小鼠急性毒性实验及文献资料.doc

苏贝止咳颗粒小鼠急性毒性实验【摘要】苏贝止咳颗粒组方来自民间验方，该方在临床使用多年，疗效确切，安全可靠。具有散寒宣肺，祛痰、止咳、平喘之功，用于急性气管、支气管炎（风寒袭肺证）所致的咳嗽、咳痰稀薄、咽痒、气急等症状。根据该方的功能主治、各味药材的理化性质和验方汤剂的临床应用实践，我们对其进行了止咳、祛痰、抗炎、解热、抗病毒、抗菌等主要药效学实验和急性毒性实验研究。苏贝止咳颗粒经国家食品药品监督管理总局药品审评中心技术审评，发补充资料通知（药审补字2014第1030号），其中药理毒理方面要求为：本品进行的急毒试验未提供剖检结果，建议补充。如果没有观察该方面的内容，建议补充规范的急性毒性试验。针对该问题，该项目研究在前期的申报材料中的确没有详述相关内容，因此按照中心老师的发文内容和相关规定对该品种的急性毒性实验重新进行规范性实验，对实验所有动物进行大体解剖、并对相关重要脏器进行病理形态学观察。实验结果显示，苏贝止咳浸膏小鼠口服急性毒性实验测不出LD50，从而进行小鼠ig最大给药量实验，单次最大给药剂量164g生药/kg，单次最大给药容积为0.8mL/20g，24h内给药3次，连续观察13天，所观察的各项指标均正常，未见动物死亡，实验观察期结束时对所有动物大体解剖和相关重要脏器进行病理形态学观察，未见与药物相关性病变。因此苏贝止咳浸膏小鼠一日口服最大给药剂量为492g生药/kg，相当于临床拟用量的424.1倍。表明苏贝止咳浸膏急性毒性较低，提示苏贝止咳浸膏在临床上急性用药具有一定的安全性。【实验目的】观察苏贝止咳浸膏的小鼠急性毒性。【供试品】1.名称：苏贝止咳浸膏（本实验采用苏贝止咳颗粒为浸膏，实验代号：SB-补1），含量规格及配置：4.1g生药/每毫升浸膏，人用临床拟用剂量81g生药/d。采用小鼠灌胃给药，以最大给药剂量164g生药/kg，最大给药容积为0.8mL/20g，24h内给药3次。剂量、给药途径设置依据：参考临床拟用途径，中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则。2.提供单位：安徽省药物研究所中药二室3.批号： 。4.单次剂量：164g生药/kg，给药容积为0.8mL/20g。5.生理盐水组：氯化钠注射液，由安徽丰原药业股份有限公司无为药厂提供，批号： 。按给药容积为0.8mL/20g给予生理盐水溶液。剂量、给药途径设置依据：参考临床拟用途径，中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则。6.配制：原药液直接给药。【动物】1.来源，种属，品系，合格证：由安徽省实验动物实验中心提供，SPF级昆明种小鼠，远交封闭系，动物合格证号： 。2.体重：1822g3.性别：雌雄各半。4.动物数：50只，每笼5只饲养；5.实验环境：实验室温度2026，相对湿度40%-70%，昼夜明暗交替。实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2013-001。6.颗粒饲料：由南京安立默科技有限公司提供。7.垫料：由南京安立默科技有限公司提供。8.饮用水：饮用无菌水，来源安徽省药物研究所，LAWS实验动物无菌饮用水仪器编号：YQ-14。【实验方法】1.动物识别年龄鉴别方法：见表二和表三表二：小鼠出生后不同时间的外观及形态特征表三：不同日龄的小鼠体重情况日龄（d）外观形态特征1仔鼠裸体鲜红3耳朵露出表皮4脐带疤痕脱落5能翻身8能爬行10能听到声音911全身被上白毛，门齿突出1315眼皮张开，能跳跃，能抓到东西18以后能自行采食，独立生活日龄（d）体重（g）初生1.854.0106.01511.02015.02521.03021.0小鼠性别鉴别：幼年：肛门与生殖器的距离远近，近的为雌性，远的为雄性。成年：雄性可见明显的阴囊，生殖器突起较雌鼠大，肛门和生殖器之间长毛。雌性生殖器与肛门之间有一无毛小沟，距离较近，此外雌性小鼠2-13日龄可见乳头出现，此后乳头逐渐被毛遮掩。2.小鼠LD50预试随机取小鼠10只，雌雄各半,分笼饲养，禁食（自由饮水）12h后，每鼠ig给予苏贝止咳浸膏(164g生药/kg) 0.8mL/20g，如首次给药未见死亡，24h内可给药3次，饲养观察3天。3.小鼠最大给药量实验取小鼠40只，随机分为2组，雌雄各半，禁食（自由饮水）12h后，给药组每鼠ig给予苏贝止咳浸膏（164g生药/kg) 0.8mL/20g，24h内以同等剂量重复给药3次，对照组给予等体积的生理盐水，连续饲养观察13天。每天观察小鼠毒性反应情况，并于灌胃前1天 、灌胃当天、灌胃后第1天、灌胃后第3天、灌胃后第5天、灌胃后第7天、灌胃后第9天、灌胃后第11天、灌胃后第13天称取小鼠体重和饲料消耗量。灌胃后第14天，处死小鼠。3.1系统尸解和病理组织学检查3.1.1系统尸解实验观察期结束时对所有实验小鼠进行大体解剖。实验过程中因濒死而处死的动物、死亡动物应及时进行大体解剖并作病理组织学检查。3.1.2病理组织学检查对所有实验小鼠的下列脏器进行病理组织学检查：脑、心、肝、胰腺、脾、肺、气管、唾液腺、胸腺、肾、肾上腺、食管、胃、小肠、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫、乳腺、膀胱、脊髓、胸骨骨髓。各器官样本均用10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜检查并摄片。【统计学处理】计量资料均以s表示，比较组间差异用SPSS11.0软件包单因素方差分析。【结果】1.小鼠LD50预试小鼠3次给予苏贝止咳浸膏(164g生药/kg) 0.8mL/20g后，未见小鼠死亡，提示小鼠一日3次给予苏贝止咳浸膏做不出半数致死量。2.小鼠最大给药量实验2.1 动物毒性反应情况：给药组小鼠在每次给药后活动相对减少，精神欠佳，饮食减少，大便次数增加，35小时后恢复，毛发有轻度污染，其它各项指标与对照组相比无明显差异，所有指标在给药24小时后均恢复正常。在连续观察13天内小鼠行为活动，精神状态等方面与对照组比较无明显变化。 2.2 灌胃前后体重变化灌胃前小鼠已禁食12h，因灌胃当天给药体积大影响动物进食，因此灌胃当天对照组和给药组小鼠体重均降低，但无统计学差异。其余时间段体重无明显变化，与对照组比较，给药组体重无显著差异(P0.05)。详见表1及图1。表1 灌胃前后小鼠体重情况（g） 对照组 给药组 观察日期 雄性 雌性 雄性 雌性 灌胃前1天 25.21.2 25.01.6 25.11.0 25.11.5 灌胃后第1天 24.31.2 24.51.1 24.11.2 24.41.3 灌胃后第3天 26.51.9 25.41.6 26.91.2 25.51.5 灌胃后第5天 27.52.4 25.91.6 28.01.5 26.11.7 灌胃后第7天 29.42.5 27.21.2 29.31.7 27.01.5 灌胃后第9天 30.62.9 27.71.5 30.71.9 28.11.8 灌胃后第11天 32.22.8 28.71.6 32.02.1 28.62.0 灌胃后第13天 33.32.3 29.62.1 33.42.3 29.82.3 与对照组比较P0.05, n=103.灌胃前后饲料消耗量灌胃当天动物前12小时为禁食时间。与对照组比较，给药组小鼠在灌胃后第1天进食量较对照组减少，但无显著差异，主要原因可能为给药体积大而影响小鼠进食。其余时间小鼠每天食量未见异常，与对照组比较，给药组小鼠无显著差异(P0.05)，详见表2及图2。表2 灌胃后平均每只小鼠饲料消耗量（g） 对照组 给药组 观察日期 雄性 雌性 雄性 雌性 灌胃后第1天 7.11.6 6.31.7 7.01.1 6.12.3 灌胃后第3天 7.21.1 6.50.6 7.11.3 6.71.7 灌胃后第5天 7.40.4 6.62.3 7.40.6 6.61.1 灌胃后第7天 7.70.8 6.70.8 7.61.4 6.80.4 灌胃后第9天 7.71.1 6.82.1 7.80.7 7.00.2 灌胃后第11天 7.90.5 6.91.1 7.91.0 6.90.6 灌胃后第13天 8.10.8 7.20.8 8.11.4 7.20.7 与对照组比较P0.05, n=104.死亡情况：给药后连续观察13天，未见小鼠死亡。5.系统尸解和病理组织学检查5.1系统尸解实验观察期结束时对所有实验小鼠进行大体解剖，对各脏器进行全面肉眼观察。各脏器肉眼观察未见异常。5.2病理组织学检查给药13、26周时和停药2周时，对检测项目中提及的34种脏器进行病理组织学检查。光学显微镜下结果显示，对照组和高剂量组脏器未见明显病变，但对照组16#大鼠和高剂量48#大鼠肾小球毛细血管有轻度扩张充血，组其余脏器未见病变。如表10以及病理组织学报告和病理组织学照片所示。两组各期组织脏器标本病理形态学变化比较无明显差异，综合观察结果，本次实验动物脏器组织未见药物毒性引起的明显病理变化；所见少数肾小球毛细血管轻度扩张充血与药物无明显的相关性，可能为动物处死时应激反应所致；在对照组组、高剂量组之间病理变化无统计学差异；因此，柴芩利胆颗粒长期毒性实验动物大鼠脏器组织无明显药物所致毒性作用。故中剂量组和低剂量组大鼠未作病理组织学检查。结果如表10和病理报告所示。【结论】经预试苏贝止咳浸膏口服急性毒性实验测不出LD50，从而进行小鼠ig最大给药量实验。最大给药量实