（环境科学专业论文）壳聚糖与脂肪酶对除草剂24滴丙酸的手性识别作用研究.pdf

低浓度壳聚糖分子及其纳米微粒与除草剂2 ，4 滴丙酸作用前后对普通核小 球藻生长均起到促进作用，而高浓度则表现出较强的抑制作用，且其抑制作用存 在差异，抑制作用大小依次为：n p c s ) d c p p n p 职) d c p p c s 俾) d c p p ，且随培养时间的延长其抑制作用增强，到9 6 h 时毒性减轻。 ( 3 ) 研究了壳聚糖分子在蛋白核小球藻液中对除草剂2 , 4 滴丙酸及其对映体 降解的手性识别作用。结果表明，壳聚糖分子存在条件下，2 ，4 滴丙酸及其对映 体在蛋白核小球藻液中的残留量出现了明显增加的现象，即壳聚糖分子降低了除 草剂的降解率。同时，2 ，4 滴丙酸不同对映体与壳聚糖结合后在藻液中的降解存 在手性差异，其降解速率大小依次为：僻) d c p p c s 。d c p p c s ( r d d c p p c s 。这与2 ，4 滴丙酸手性对映体本身在藻液中的降解速度顺序不同，除草 剂本身的降解率大小依次为( 脚d c p p 僻) d c p p ( $ d c p p 。 手性除草剂2 ，4 滴丙酸在藻液中的半衰期长短不同，其半衰期大小依次为： ( 回- d c p p 俾) 一d c p p ( 兄$ d c p p ，加入壳聚糖分子溶液后除草剂在蛋白核小球 藻液中的半衰期大小顺序发生了变化，其次序为：( r ) d c p p c s ( s 3 d c p p ；并 由二者作用过程的热力学参数得知其作用力类型主要为疏水作用，且这种作用可 能是其存在手性差异的主要原因；同时根据同步荧光光谱测定结果可以推测除草 剂与脂肪酶的结合位置更接近于蛋白质分子上的色氨酸残基，它对d c p p - 与脂肪 酶之间的手性选择作用可能作出了一定的贡献。且俾s 1 ) d c p p 在高浓度时，对 脂肪酶的激活作用十分显著，而( 尺) d c p p 在低浓度对脂肪酶的抑制作用较 强 关键词：2 , 4 滴丙酸；壳聚糖分子( c s ) ；壳聚糖纳米微粒( n p ) ；手性识别；毒性； 降解；相互作用 a b s t r a c t t h i sp a p e rm a i n l ys t u d i e dt h ec h i r a li n t e r a c t o n so fc h i t o s a na n dc h i r a l a r y l o x y c a r b o x y l i ch e r b i c i d ed i c h o r p r o p ( d c p p ) ，a n dt h et o x i c i t ya n dd e g r a d a t i o n c h a n g e so fd c p pw i t hc h i t o s a nm o l e c u l a r s ( c s ) a n dc h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s ( n p ) i n t h r e ef r e s h w a t e rg r e e na l g a e ，p r e l i m i n a r i l yr e v e a l i n gt h ec h i r a l r e c o g n i t i o na n d e n v i r o n m e n t a le f f e c t so fc sa n dn po nd c p p i na d d i t i o n ，w er e s e a r c h e dt h ec h i r a l i n t e r a c t i o n so fl i p a s ea n dd c p p ，s h o w i n gt h ec h i r a lr e c o g n i t i o na n dm e c h a n i s m s b e t w e e nt h e m t h i sp a p e rc a nb em a i n l yd e v i d e di n t of o u rp a r t s ： ( 1 ) t h ee n a n t i o s e l e c t i v ei n t e r a c t i o n so ff l u o r e s c e n c el a b e l e dc h i t o s a nm o l e c u l a r s ( f c s ) a n df l u o r e s c e n c el a b e l e d c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s ( f n p ) w i t hd c p pw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dc h i t o s a na n dd c p pc a nf o r mo n eb i n d i n gs i t e ，a n dt h ec h i r a l s e l e c t i v i t yw a se x i s t e dw i t hi n t e r a c t i o no r d e r so f ( 回一d c p p 僻印- d c p p ( r ) 一d c p e a n da l s o ，t h ei n t e r a c t i o n so ff n pw a ss t r o n g e rt h a nf c sw i t hd c p p f u r t h e r m o r e ，t h e m a i nf o r c eb e t w e e nt h e mw a st h eh y d r o p h o b i cf o r c e ，a n dt h ee l e c t r o s t a t i cf o r c ew a s a l s oe x i s t e d ( 2 ) t h ee n a n t i o s e l e c t i v ee c o t o x i c i t yo f 陋) - ，( 印- j s ) - d c p pw i t hc sa n dn pi n t h r e ea l g a ew a si n v e s t i g a t e d w ec a nc o n c l u d et h a tc sa n dn ps h o w e dc h i r a l r e c o g n i t i o no nd c p pi nt h r e ef r e s h w a t e rg r e e na l g a e ，a n dt h ec h i r a lr e c o g n i t i o nw a s d i f f e r e n tw i t l ld i f f e r e n ta l g a e f o rc h l o r e l l av u l g a r i st h eo r d e r so fi n h i b i t i o nr a t e s w e r e ( r ) 一d c p p - c s ( $ 一d c p p c s ( r 固一d c p p c s a n d僻) - d c p p 姗 - d c p p - n p d c p p - n p ；f o r s c e n e d e s m u so b l i q u r nt h eo r d e r sw e r e ( s ) - d c p p - c s 似印一d c p p c s 饵) 一d c p p c sa n d ( s ) - d c p p - n p ( 尼$ 一d c p p - n p ( r ) 一d c p p - n p ；a n df o rc h l o r e l l ap y r e n o i d o s at h eo r d e r sw e r e ( r $ 一d c p p c s - d c p p c s 僻) 一d c p p c sa n d ( r s ) d c p p - n p - d c p p - n p ( r ) 一d c p p - n p c sa n dn ph a dd i f f e r e n ti n h i b i t i o nr a t e so nd i f f e r e n tk i n d so fa l g a e ，a n dt h e o r d e rw a sc h l o r e l l ap y r e n o i d o s a c h l o r e l l av u l g a r i s s c e n e d e s m u so b l i q u u s w h a t sm o r e ，t h es a m ek i n do fa l g a es h o w e dd i f f e r e n tr e s p o n s e sw i t hc sa n dn p t h e i n b i h i t i o no fc so nc h l o r e l l av u l g a r i sw a sw e a k e rt h a nn pi nt h ei n i t i a l7 2 ha n d v i i s t r o n g e rt h a nn p a f t e r9 6 h f o rs c e n e d e s m u s o b l i q u u s , c ss h o w e dw e a k e ri n h i b i t i o n t h a nn p , b u tf o rc h l o r e l l ap y r e n o i d o s ac ss h o w e ds t r o n g e ri n h i b i t i o nt h a nn e c sa n dn pw i t hd c p pc a l lp r o m o t et h eg r o w t ho fc h l o r e l l av u l g a r i sa tl o w c o n c e n t r a t i o n s ，w h i l ei n h i b i t ea th i 曲c o n c e n t r a t i o n s a n dt h ei n h i b i t i o nw a sd i f f e r e n t w i t ht h eo r d e ro fn p c s 俾) - d c p p - n p ) - d c p p c s 职) - d c p p f u r t h e r m o r e ，t h ei n h i b i t i o nw a si n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gi n c u b a t i o nt i m e ，b u t d e c r e a s e da tt h et i m eo f9 6h ( 3 ) t h ee n a n t i o s e l e c t i v ed e g r a d a t i o no f 俾) 一，一，僻回一d c p p 诹t hc si n c h l o r e l i ap y r e n o i d o s aw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e s i d u a lr a t i o so f d c p pw i t l lc sc o m p a r e dw i ld c p pi t s e l fw e r ei n c r e a s e di nc h l o r e l l ap y r e n o i d o s a t h a t st os a y ，t h ed e g r a d a t i o nr a t e so fh e r b i c i d ew e r er e d u c e dw i t l lc s 。m o r e o v e r ，t h e c h i r a ls e l e c t i v i t yo fc so nd c p pa n di t se n a n t i o m e r sd o s ee s i s ti nc h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ，w i t ht h ed e g r a d a t i o ns e q u e n c eo f ( r ) 一d c p p c s ( $ 一d c p p c s - d c p p c s a n dt h ed e g r a d a t i o no r d e ro ft h eh e r b i c i d ei t s e l fw a s ( r s ) 一d c p p ( r ) - d c p p 一d c p p , w h i c hw a sd i f f e r e n tf r o mt h es e q u e n c eo fd c p pw i t hc s c h i r a lh e r b i c i d ed c p pi na l g a eh a dd i f f e r e n th a l f - i i f et i m ew i t ht h eo r d e ro f 一d c p p 僻) 一d c p p ( r 固一d c p p ，w h i l et h eo r d e rw a sc h a n g e dw i t hc sa n di t s 职) 一d c p p - c s r - ，s 的毒性是r - 的9 倍；对普通核小球藻来说， r - 表现出了较低的毒性，r s 的毒性是r 的2 4 倍；但是对斜生榈藻来说，其毒 性次序为r - s i 峪，r - 的毒性是r s 的8 倍。对除草剂m c p p 和d c p p 来说， 无除草活性的s 型对映体在粘壤土中滞留的时间要比r 型短( r o m e r o ，2 0 0 1 ) 。 b u s e r 和m f i l l e r 等对瑞士的废水处理厂、河流、径流和湖泊中m c p p 含量进行 检测发现其e f 值却都小于o 5 ( b u s e r , 1 9 9 8 ；b u c h e l i ，1 9 9 8 a ；b u c h e l i ，1 9 9 8 b ) 。马 云等( 马云，2 0 0 5 ) 的研究表明淤泥菌种对d c p p m 的降解存在对映体选择性， r 型的降解速度明显快于相对应的s 型。菌株r a l s t o n i ae u t r o p h aj m p l 3 4 及 b u r k h o l d e r i ac e p a c i ar a s c 只降解s - d c p p ，而a l c a l i g e n e sd e n i t r i f i c a n s 只降解r 对映体( s a a r i ，1 9 9 9 ) l u d w i g 等( l u d w i g ，1 9 9 2 ) 利用高效液相色谱研究了海 洋微生物对手性苯氧羧酸类农药d c p p 的对映体选择性降解，结果发现只有 r - d c p p 被微生物群降解，而s - d c p p 基本没有改变。降解菌s h e r b i c i d o v o r a n s m h 体内两种对映体特异性的c 【酮戊二酸盐类加双氧酶活性的不同，使菌株降解 d c p p 和m c p p 的s 对映体的速率快于其r 对映体( z i p p e r , 1 9 9 6 ；n i c k e l ，1 9 9 7 ) 1 5 3 芳氧丙酸类除草剂与脂肪酶相互作用的手性差异研究 芳氧丙酸类除草剂与脂肪酶的相互作用存在手性差异，它们之间的作用受 多种因素影响一方面是受溶液的p h 影响较大。脂肪酶在酸性条件下，对映 选择性随p h 值的增大而增大；在碱性条件下，对映体选择性发生了降低； 而在近中性条件下，其对映体选择性最高。一种酶往往都有其特定的最适 d h 值，使酶活性部位可离解基团必须处于适当的离子形态，以维持活性 部位的构象，以利于结合底物而进行催化。p h 过低或过高均会影响酶分 子的构象，甚至使酶变性失活( 高贵，2 0 0 2 ) 。 另一方面，吸附作用也能显著增强脂肪酶的反应活性或对映体选择性 ( 高贵，2 0 0 2 ) 。方兆华等( 方兆华，2 0 0 5 ) 发现硅藻土的吸附作用减弱了 脂肪酶与d c p p m 的r 型对映体的结合作用，反应速率降低；而s 型对映体 的反应速率增加，显示了该对映体更加易于接近酶的活性中心。硅藻土对 脂肪酶的吸附，引起酶构象变化，影响农药底物与酶结合的微环境，是酶 促反应的对映体选择性增强的主要原因( f e r n a n d e ，2 0 0 1 ；p a l o m o ，2 0 0 2 ) 。 1 6 本文立意及研究内容 壳聚糖在环境中的储量及其丰富，且随着壳聚糖在现代生产中的广泛应用， 其在环境中的残留量更是庞大，而它所带来的生态效应却少见报道。因此进行壳 聚糖的环境行为研究对甲壳素及壳聚糖类化合物的生态风险评价具有重要的科 学意义。同时，手性芳氧丙酸类除草剂由于被广泛应用而在环境中也广泛存在。 而壳聚糖中的大量氨基可以很容易地键合这些酸性农药的羧基上。另外，壳聚糖 中的双螺旋结构本身就是一个手性环境，所以，其与手性药物的作用必然具有手 性选择。那么研究壳聚糖这个大分子物质对手性除草剂不同对映体的环境行为到 底能否产生影响以及产生什么样的影响这个问题就显得及其重要。 本文通过两种形态的壳聚糖一壳聚糖分子及其纳米微粒与除草剂2 ，4 - 滴丙 酸的相互作用手性差异及两者结合后除草剂对三种淡水绿藻的毒性及其降解影 响，研究了壳聚糖对2 ，4 滴丙酸不同构型的手性识别作用，揭示了壳聚糖对除草 剂2 ，4 滴丙酸的毒性影响及其对映体差异，并研究了壳聚糖分子存在条件下2 ，4 滴丙酸在藻液中的降解行为变化，另外，还研究了脂肪酶与2 ，4 滴丙酸相互作用 手性差异，有助于深入研究大分子物质对除草剂的手性识别作用及其生态行为影 响，以及评价手性除草剂及壳聚糖的生态风险，为以后的清洁无污染生产及使用 有机物提供参考。 2 壳聚糖与2 , 4 滴丙酸相互作用的手性差异研究 2 1 前言 壳聚糖是一类储量及其丰富的碱性多糖，是甲壳素经过脱乙酰化反应而得到 的一种天然高分子物质，具有氨基葡萄糖单元和复杂的双螺旋结构。由于其生物 相容性、可生物降解性、无毒等优点，可作为农药的载体，将农药分子键合到壳 聚糖高分子链上，以提高农药的生物可利用性。但由于壳聚糖作为控制释放载体 的缺点是药物的释放依赖于这个天然高分子的正电荷，对释放环境的p h 值有一 定要求( k o t z e ，1 9 9 9 ) ，为克服壳聚糖这个缺点，人们开发了纳米壳聚糖( h u a n g ， 2 0 0 2 ) ，主要原因是纳米壳聚糖能提供可靠的药物负载保护，是一种具有优良理 化性能和生物活性的天然材质，对人体无害，属于优异的“绿色”纳米材料 ( b o d n a r , 2 0 0 5 ；s a l a m a n c a , 2 0 0 6 ) 众所周知，多糖类的双螺旋结构本身就是一个手性环境，壳聚糖的氨基葡萄 糖单元作为手性中心，其与手性农药的相互作用必然具有手性选择。s c h n e i d e r 等( s c h n e i d e r , 2 0 0 7 ) 研究了壳聚糖溶胶与手性药物o ，o d i b e n z o y l t a r i ca c i d s ( d b t a ) 的机械力学手性识别过程，结果表明当壳聚糖溶胶加入d 型d b t a 或 l 型d b t a 后壳聚糖溶胶的体积会变小，而且这两个对映体药物加入后的壳聚糖 溶胶体积变化呈现1 0 倍的差异，l 型的影响大于d 型。 本实验利用壳聚糖分子中丰富的氨基与异硫氰酸荧光素( f i t c ) 分子中的 异硫氰根反应( 如图2 1 ) 制备了荧光标识壳聚糖，并采用荧光光谱法研究了荧 光标识壳聚糖分子( f c s ) 及荧光标识壳聚糖纳米微粒( f n p ) 与除草剂2 ，4 滴 丙酸相互作用的手性差异，初步揭示了f c s 、f n p 对除草剂2 ，4 滴丙酸的手性识 别作用及其机理，为以壳聚糖分子及其纳米微粒作为农药载体奠定重要的理论基 础。 1 0 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 弱_ m 明k 摹舷畦m 嬲辨_ l 螺 婀口 a 1 m 伪奠c c h ，m 嘲h i 叼l i t 哇 i k 髓 翻曙i 曲啊dc 酗蠢。嘲哦 图2 1 壳聚糖与f i t c 反应制备荧光标识壳聚糖 f i g u r e2 1t h ec h e m i c a ls y n t h e s i so ff i t cl a b e l e dc h i t o s a n 仪器采用日立f - 2 5 0 0 p c 型荧光光谱仪，s c 1 5 型数控超级恒温槽( 宁波天 恒仪器厂) ，j j 1 型精密增力电动搅拌器( 太康科教器材厂) ，m e t t l e ra e 2 0 0 型电子天平。2 ，4 滴丙酸由本课题组合成，纯度 9 9 ，结构经过质谱和核磁 共振验证。壳聚糖为脱乙酰度为9 0 的1 3 型壳聚糖。其他试剂均为分析纯， 实验用水为二次蒸馏水。 2 2 2 实验方法 2 2 2 i 荧光标识壳聚糖制备 首先取1 9 壳聚糖溶于1 0 0 m l o 1 mh a c 溶液中，其次缓慢加入1 0 0m l 无水 甲醇，边搅拌边加入( 用恒压滴液漏斗) ；然后取2 0 m g 异硫氰酸荧光素( f i t c ) 溶于2 0m l 甲醇( 分析纯) 中，再缓慢加入上述正在搅拌的壳聚糖溶液中，在 黑暗室温中反应1 h 反应后的溶液加入o 1 m n a o h 溶液中，静止、沉淀，用蒸 馏水多次冲洗沉淀物，直至洗涤液中没有游离f i t c 基团为止( 用荧光分光光度 计检测，e x ：4 9 0 n m ，e m ：5 2 0 n m ) 。再冷冻干燥印可得到荧光标识壳聚糖( r o u l a , 19 9 9 ) 。 2 2 2 2 溶液配制 5 0 0 r t m 荧光标识壳聚糖纳米微粒( f n p ) 醐j ：取0 0 0 4 9 9 三聚磷酸盐溶于3 0 m l o 1 mh a c 溶液中，再取0 0 2 4 7 9 荧光标识壳聚糖溶于6 0 m lo 1 mh a c 溶液中， 然后把溶解好的三聚磷酸盐溶液缓慢加入荧光标识壳聚糖溶液中，常温下以 1 0 0 0r p m 转速不断搅拌，荧光标识壳聚糖微粒自然产生，最后转入容量瓶中， 低温储存备用。 5 0 0 9 m 荧光标识壳聚糖分子( f c s ) 配制：取0 0 0 6 9 9 荧光标识壳聚糖溶于2 5 m l o 1 mh a c 溶液中即可。2 5 m m 除草剂溶液配制：取0 0 2 9 4 9 除草剂加入5 0m l 容量瓶中，加入2 0m l 丙酮作溶剂，再用o 1 mh a e 溶液定容。 2 2 2 3 荧光光谱法测定 荧光光谱测定采用一系列2 , 4 滴丙酸浓度梯度变化( 0 2 2 5 m m ) 而荧光标识 壳聚糖分子及纳米微粒浓度( 3 0 9 m ) 不变的溶液进行测定。实验取o 3m l5 0 0 r t m 的f c s 、f n p 溶液及一定量的2 ，4 滴丙酸溶液加入到1 0 m l 比色管中，用o 1 m h a c 溶液定容至5 m l ，除草剂最终浓度依次为：0 ，0 0 5 ，o 1 ，o 2 ，0 4 ，o 8 ，1 2 ，1 6 ， 2 2 5m m 。配制好的样品放入恒温槽中，调节温度至2 0 。c 和2 5 。c ，反应2 4 h 后 测定荧光光谱。激发和发射狭缝宽度为1 5 n m ，扫描速度1 5 0 0 n m m i n ，x e 灯光 源，固定激发波长4 7 0 n m ，扫描范围4 9 5 5 5 0 n m 。实验均设置三组平行 2 2 3 数据统计分析 所有实验数据的统计分析均采用o r i g i n7 5 软件进行。 2 3 结果与讨论 2 3 2d c p p 对f c s 及f n p 荧光猝灭作用机理 选择2 9 3 k 和2 9 8 k 两个不同温度进行实验实验时固定f c s 、f n p 的浓度， 逐渐增加d c p p 浓度，测定作用之后体系的荧光强度图2 2 2 4 为2 9 3 k 温度下 d c p p 对f n p 的荧光猝灭光谱，2 9 3 k 温度下d c p p 对f c s 及2 9 8 k 下d c p p 对f c s 、 f n p 均有同样的现象发生。从图2 2 2 4 可以看出，在固定f n p 浓度的条件下，d c p p 对f n p 的荧光产生了规律性的猝灭，同时f n p 最大发射波长均出现微小的红移现 象。 w a v e l e n g t h l n m 图2 22 9 3 k 下僻) d c p p 对f n p 的荧光猝灭 f i g u r e2 2f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff n pw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f 僻) - d c p p ( f r o m o t 0 2 2 5m m ) 1 3 w a v e l e n g t h i n m 图2 32 9 3 k 下( s ) - d c p p 对f n p 的荧光猝灭 f i g u r e2 3f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff n pw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f ( 固一d c p p ( f r o m0 t o2 2 5m l v l ) w a v e l e n g t h n m 图2 42 9 3 k f ( p 峪- ) - d c p p 对f n p 的荧光猝灭 f i g u r e2 4f l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff n pw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f ( 脚一d c p p ( f r o m o t 0 2 2 5 m m ) 1 4 荧光猝灭作用根据猝灭机制通常可分为动态猝灭和静态猝灭其中动态猝灭 由荧光分子与猝灭剂之间发生碰撞引起，而静态猝灭则由荧光分子与猝灭剂结合 形成无荧光复合物引起若d c p p 对壳聚糖的荧光是动态猝灭作用，则其作用过 程遵循s t e m v o l m e r 方程( e f t i n k , 1 9 8 1 ) ： f 0 f = 1 + k s v q 】 ( 1 ) 式中，f o 和f 分别为加入猝灭剂前后体系的荧光强度；k s v 为动态猝灭速率常 数；【q 】为猝灭剂浓度。以最大发射波长5 1 7 n m 处f c s 、f n p 的荧光强度按式( 1 ) 进行线性回归，得到d c p p 对f c s 、f n p 的动态猝灭常数，结果分别见表2 1 、 2 2 。 表2 1d c p p 对f c s 的动态猝灭常数 t a b l e2 1t h ed y n a m i cq u e n c h i n gc o e f f i c i e n t so ff c sw i t hd c c p 表2 2d c p p 对f n p 的猝灭常数 t a b l e2 2t h ed y n a m i cq u e n c h i n gc o e f f i c i e n t so ff n pw i t hd c c p 一般情况下荧光动态与静态猝灭可以根据不同温度下的结果加以区别。对于 动态猝灭，温度升高将增加有效碰撞的离子数和加剧电子转移过程，荧光物质的 猝灭常数随温度升高而增大( c h e n g ，2 0 0 8 a ；c h e n g ，2 0 0 8 b ；s u n ，2 0 0 6 ) 。从表2 1 、 2 2 可以看出猝灭常数随温度升高整体呈现下降趋势，表明d c p p 对f c s 、f n p 的猝灭效应主要归因于静态猝灭机制。 引起荧光猝灭的原因有动态和静态猝灭之分。对于静态猝灭强度和猝灭剂 的关系可由荧光猝灭剂分子间的结合常数表达式导出( 杨曼曼，1 9 9 4 ) 。设生 物大分子含有n 个相同且独立的键合位置，则有 b + n q = q n b( 2 ) 式中，b 为荧光生物大分子，q 为猝灭剂除草剂分子，q 。b 为所生成的复合物 其生成常数为 k - - - q n b q 九b 】 ( 3 ) 若荧光体总浓度为【b o 】，则【b o 】- 【q n b 】+ 【b 】， b 】为荧光体游离浓度。而在静态猝 灭中，荧光体的荧光强度与其游离浓度成正比，则有 l g ( f o - f 佣= l g k + n l g q 】( 4 ) l ；, l l g ( f o v y f 对l g 【q 】作线性拟合，即可通过斜率和外推直线的截距求出除草剂 与f c s 、f n p 的结合常数k 和结合点数1 1 ，结果分别见表2 3 、2 4 。 表2 3 除草剂与f c s 作用的结合常数和结合位点数 t a b l e2 3t h eb i n d i n gc o n s t a n t sa n ds i t e sb e t w e e nf c sa n dd c p p 表2 4 除草剂与f n p 作用的结合常数和结合位点数 t a b l e2 4t h eb i n d i n gc o n s t a n t sa n ds i t e sb e t w e e nf n pa n dd c p p 由表2 3 、2 4 可以看出，在实验设置的两个温度条件下，d c p p - 与壳聚糖分子 及壳聚糖纳米微粒之间均可形成一个结合位点。同时，除草剂不同对映体与壳聚 糖的结合能力存在差异，结合作用大小均依次为( 研d c p p 职d d c p p ( r ) d c p p 。且整体上，壳聚糖纳米微粒与d c p p 的结合作用大于壳聚糖分子的结合作 用，这是由于壳聚糖由分子状态变为纳米微粒状态增加了壳聚糖与d c p p 的接触 机会，结合反应的几率也相应增加。 2 3 4 d c p p 与f c s 、f n p 的主要作用力判断 有机小分子和生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、氢键、范德华力 和静电引力等( k l o t z ，1 9 4 9 ；r o s s ，1 9 8 1 ) 。r o s s 等( r o s s ，1 9 8 1 ) 根据大量的实验 结果，总结出了判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力 性质的热力学规律，即疏水作用力对体系的h 和s 产生正的贡献，而氢键作用 力和范德华力使a h 和s 变负，静电作用力使a h 0 。在温度变化不大时， 反应的焓变a h 可以看做一个常数，由稳定常数可以求出反应的自由能变a g ： a g r t l n k ( 5 ) 然后根据下式分别求出a h 和a s ： l n ( k e k d = 1 厂r l - lr r 2 j a h r( 6 ) a g = a h t a s ( 7 ) 由前面所求得的结合常数k 值通过以上公式可求得d c p p - 与f c s 、f n p 0 9 基本 热力学参数，结果分别见表2 5 、2 6 。 表2 5d c p p 与f c s 作用的基本热力学参数 t a b l e2 5t h eb a s i ct h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r so f t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nf c sa n dd c p p 表2 6d c p p 与f n p 作用的基本热力学参数 t a b l e2 5t h eb a s i ct h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r so ft h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nf n pa n dd c p p 从表2 5 、2 6 d p 数据可以看出在2 9 3 k 和2 9 8 k 两种温度下，a g 均为负值，表 明壳聚糖与d c p p 的结合反应均能自发进行。i 扫a h 0 及a s o 可知，壳聚糖与d c p p 之间均以疏水作用力为主，这种疏水作用力来源于壳聚糖的氨基葡萄糖单元 与2 ，4 滴丙酸苯基间的相互作用，同时也存在静电作用，来源于壳聚糖的氨基与 2 ，4 滴丙酸的羧基之间的作用。且除草剂s 型与壳聚糖的自发反应更易于进行， 其次为r s 型及r 型。进一步证明了壳聚糖- 与i d c p p 之间的作用存在手性选择，且 疏水作用可能是影响其手性选择的主要作用力。 2 4 小结 由本章研究我们可以得出，d c p p 与壳聚糖分子及壳聚糖纳米微粒之间均可 形成一个结合位点。且除草剂不同对映体与壳聚糖的结合能力存在差异，结合作 用大小均依次为( 研- d c p p ( r 0 9 d c p p ( r ) - d c p p ，即壳聚糖分子及纳米微粒对 除草剂具有手性识别。另外，壳聚糖纳米微粒与d c p p 的结合作用大于壳聚糖分 子的结合作用，以及d c p p 与壳聚糖之间主要以疏水作用力为主，同时也存在静 电作用。从这个意义上来讲，以壳聚糖分子及其纳米微粒作为除草剂2 ，4 一滴丙酸 的载体是完全有可能的，且壳聚糖纳米微粒的性能强于壳聚糖分子。 3 壳聚糖- 92 ，4 滴丙酸作用对三种淡水绿藻的生长效应差异研究 3 1 前言 壳聚糖及其衍生物是2 1 世纪的新材料，它对人类社会的发展与进步有着巨大 的作用，已是一种内涵丰富，前景广阔的全球化和高新技术化的物质，己成为世 人瞩目的前沿科学领域。 有关壳聚糖在实验动物上的急性毒性国内外已有较多的研究。石玲等( 石玲， 2 0 0 0 ) 在有关壳聚糖的小鼠灌胃最大耐受量试验研究中，给药量达4 9 8 0 m g ( k g b w ) 时，小鼠无一死亡且活动全部正常。李华等( 李华，2 0 0 4 ) 在壳聚糖的急性毒性 实验中，测得壳聚糖小鼠和大鼠灌胃给药的最大耐受剂量l d 5 0 分别大f f - 1 6g k g 、 7 5 9 k g 。s o a n e 等( s o a n e ，1 9 9 9 ) 在兔上的1 0 天急性毒性研究表明，壳聚糖口 服l d 5 0 为1 6 9 ( k g b w ) ，各组织器官亦无任何肉眼及显微病变。a s p d e n 等( a s p d e n ， 1 9 9 6 ；a s p d e n ，1 9 9 7 a ；a s p d e n ，1 9 9 7 b ) 的系列研究也表明壳聚糖的毒性是可以忽 略的。刘万顺等( 刘万顺，1 9 9 9 ) 报道，羧甲基壳多糖在小鼠的急性经1 ：2 毒性的 l d s o 5 0 0 1 m g k g 。由以上报道我们可以知道，壳聚糖对动物的几乎不产生毒性 但有机物对动物和植物的毒害机制及途径存在较大差异，而有关壳聚糖对植物的 毒性情况目前少见报道。 藻类是淡水水体中常见的类群，对群落初级生产及富养水体的净化起着重 要作用，其中某些种类，特别是小球藻属的存在与否可作为水质评价的指标 ( c o u t u r e ，1 9 8 5 ；e 1 s h e e k h ，1 9 9 4 ) 。藻类是水生环境中的初级固碳生物、氧气提 供者，藻类的数量与其它生物之间存在一个动态平衡关系，在浮游动物、大型水 生植物、鱼类之间起着非常重要的营养链接作用。欧美等国大量研究表明，多数 除草剂不仅会直接对水生动植物产生毒害( c u p p e n ，1 9 9 7 ；k i r b y , 1 9 9 4 ) ，而且对藻 类生长有明显的抑制作用( a b o u w a l l y , 1 9 9 1 a ；a b o u w a l l y , 1 9 9 1 b ；f a u s t ，1 9 9 4 ； f a n ，1 9 9 5 ；m a y a s i c h ，1 9 8 6 ；s t r a t t o n ，1 9 8 7 ；s a m s o n ，1 9 8 8 ；s t r a t o n ，1 9 8 4 ) ，使藻类 的多样性指数下降，进而影响藻类和浮游动物种群结构和功能，对水生生态系统 产生危害。蛋白核小球藻、普通小球藻、斜生栅藻对毒物敏感、个体小、繁殖快、 培养方便( g e n s e m e r ，1 9 9 9 ；p a r r ，2 0 0 2 ) ，在较短时间内可得到化学物质对其许 多世代及种群水平的影响评价，是一种常用的测试生物( l e w i s ，1 9 9 5 ；m a , 2 0 0 2 ) 藻类对有毒化学品的反应表现为生理、生化、形态、亚显微结构和细胞遗传 以及藻类生长繁殖等各个方面( b a n a t ，1 9 9 0 ；o k a y ，1 9 9 4 ；王翠红，1 9 9 9 ) 本实 验用反映藻类生物量的良好指标藻液吸光度作生测指标，研究了2 ，4 滴丙酸与壳 聚糖分子及纳米微粒结合前后对三种淡水绿藻的毒性作用差异，对有机物进行生 态风险评价有着十分重要的意义。 3 2 实验部分 3 2 1 仪器与试剂 s h i m a d z u u v - 2 4 0 1 p c 紫外一可见光分光光度仪( 日本岛津) ；h v e 5 0 高压 灭菌锅( 日本h i r a y a m a ) ；r x z 人工智能气候箱( 宁波江南仪器厂) ；b r l 0 0 和 b r l 0 0 0 移液枪( b i o r a d 公司) ，光学显微镜，血球计数板，微量进样器，各种规 格的容量瓶，三角瓶等。 供试藻种：蛋白核小球藻( c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a ) ，普通小球藻( c h l o r e l l a v u l g a r i s ) ，斜生栅藻( s c e n e d e s m u so b 脚u u s ) ，购自中国科学院水生生物研究所。 2 ，4 滴丙酸由本课题组合成，纯度 9 9 ，结构经过质谱和核磁共振验证。 壳聚糖为脱乙酰度为9 0 的b 型壳聚糖。壳聚糖纳米微粒由壳聚糖分子与 三聚磷酸盐发生交联反应而制备。其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 3 2 2 实验方法 3 2 2 1 壳聚糖分子和纳米微粒制备 壳聚糖分子( c s ) 制备：4 m l 水逐渐加入8 m l 壳聚糖溶液中( 0 2 5 0 1 m 乙酸) ，常温下以1 0 0 0r p m 转速不断搅拌，直至壳聚糖完全溶解为止( h u a n g ， 2 0 0 4 ) 。随即转入容量瓶中，低温储存备用。 壳聚糖纳米微粒( n p ) 制备：壳聚糖纳米微粒采用壳聚糖分子与三聚磷酸钠 ( t p p ) 在高速搅拌下发生离子交联反应而制备。方法是4 m l 三聚磷酸钠( 0 1 0 水) 逐渐加入8 m l 壳聚糖溶液中( 0 2 5 o 1 m 乙酸) ，常温下以1 0 0 0r p m 转速不断搅拌( h u a n g ，2 0 0 4 ) ，壳聚糖纳米微粒自然产生随即转入容量瓶中， 低温储存备用 3 2 2 2 绿藻的驯化培养 以普通小球藻、斜生栅藻及蛋白核小球藻为研究对象，培养基为水生4 号 ( 船- 4 ) 人工培养液( 表3 1 ) 将固体培养基中的藻种在无菌条件下接种至水 生4 号人工培养液中，于r x z 型智能人工气候箱恒温光照培养至对数生长期， 并进一步扩大培养。培养方法：用5 0 0m l 三角瓶，移取2 0 0 4 0 0m l 水生4 号 人工培养液，接种藻种使之成淡绿色。用四层纱布封口以防污染，培养温度为 2 4 士1 0 。c ，4 5 0 0 5 0 0 0l u x 连续静止培养。每天定时摇动5 - 6 次，以减少水藻细胞 贴壁现象，并尽可能保证对藻液光照均匀。为防止藻种老化，一般1 0 天左右接 种一次。 表3 1 水藻培养液水生4 号的配制 t a b l e3 1c o m p o s i t i o n so f a l g a ls em e d i u m ( h b 4 ) 培养基组分含量 硫酸铵( n h 4 ) 2 s 0 4 过磷酸钙 硫酸镁( m g s