时代，中国要成为世界强国，需要不断 提升中国产品形象，我们不仅要求低端产品“中国制造”，更重要的是在高端精 密仪器设备“中国制造”，双激光同步共聚焦生物芯片扫描仪属于作为高新技术 领域的先进精密仪器，对它的研究是我国向世界强国迈进过程中必要且紧迫的一 步。 目前，我国在生物芯片扫描仪系列产品的科研实力上，与国外产品在扫描精 度、扫描分辨力、灵敏度等指标上都接近或优于r a p t - 指标，在价格上也有较大优 势。唯一不足是扫描速度与国外产i 协存在一定差距。如a x o ni n s t r u m e n t s 的 g e n e p i x 系列产品5 0 # m 整片扫拙时问( 双色) 仅为5 m in ，而我囡产品所需时问 6 m i n 。当精度提高时，所需时问相差更大。扫描速度上的差距，使我们必须加 大扫描仪的研发力度，在扫描速度上赶上甚至超过国外产。口f 。 2 课题研究任务及完成的工作 1 21 研究任务 针州j i 0 ：j 内，i 三物芯 i 义的眨胜脱? 队，小川宄：舻丛哒j ：；| 以h 彳标 第一帝一川高 ( i ) 扫描分辨力：有5 , t m ，1 0 u m ，2 0 t m ，4 0 # m ，5 0 * m ，1 0 0 z m ，2 0 0 肛m ( 2 ) 探测灵敏度：02 荧光分子似m 2 ( 3 ) 扫描速度：5 0 # m 双色扫描5 m i n ，1 0 线s 。 扫描分辨力是扫描仪所能观察的最小细节，它主要决定于投影在生物芯片上 的光斑直径以及x 、y 方向的步进精度和测量精度f u l 1 1 2 。 探测灵敏度是指扫描仪测定最小荧光的能力，定义为信噪比大于3 ：l 时能 测定的荧光强度_ l 】。它决定了扫描仪能够探测的生物芯片上最小荧光分子浓 度，它与激发光光源、荧光激发、荧光收集、荧光探测等各个坏节均有关系。 扫描速度决定了扫描生物芯片所需的时问，它与步进电机速度、数据采集和 传输速度有关系。它是扫描仪非常关键的技术指标，决定了扫描仪能否被用户所 接受。因此，把研究的重点主要在提高扫描仪速度，实现更快扫描。提出- 丌发双 色同步扫描生物芯片扫描仪难是为了解决这一问题，追赶世界先进水平。 1 2 2 可行性分析 ( 1 ) 荧光收集 由激光照射引起的荧光经过共聚焦光路后，由光电倍增管( p m t ) 进行收集。 p m t 的光电转换量子效应一般为1 5 2 0 ，而且具有增益高、灵敏度高的优点， 其增益依赖于光电倍增管内部光阴极的数量和加在光电倍增管上的电压，光阴极 的数量多、电压高，则增益大。p m t 增益可达1 07 。生物：占片扫描仪中光电倍增 管增益的设定允许足够的光子被检测，最大的荧光信号使用最大的动念范围。具 体地说，对于1 6 位系统，芯片最亮的斑点，p m t 电压设在使增益为1 6 位的 8 0 9 0 范围内。通常情况下，提高光电倍增管电压并不能提高信噪比，因为 光电倍增管放大信号的同时也放大噪声。 p m t 的另一个特点是在j 4 泛的光密度范周内，p m t 都有线性输出。只要每 种荧光测定的电压固定，那么增益便是常数。 i 垂is j - e ，为了得到高质量的生物；i l q - , 荧光图像，生物：占：1 扫描仪用光 1 倍增管 的选择要考虑以下两个因素：一是 = l = | 于不同的光阴极模式对不同波长的光的灵敏 度不一样，应选门j 被测荧光波长灵敏度高的光r c 三倍增管：二是应选择耐用的商信 噪比光j 【! l 倍增管。 小课题一 ，选朋if i 本h a m a l l l a t s t l 公司的h 7 7 1 2 0 2 ( ：特i = ! 源和放大电j i ! f ) 型光 i n f 阿l ；i ! 1 ， e j 钟a 6 0 1 0 “( v w ) ，处e m i u m j l 应频率2 0 0 k h z 。 ( 2 ) 信号采集 l j ：ip m t 收集剑n 1 荧光f 斋弓mp m t 输为f u 流情弓，l i l ：f 矗i j 为悭拟衍c ，需 要4 ：0 f l 成数h io l 以他hh 眦 j 、小f 冲 翌鱼堂堂苎墅竺兰塑：堡丛! ! 堂堡型丝塑型堡墨堡墨竺坐壅 本课题中，为提高扫描仪扫描精度，同时为与计算机接口方便，将模拟信号 转变成1 6 位数字信号。应用a d 公司的a d 7 6 7 1 作为信号采集器件。它的转换 速度最高可达1 m s p s ( w a r p 模式) ，普通模式下可达8 0 0 k s p s ，输入信号范围 可选择：1 0 v ，5 v ，2 5 v ，o v 1 0 v ，0 v 5 v ，0 v 2 5 v n 典型的功耗为 1 1 2 m w 。转换后的数字信号可并行或串行输出。 在扫描仪l o 线s 分辨力5 # m 的情况下，每秒钟a d 转换次数n = ( 2 2 1 0 3x 1 0 ) 5 = 4 4 k ，选用w a r p 模式，可以完全满足扫描中a d 转换的需求。 ( 3 ) 扫描台运动与位置检测 在生物芯片扫描仪中，x 向驱动选用日本乐孜5 相步进电机，电机型号： m 5 4 1 1 2 d ，步距角o 3 6 0 ，驱动器选用r d 0 5 3 4 m ，对其进行4 0 0 细分，最小步 距角o ：f o0 0 0 9 0 1 8 0 0 ) xn = o 0 0 0 0 1 5 7 ，轮摆设计直径= 5 0 m m ，所以最小 位移分辨力s = r 口= o 0 0 0 3 9 3 m m = 0 4 # m 。 y 向驱动选用乐孜m 5 6 4 0 3 d 五相电机，静力矩o 4 n m ，步距角o 7 2 0 ，4 0 0 细分后，最小步距角0 0 0 1 8 0 ，则最小线位移分辨力s = 0 0 0 1 8 0 1 5 0 0 3 6 0 。= o 0 0 7 5 # m 。 在扫描台位置测量上，分别选用光栅和编码器作为位置传感器。 光栅采用5 0 线m m ，测量分辨力为2 0 “m 光栅，对其进行1 0 细分，则测量 精度为2 # m ，然后对输出信号进行4 倍频，这样，测量分辨力为o 5 # m ，即每隔 o 5 # m 产生一个计数脉冲。可满足5 # m 扫描分辨力要求。同时，其最大测量速度 为5 0 0 m m s ，满足扫描速度1 0 线s 的要求。 y 向采用2 0 0 0 线周( 即转过3 6 0 0 发送2 0 0 0 个脉冲) 的相对式光电编码器。 因为其螺距为2 m m ，所p 2 f , j j 量分辨力= ( 2 m m 2 0 0 0 ) = l z m ，对其信号进行4 倍频， 即转过3 6 0 0 发送8 0 0 0 个脉冲，最终测量分辨力达到o 2 5 # m 。即每隔o2 5 # m 计 数器发送一个脉冲。 e 自以上分析可以看出，所选器件完全能达到实验目标的要求。 ( 4 ) f p g a 速度 课题中主要的处理器采用f p g a ，它是英文f i e l dp r o g r a m m i n gg a t ea r r a y 的 缩写，即现场可编程门阵列。本课题采用x i l i n x 公司的s p a r t a n l i 系列产品，它 有丰富的寄存器和查找表资源，可满足火多数的控制要求，可以直接与t t l 接 j ，无需电压转换j 卷片，其功耗低，发汁灵活。外j j f i 最高时钟频率为2 0 0 m h z 。 步进f 乜机的墩火输入频率为5 0 0 k h z l l 4 1 ，完全满足电机控制i 篮求。f p g al 部 发汁了位置检测模块，最高时钟频；餐j 丛l5 4 m h z ，充全满址随昔1 测- “q k 的需要。 ( 5 ) 高速数据传输 ji 描仪 唤，j ：物，占”j 程l 川r ， 川l l 甜j = i j 的数w ：i ；= 限常人，m 速心1 0 线 箱一市；j i 高 分辨力5 “m 的情况下，a d 转换4 4 k 次，数据量= 2 x4 4 k 1 6 b i t = 1 7 6 k b y t e 。要 将这么大的数据量实时传输，需要高速可靠的数据传输系统，避免前一数据被后 一数据冲掉。本系统中采用u s b 2 0 协议芯片c y p r e s s 公司的c y 7 c 6 8 0 1 3 作 为p c 与底层电路板数据传输的接e l 芯片。它与u s b l 1 协议兼容，可在1 2 m b p s 和4 8 0m b p s 速率下工作，满足了大数据量高速传输的需要。另外，其内部集成 了8 0 5 l 内核、1 2 c 兼容控制器【3j ，控制方便，节省了用户开发时间，是一款性价 比非常高的芯片。 通过以上分析可以看出，开发双色共聚焦生物芯片扫描仪不仅是必要的，而 且是可行的。因此，加紧开发双色生物芯片扫描仪是我国在生物芯片领域的必要 之举。 1 23 完成的工作 在对生物芯片扫描仪特点和可行性进行分析基础上，本人主要作了一下工 作： ( 1 ) 微弱荧光信号的收集。将两路p m t 输出信号进行变换，得到适合数据采 集的信号类型。 ( 2 ) 实时扫描台位置测量和电机控制，保证扫描台准确运动到指定的采集区 域。 ( 3 ) 高速模拟数字变换，将采集点信息数字化，转换成计算机能处理的信息。 ( 4 ) 大容量数据高速传输，保证采集得到的数字量不丢失，不重复。 12 4 论文主要内容 本论文主要i ：t ：1 以下七部分组成： ( 1 ) 生物：吝片技术，包括生物j 吝片概念、分类、生物j 占片的制备和生物：占片的 发展现状以及生物：占片扫描仪的国内外现状： ( 2 ) 生物芯片扫描仪的分类，基本特点，基本原理，重点介绍了双路共聚焦结 构和电路原耻： ( 3 ) f p g a 技术介绍，包括基本的s l i c e 结构，特有的时钟树结构，以及数字 延迟锁棚j 1 ：( d l l ) ： ( 4 ) 寸二i 女台实f f lf 寸肖：i 则! 跫f f f 运动 ，：蚓列： ( 5 ) 微弱f 青号旧检测年像| ，1 9 ：j - l i ：i 采集： ( 6 ) ，、。存员数搠、状态的实i i 地f _ i ，卜要介f i , c y 7 c 6 8 0 13 芯：m 应刷： ( 7 ) 总结用1 段进j 【粜题的t i l l 。jc ：j 戊粜、t 术a | j 扫i 嗣ln 化n ：j l qj 题敞总纠f i ： 魁 翌竺堂垄茎型堡生塑：堡丛! ! 垄坚型篓! 鬯堡墨墨墨竺型! 塑 以后的研究展望。 1 3 本章小结 通过对生物芯片的学术价值和市场应用前景的分析，指出我国大力发展生物 芯片及扫描仪的必要性。同时着重分析了我国生物芯片扫描仪与国外产品的优劣 势，指出我国生物：卷片扫描仪的发展方向。最后，针对差距，提出丌发双色共聚 焦生物芯片扫描仪的目标，并进行了可行性分析。 笙兰里尘塑：堂丛丛生坚墨竺坚些 = 21 生物芯片 21 1 生物芯片概念 第二章生物芯片及扫描仪 所谓生物芯片是指在一定尺寸的基片( 如玻片、硅片等) 上以点阵方式固定 的一系列可寻址的识别分子，点阵中每一个点都可视为传感器的探头，然后与标 记的样品分子进行杂交，其结果利用荧光法、酶标法等显示，再用生物芯片检测 仪器( 如激光共聚焦扫描仪、c c d 生物：占片检测仪) 记录，最后通过计算机软件 进行分析而获取生物信息。 图2 一l 是生物芯片样品： 邕l2 1 酵母基冈组的x - 克隆阵列芯片( 1 8 c m + 1 8 c m ) j c ! _ = 片分析的实质是在面积不大的基片表面上有序的点阵排列了一系列固定 于一定位置：的可寻址的识别分子，结合或反应在相同条件下进行。反应结果用同 位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或c c d 摄像技术纪录信息。迎过汁算机软件分析，综合成可读的总信息。 ：卷片分析实际上是传感器分析的组合。：占一点阵中的每一个单元微点都是一 个传感器的探头。阵列检测可以大大提高检测效率，减少j l l f i - ：量，增加可比性。 因此，芯片技术是传感 ： 技术的发展。 i hj 二最 j j 1 j i l 物芯片主要引柄i 是用于d n a 序列f i j i l j l 0 定，基凶表达游黪定和 基吲突变体的检测、分昕，所以又把它称为d n a ：出片或2 南因芯片。m l ；：| | j h 这 技术l 扩眨年免螋反应、受f 0 q f i ! i f i 等m 梭胲领域，应用i i j 翳二”常广阔。 双包激光共聚m 生物芯”十i - 1 瞄仪测拄干兀| 1 6 | 像采集系统训究 2 1 2 生物芯片分析过程 生物：邕= 片的分析过程可用图2 2 来说明。 样品处理一，目标分子富 芯片制作- 配体点阵及 t 综合信息分析 幽2 - 2 生物芯片分析过程 如图，要最终达到检测病变体，提取有用信息的目标，首先要有d n a 样品， 他的主要来源是从细胞中提取m r n a 后转录成c d n a ，用p c r 扩增技术和d n a 固相合成技术来提取人们希望的各种基因序列。 有了d n a 样品，接着就可以进行目标分子富集。靶标样品核酸与探针之间 的选择性反应，反应双方中一方固定在芯片上，而另一方面则在标记后通过流路 或加样至芯片之上，芯片杂交中固定在芯片上的往往是成千上万的探针，而与之 杂交的是经过标记( 同位素或荧光) 的样品核酸，此靶标样品核酸往往需先经过 标记p c r 扩增或克隆或逆转录( m r n a ) ，然后打碎成文库。同位素或荧光标记 则在扩增或逆转录过程中进行。标记的靶标与固定探针在经过实验确定的严谨条 件下进行分子杂交。j 笛片杂交属于固一液杂交，与膜上杂交相似。影响异源杂交 双链形成的因素包括靶标浓度、探针浓度、杂交双发的序列组成、盐浓度及温度。 选择的条件要使成千上万对的杂交反应中最大多数处于最佳状况中，即使尽可能 多的币确配对物都不遗漏( 假阴性尽可能少) ，有错配的杂交降低至最低( 假 性尽量少) 。 生物芯片与探针分子问进行杂交后，生物芯片上便带有需检测的生物信息。 将生物j 芯片进行洗涤，除去探针周围的荧光试剂，以减少对检测时的干扰。之后 通过生物芯片扫描仪将生物芯片i 的f l 物信息扫读到汁算机h 转变成可供给汁 算机处朋的数挠；，达到乍物信息的以刚和处雕。芯l 结果的u j ) i j 耵处耻要依据标 i d 的报告分于f f j j = b 类来没i ：l 判i 丈装置。最引口j ：胶腆芯片| f | 勺足川化索标 己法，需 经过曝光、显影，然后用具有、 j ：i i ：j ；s j t i e i ( , j 4 ：1 椭仪扫读。、今使用最多也是最成功 的足一_ ；芝光标i d , u j 。它j 激光作为激发比溅! n 0 e 聚l 叫14 1 装甜，j i 仃撇淅的分辨能 j i lj 以j 正艟测i , j ；- 绀小，j f 川j 以f j 撒“f | 0 _ 0 啵 蔓目i j 正f jd 能j i 训j 心忡j e 业多波k 第二章生4 勿出 1 描仪系统j s l 删 的激光来激发两种或更多的荧光素，产生两种或更多的荧光，用p m t 来收集产 生的荧光，经过数字模拟变换，将所得数字信息存储到计算机进行分析。这就 是整个生物芯片分析的全过程。 要快速、准确、高效地实现对生物信息的检测、数据处理和综合信息分析， 就要应用生物芯片扫描仪。从第2 2 节丌始将总体介绍生物芯片扫描仪的扫描原 理、光机结构和电学特点。 2 1 3 生物芯片扫描仪的研究现状 生物芯片经过了制作、杂交后，就要进行芯片测定和扫读及数据的后期处理 和存储。生物：占片的扫读就是将与目标d n a ( 或r n a ) 杂交后、或与目标抗原、 抗体、或受体等目标靶分子反应结合后的生物芯片上成千上万个点阵的生物反应 结果阅读出来，转变为可供计算机处理的数掘。 表2 1 各国生物芯片扫描仪性价比 公p a c k a r db e e c h e rm o l e c u l a rg e n e t ica x o n 司s o l i l t i o n si n s t r u m e n t s d y n a m i c s m ic f o s y s t e m e s i r l s t r u m e n t s 产g e n e t a c b i o c h i pi m a g e r a v a l a n c h eg m s 4 1 8a r r a yg e n e p ix 品 基氚光源荧光0 聚纯扫描激光e 聚焦，共聚n ；9 透激光数：j ? 成像双波k 同时 太 c c d 像桑系统5z 1 3 n m ( c y 3 )两个【l | jh t镜，1 e n e 和 5 3 2 f l m 、6 3 5 n l l l扫描5 3 2 n m 、 设为13 6 m ，p m t 通道 n d y a g 激光4 6 3 5 n m 及6 3 3 n m ( c y 5 ) 讣 0 种荧光个发别滤j 滤光砹计 分2 7um5 0u 、2 0u i l l 、1 0 1 0 0u 像l ( ) u i n 、2 0u i i i1 0 i jm4 0 “i l l 、1 0u i l l 辨l0 i jm 豢 ) 3 i 一一一一f 一一一 一一 述；玖l ：1 动4 城_ 、 i m 述| ，、| 1 包雨1 ：双l 帮j ：，出片【1 i d51 z 包i 司_ !世州2 双也激光共聚熙生物芯j t i 描仪测捧和幽像采集系统研究 ，占片，竹也 需5 m i n 2 0 s 一2 m i l l 灵 3 4 5 个分子u l o 个c y 3 荧光0 1 个荧光 敏2 ( c y 3 ) ： 1 1 5分子um ：分予um 2 度个分子u m 2 ( c y 5 ) 软v is a g eo p ti q u a n ti m a g e o u a n t 5 0g e n e p i x 2 0 件 h d g 价u s $ 6 0 ，0 0 0 t b a u s $ 1 1 0 0 0 0u s $ 5 0 ，0 0 0 格 目前，生物芯片扫描仪的生产厂家主要有：a x o ni n s t r u m e n t s 、p a c k a r d 、 a g i l e n t 、g e n e f o c u s 等公司。虽然我们在生物芯片高端检测仪器激光共聚焦 扫描仪的研究水平基本可与国际水平较量，但我们研制的仪器还存在明显弊端， 那就是扫描速度太慢。以1 0 p , m 分辨力扫标准片为例，a x o n 公司的g e n e p i x4 0 0 0 b 型要9 m i n ，a g i l e n t 的m i c m a r r a ys c a n n e r 约为1 0 m i n ，而我所的s c a n 一3 型要2 5 r a i n 左右。以目前的技术发展水平，我们的扫描仪可用于对扫描速度要求不高的领域， 如国内基因芯片和欧美中低密度基因芯片的检测以及蛋白：占片的检测；对扫描速 度要求高的领域如中高密度的基因j 占片、蛋白芯片等就远远不够了。而且随着生 物j 占片技术的不断发展，不论是在生命科学研究领域还是在临床疾病诊断、药物 筛选等方面，高密度、超高密度生物芯片将成为生物j 卷片的主流。生物芯片朝更 高密度发展，必然要求在提高生物芯片扫描仪分辨力的同时能大大提高扫描速 度。依照现在的发展趋势看，高分辨力高速扫描将成为为未来生物芯片扫描仪的 发展方向。 2 2 双色同步扫描仪的光机原理 2 2 1 双色同步扫描仪 烈包同步描义，匙徉分h ：j 激比jl 聚焦d - 物，出片jm h 义j i 蛳f 卜提j 门。它址 j i l l 过艚舢路比j 电俯增管、模拟放人i u 路、a d 转换 u 鼢采丛刊嘲卜r 采集两路 。t 世圮n j 训计j 分时j i ：墩，j l7 l 求t i ：j l f z 。l ：f ：i ，嗯f l 址、z ，j 第一二章生物芯” 】描仪系统原删 数据采集和传输的实时性要求更高。因此，各模块的协调性要更高，才能完成两 路信号的采集。 图2 。3 是双色激光共聚焦扫描仪的光学原理图。 扫描台 幽2 - 3 扫描仪光学原理幽 如图2 3 ，5 4 35 n m 绿光和6 3 2 8 r i m 红光先合成一束光，经过二色镜反射和 物镜聚光，聚焦到扫描台上的生物：占片，激发：苍片上的荧光物质c y 3 ，c y 5 发光， 荧光经物镜后成为平行光，分别经过分光镜分离出绿红激光， b 滤光片滤除杂光 后，通过物镜聚焦到光栏小孔，最后由p m t 收集荧光信号。 收集到的荧光经过a d 转换为数字信号，经过d s p 和f p g a 控制，由u s b 传输到p c 机进行处理显示分析，得到有用信息。 222 共聚焦技术 i i 于激光共聚焦生物：出片扫捕仪已经小f l i 了让! 大f l j 技术优镑和良好的脚 剧l i ，jj j ，lq 外也币j 。少! i l lj k 激光j 0 紫n j 系统。艾j 说剖 迷j = 14 i 。| l i | i , j - i r 道，j ，i 以_ 女激光i ：。b 逊州；系统f j i 采_ | 1 = jj i 聚m 比路。议激尤激儿系统味删吲枷h2 4j 9 i 永。 双匕激光共聚焦生物出 f 描仪测捧和图像采集系统研究 幽2 - 4 舣激光共聚焦系统激发光路示意幽 a 激光器i ：b 透镜灿： c 激发滤光 ；d 一一透镜 1 i ： e _ 二也镜 一物镜纽；g 一芯 ； h 发射滤光片；卜一透镜纽；卜一探测针扎 a 激光器2 ；b 透镜组：c 激发滤光j hd 透镜组；e 发射滤光”： 一透镜纽：r 探测针扎 图2 4 中，两光路共用二色镜e 、物镜组f 、探测样品g a b ，c d e f g f e h 1 j 为单光源共 聚焦光路，a b c d e f g f e e f - g 为 另一共聚焦光路。以第路为例，激光 器a 发出的激光山透镜组b 先扩展成 直径较粗的光柱，经激发窄带干涉滤光 片，过滤除去其他波长的光，这样可以 大大降低检测的背景，再山透镜组d 重新聚焦后，由二色镜e 反射至物镜 f 1 1 1 0 r e ；c e n c e m i r t 。zm o t f 7s m a l1m 。r r 。r l o 一 o o 一 叭 l i ：反之， 标尺光栅右移时，v 。，v b 电压值将依次出现l l 一 叭一 0 0 一 l o 一 1 1 。因此， 可以根据v 。，v b 的组合出现的顺序判断标尺光栅的移动方向。 在f p g a 设m i 扎内部用一个2 位寄存器s n e w 暂存a 、b 输入信号的值， 用较高频率的时 0 t , f h - 号作为输入时钟，去采集频率+ i i x 十较低的a 、b 输入信号的 值。用2 位寄存器s o l d 暂存上一周j i js l l e w1 1 9 值。这样在每一个时钟上升沿， 可以通过比较s n e w ，s o l d 的值是否按照“1 1 一 1 0 一 0 0 一 o l 一 1 1 ”或“1 1 一 o l 一 o o 一 1 0 一 i i ”的序变化来刿断光栅的移动方向，产生的输出信号为 a s c l k ，s e l 。s e l 表示光栅移动的方向，为1 代表光栅左移，为0 代表光栅右移： a s c l k 表示四倍频产生的信号，即a sc l k 的频率为a 、b 信号的4 倍。这样，f p g a 可以通过s e l 的值来判断扫描台的运动方向，蜘l 图4 1 0 是四倍频信号的顶层模块 图，在i s e 61 ”实现i ”i ，l z i4 1 1 是四倍频模块的仿真结果，出现1 l 一 l o 一 o o 一 oj 一 l l 时，a sc l k 产生负脉冲，s e l 为j ：出脱 o l 一 o o 一 1 0 j j 时，a sc l k 产! l 负脉p i ，s e l 为0 。 王 双也激光共聚焦生物芯” i 描仪测拄耵l 图像采集系统研究 aa sc k b c l k5 e l 图4 1 0 四倍频模块图 图4 - t tm o d e l s i m 仿真幽【2 9 】 关键代码如下【2 1 ： p r o c e s s ( c l k ，a ，b ) v a r i a b l es o l d ：s t d l o g i c _ v e c t o r ( 1d o w n t o0 ) ：= ”l ” v a r i a b l es n e w ：s t d _ l o g i c _ v e c t o r ( 1d o w n t oo ) ：= ”1l ”； v a r i a b l es a i l ：s t d l o g i c _ v e c t o r ( 3d o w n t oo ) ：= ”l l l l ”； b e g i n i f c l k e v e n ta n dc l k = 1 t h e n s o l d ：= s n e w ；一进程中语句按顺序执行 s n e w ：= a & b ： s a l l ：= s o l d & s n e w ； c a s es a t s 光栅左移时， w h e n ”0 0 0 l ”= 一v 。，v b 出现山“o o ”向“0 l ”的转变 s e l = l ： a s _ c l k s e l = 1 ： a sc l k s c l = 1 ； a sc l k s e l = 1 ； a s _ c l k v 。，v b 出现由“o o ”向“l o ”的转变 s e l = 0 ； a s _ c l k s e t = 0 ； a s _ c l k s e l = 0 ； a s c l k s e l = 0 ； a s _ c l k a s _ c l k = 1 ； e n dc a s e ； e n d i f ； e n dp r o c e s s ； 4 13 位置测量模块 四倍频模块的输出是四倍频率于输入信号的信号它是低有效信号。要用此 信号实现位置测量一个简单方法就是对其脉冲个数计数，结合四倍频模块产生 的方向信号，分别