（环境科学专业论文）生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应.pdf

肝脏p o d 活性在曝油第4 d 时3 2 m g l 组被极显著抑制，因此认为肝脏p o d 、 l s z 和鳃丝n a + k + - a t p a s e 可作为反映半滑舌鳎幼鱼在原油污染条件下逆境 生理的生化指标，而肝脏l s z 和鳃丝n a + k + a t p a s c 比肝脏p o d 对胜利原 油污染胁迫更为敏感，更适合作为石油类污染的生物标志物。 ( 3 ) 污染胁迫解除后，不同浓度组各种酶活性的恢复情况存在差异， 这表明污染物对生物体的毒性效应存在一定的阈值，在这个阈值内机体未发 生中毒反应，污染胁迫解除后也能较快的恢复到正常水平，当污染物对生物 体的作用超过机体的适应能力时，生物体出现中毒反应，即使解除污染胁迫 后，生物体的酶活性也不能恢复到正常水平。从污染胁迫解除后各实验组半 滑舌鳎幼鱼7 种酶活性的恢复情况分析，胜利原油对半滑舌鳎幼鱼c a t 、 g p x 和l s z 活性影响的阈值在o 2 和0 4m g l 之间，对g s t 活性影响的阈 值在0 8 和1 6 m g l 之间，对s o d 活性影响的阈值在1 6 和3 2m g l 之间， 而对p o d 和n a + k + a t p a s e 活性影响的阈值在3 2m g l 以上，。 ( 4 ) 建立基于整合生物标志物响应( i n t e g r a t e db i o m a r k e rr e s p o n s e s ，i b r ) 指数的多种生物标志物响应的综合评价指标。从i b r 值随时间变化趋势来 看，各试验组在曝油前期i b r 值与曝油时间基本呈正相关关系，后期i b r 值与曝油时间基本呈负相关关系。从i b r 值与曝油浓度的关系来看，不同 曝油时间i b r 值随石油浓度的增大基本呈升高降低升高的趋势。 关键词：胜利原油；半滑舌鳎；抗氧化系统酶；免疫相关酶；生物标志 物 u u s i n gb i o m a r k e r st os t u d yt o x i ce f f e c t so f s h e n g l i c r u d eo i lo nc y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s a bs t r a c t i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ef e a s i b i l i t yo fa n t i o x i d a t es y s t e me n z y m e sa n d s e v e r a lk i n d so fi m m u n ee n z y m e sa st h eb i o m a r k e r so fp e t r o l e u mp o l l u t i o n ，t h e j u v e n i l ec y n o g l o s s u ss e m i l a e v i sw a se x p o s e dt os h e n g l ic r u d eo i la td i f f e r e n t l e v e l s ( o 1 ，0 2 ，0 4 ，0 8 ，1 6a n d3 2 m g l ) s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ， c a t a l a s e ( c a t ) ，g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ( g p x ) ，g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ( g s t ) ， p e r o x i d a s e ( p o d ) ，l y s o z y m e ( l s z ) i nl i v e ra n dn a + - k + - a t p a s ei ng i l lo f j u v e n i l ec y n o g l o s s u ss e m i l a e v i sw e r em e a s u r e di ne x p o s u r et i m eo f1 ，2 ，4 ，8 ， 15 d a y sa n dr e m o v e dp o l l u t i o nt i m eo fi ，3d a y s t h em a i n l yr e s u l t si s f o l l o w i n g 1 i nt h e15 - d a yo i le x p o s u r ep e r i o d ，t h ea c t i v i t yo fs o da n dc a th a dt h e t r e n do fi n c r e a s e d e c r e a s e i n c r e a s ew i t ht i m e t h eg p x a c t i v i t yi n c r e a s e dt ot h e m a x i m u mo nt h e4 t hd a ya n dt h e nd e c r e a s e d t h eg s t a c t i v i t yh a dt h es i m i l a r t r e n d e n c yw i t hg p x ，a n dt h e r ew a sn os i g n i f i c a n tc h a n g ei nt h eg s ta c t i v i t yo f l o w e rc o n c e n t r a t i o ng r o u p s ( 0 1a n d0 2 m g l ) t h e t i m ew h e na n t i o x i d a t e e n z y m e sa c t i v i t y r e a c h e dt h e h i g h v a l u e sw a ss h o r t e rw i t h e x p o s e d c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g i na d d i t i o n ，t h et i m ew h e ng p xa n dc a t a c t i v i t yw a s s i g n i f i c a n t l yi n d u c e dw a se a r l y e rt h a ng s ta n ds o d ，s og p xa n dc a ta r em o r e s e n s i t i v et oo i lp o l l u t i o ns t r e s st h a ng s ta n ds o d a n t i o x i d a n te n z y m e s a r en o t s u i t a b l ea l o n ea sab i o m a r k e ro fo i lp o l l u t i o n ，b e c a u s ec h a n g e si nt h ea c t i v i t yo f t h e ma r ea f f e c t e db ym a n yf a c t o r s s e v e r a la n t i o x i d a n te n z y m e ss h o u l db e c o m b i n e da n di n t e g r a t e dw i t ho t h e ri n d i c a t o r sf o ra n a l y s i s 2 i nt h ei5 - d a yo i le x p o s u r ep e r i o d ，t h ep o da n dl s za c t i v i t yo fl o w e r c o n c e n t r a t i o ng r o u p sh a dt h et r e n do fi n c r e a s e - d e c r e a s ew i t ht i m e ，a n dt h e h i g h e rc o n c e n t r a t i o ng r o u p sh a dt h eo p p o s i t et r e n d t h eg i l ln a + - k + - a t p a s e d e c r e a s e da tf i r s ta n dt h e ni n c r e a s e d g r a d u a l l y t h el i v e rl s za n dg i l l n a + c - a t p a s ea c t i v i t yh a ds i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e sw i t ht h ec o n t r o l g r o u p ， a n dt h el i v e rp o d a c t i v i t yo fg r o u p3 2 m g lw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e do nt h e i l l f o u r t hd a y s ot h el i v e rp o d ，l s z ，g i l ln a + 一k + a t p a s e c a nb e u s e da s b i o c h e m i c a li n d e x e st h a tr e f l e c t et h ea d v e r s i t yp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o no ft h e j u v c n i l cc y n o g l o s s u ss e m i l a e v i si nt h eo i lp o l l u t i o ns t r e s s l i v e rl s za n dg i l l n a + k + a t p a s ea r em o r es e n s i t i v et h a nl i v e rp o d ，a n dm o r e s u i t a b l ea s b i o m a r k e r so fp e t r o l e u mp o l l u t i o n 3 t o x i ce f f e c t so fp o l l u t a n t so no r g a n i s m sh a v eac e r t a i nt h r e s h o l d u n d e r t h i st h r e s h o l dt o x i cr e a c t i o nh a sn o to c c u r r e dt ot h eb o d y ，a n dt h ep h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n sc a nr e t u r nt ot h en o r m a ll e v e lq u i c k l y i fb e y o n dt h i st h r e s h o l d ，t o x i c r e a c t i o n so c c u rt ot h eo r g a n i s m s e v e na f t e rt h el i f t i n go fp o l l u t i o ns t r e s s ，t h e a c t i v i t yo fo r g a n i s m sc a nn o tb er e s t o r e dt on o r m a ll e v e l s f r o mt h er e c o v e r y o f t h ee n z y m e sa c t i v i t yi nj u v e n i l ec y n o g l o s s u ss e m i l a e v i sa f t e rt h el i f t i n go ft h e p e t r o l e u mp o l l u t i o ns t r e s s ，t h ef o l l o w i n g c o n c l u t i o n sc a nb e & a w e d t h e t h r e s h o l do fs h e n g l ic r u d eo i lo nl i v e rc a t , g p xa n dl s zi sb e t w e e n0 2a n d 0 4 m g l t h et h r e h o l do fg s ti s b e t w e e n0 8a n d1 6 m g l ，t h a to fs o di s b e t w e e n1 6a n d3 2m g l ，t h et h r e h o l d so fp o da n dn a + - k + - a t p a s ea r e3 2 m g lo rm o r e 4 t h i sp a p e re s t a b l i s h e dt h ec o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o ni n d e xo fm u l t i p l e b j o m a r k e r sb a s e do nt h ei n t e g r a t e db i o m a r k e rr e s p o n s e s ( i b r ) b e t w e e ni b r v a l u eo fe a c he x p e r i m e n t a lg r o u pa n dt h ee x p o s u r et i m ei sap o s i t i v ec o r r e l a t i o n i nt h ep r e v i o u sp e r i o do fo i le x p o s u r e ，a n di san e g a t i v ec o r r e l a t i o ni nt h el a t e r s t a g e t h e r e i sn oo b v i o u sr u l eb e t w e e n i b rv a l u ea n do i l e x p o s u r e c o n c e n t r a t i o n k e yw o r d s ：s h c n g l ic r u d eo i l ：c y n o g l o s s “ss e m i l a e v i s ；a n t i o x i d a t es y s t e m e n z y m e s ；i m m u n e r e l a t e de n z y m e s ：b i o m a r k e r 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 o 前言 石油污染包括原油和提炼后的成品油，是一种复杂的有机混合物，按其 结构可分为四大类：多环芳香烃、直链和支链烷烃、环烷烃和不饱和烃，其 中芳香烃易溶于水，构成危害水生生物的主要部分。依油的种类和成分不同， 石油及其炼制品对海洋生物体的毒性不同，通常炼制油的毒性高于原油，低 分子烃大于高分子烃，而大分子不溶性组分对生物体的毒性作用具有短期毒 性较小、毒效时间长的特点。石油对水生生物既有急性致死毒性，也有长期 的亚急性和慢性毒性，并有致癌作用。 ， 石油污染物与常规污染物有所不同含有致突变、致癌的多环芳香烃及 其衍生物，会对海洋生物特别是生物幼体造成伤害，也可通过食物链进入人 体不易遭到破坏并且仍保持它的持久性、累积性、迁移性和高毒性，对人 类健康造成潜在威胁。因此科学的评价和预测石油污染对海洋生态系统的影 响，从而采取积极有效的措施以保护渔业资源，已经成为刻不容缓的工作。 国内外许多学者已经就石油污染对海洋生物生理行为的影响进行了广泛深 入的研究，然而由于石油烃类对鱼类较强的毒性和中毒机理的复杂性，不少 研究成果偏重于石油污染对鱼类的急性毒性研究，对深层次的作用机理研究 较少，尤其是石油污染对鱼类的酶的影响。因此为进一步丰富石油污染的理 论研究，为石油污染早期预警机制的建立，本文选择胜利原油对半滑舌鳎的 影响作为试验主要研究内容，探讨各种指标作为石油污染生物标志物的可行 性。 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 1 综述 1 1 海洋石油污染原因 造成海洋石油污染的主要原因【lj 在于： ( 1 ) 海上石油运输频繁使海上溢油事故频繁发生。中国海关统计资料显 示2 0 0 7 年我国进口原油1 6 3 亿吨，已经成为石油消费水平上的第二大国， 增量水平上第一大国，今后我国石油进口量仍将持续增长。 ( 2 ) 港口装卸油作业频繁，油舱的洗舱水、压舱水以及机舱水造成的污 染比较严重。 ( 3 ) 油轮越大，运输成本越低，所以世界上油轮运输规模越来越大。这 就增加了发生重大海上溢油事故的可能性，提高了溢油处理的难度。 ( 4 ) 海上油田由于采油平台的溢油、漏油和采油平台操作排出油污成为 一个石油污染源。 ( 5 ) 沿海城市和内陆生产生活含油污水直接排放或经河流携带入海，废 气中的油被微粒吸收后降雨入海，倾倒含油垃圾废料入海等。 1 2 石油污染对海洋生物的影响概况 1 2 1 石油污染对鱼类的影响 石油对海洋鱼类的中毒作用，通常是通过鳃呼吸、代谢产物、体表渗透 和食物链传输关系逐级积累放大、富集等途径。石油类污染使水体交换不畅， 容易导致水体缺氧，大量油污附于鱼鳃、体表、鳍条上影响鱼的呼吸和运动， 引发鱼的呼吸和运动，引发鱼的鳃部发炎和呼吸障碍，导致鱼类死亡。受石 油污染的鱼类体表和鳃部粘液分泌旺盛，有较多附作物，中毒鱼行动缓慢， 鱼苗易造成弯体畸形。原油可抑制鱼类胚胎的孵化，导致孵化仔鱼的畸形发 育及大量死亡f 2 】。油污对海洋鱼类胚胎及仔鱼的毒性效应为：随油浓度的升 高，孵化率降低，孵化仔鱼死亡率和畸形率升高【3 1 。仔鱼的中毒症状为缺氧 窒息、体表黏膜受损、急躁不安、直至翻转打旋等1 4 j 。 1 2 1 1 急性毒性 石油对黑绸( 2 5 c m ) 的9 6hl c s o 为2 3 4 m g l ，对鳍鱼( 3 1 c m ) 的4 8hl c s o 为7 8m g l 【5 1 。0 号柴油分散液对黄黑鲷( s m a c r o c e p h a l u s ) 、鳍鲷( s g a r 甜s 2 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 l a t u s ) 、前鳞鲻( m u g i lo p u y s e n i ) 和七星鲈( l a t e o l a b r a xj a p o n i c u s ) 的9 6hl c s o 值范围分别为0 1 7 0 9 5 和0 2 8 3 4 7m g l ；2 0 号柴油对这四种鱼仔的9 6h l c 5 0 值范围为1 7 1 - 3 0 2 和3 1 6 8 5 1m g l ；南海原油则为2 4 0 - 4 0 9 和 5 9 9 1 2 m g l 引。沈盎绿等【6 】研究了不同浓度的柴油处理液对斑马鱼死亡 率、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的影响，结果表明3 8 0 号柴油处理对斑马 鱼的9 6 h 半致死浓度为4 5 0m g l 一。田丽粉等【7 】研究了胜利原油对褐牙鲆仔 稚鱼的急性毒性和对肝脏碱性磷酸酶的影响，试验结果表明胜利原油对褐牙 鲆仔鱼的9 6 hl c s o 为1 1 9 4 - 4 1 5m g l 一，对稚鱼的9 6 hl c 5 0 为7 8 7 1 1 8 6 m g l 。 1 2 1 2 慢性毒性 张景飞等【8 】研究了低浓度柴油的长期曝污( 4 0 d ) 对鲫鱼幼体肝脏抗氧 化系统的影响，结果表明油浓度为为0 0 0 5m g l 时鱼体肝脏超氧化物歧化 酶即被显著诱导，而当曝污浓度达到0 0 1m g l 时过氧化氢酶活性、谷胱甘 肽过氧化物酶活性和还原型谷胱甘肽含量表现出明显诱导作用，谷胱甘肽转 硫酶活则表现为被抑制。刘发义1 9 】等人报道了胜利原油对梭鱼肝脏混合功能 氧化酶中芳烃羟化酶a h h 活性的影响，结果表明海水原油浓度与a h h 活 性诱导成正比。沈弦等人i lo 】研究表明石油污染既能提高非洲鲫鱼血清总蛋 白和球蛋白含量，又能降低血清白蛋白含量和白蛋白球蛋白的比值，油对 非洲鲫鱼血清蛋白产生作用的浓度阈值为0 0 5m g l 。他们又【l l 】通过分析莫 桑比克罗非鱼( t i l a p i am o s s a m b i c a ) 血清酶活性的变化，研究石油对鱼类 的致毒作用，表明石油污染能升高血清谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和碱性磷酸 酶活性，石油对莫桑比克罗非鱼血清酶活性产生作用的浓度阈值为o 0 5 m g l 。b o e s e 等【1 2 】发现精炼石油废水可使l o p t o c o t t u s a r m a t u s 鳃 n a + k + a t p a s e 的活性下降。 1 2 2 石油污染对浮游生物的影响 1 2 2 1 对浮游植物的影响 石油烃污染物对海洋浮游植物生长可以为促进作用，也可为抑制作用， 这与石油烃浓度和组成，以及浮游植物种类有关【1 3 ，1 4 1 。邵涛【1 5 1 研究表明在 含油的生态系统中油能刺激藻类的生长，油污染过的水体中原油中的轻烃和 较易挥发组分对藻类的毒性影响最大，原油泄露的短期毒性影响和二次影响 同等重要，油对藻类种群结构也具有重要的毒性影响。张蕾等【1 6 j 研究了0 号柴油石油烃污染物对6 种海洋浮游植物生长的影响，结果表明，高浓度石 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 油烃污染物( 1 0 5 m g l ) 对裸甲藻( g y m n o d i n i u m ) 、小球藻( c h l o r e l l a s p ) 、 新月菱形藻( n i t c l o s t e r i u m ) 、亚心形扁藻( p l a t y m o n a s s u b c o r d i f o r m i s ) 的生长有抑制作用，石油烃污染物浓度在高于1 9 6m g l 时对中肋骨条藻 ( 瓢p c o s t a t u m ) 有抑制作用，低浓度石油烃污染物易促进赤潮藻类( 裸 甲藻，新月菱形藻，中肋骨条藻) 的生长。黄逸君等【l7 j 研究了石油烃污染 对海洋浮游植物群落的短期毒性效应，通过测定不同浓度原油水溶性成分 ( w a f ) 胁迫下浮游植物群落各种类的细胞密度，发现原油w a f 对浮游群 落的种类数、多样性、均匀度和优势种组成及优势度均有极显著影响，原油 污染组的种类数均低于对照组，多样性也基本上低于对照组，但均匀度无明 显规律，不同浮游植物种类对石油污染的耐受性不同，导致石油污染后浮游 植物群落的异常演替，在原油胁迫下，细胞个体较小的种类，如中肋骨条藻 ( s k e c o s t a t u m ) 、长菱形藻、念珠直链藻( m e l o s i r am o n i l i f o r m i s a g a r d h ) 和微小原甲藻( p r o r o c e n t r u mm i n i m u m ) 等逐渐取代细胞个体较大的种类， 如活动盒形藻( b i d d u l p h i am o b i l i e n s i sb a i l e y ) 、布氏双尾藻( d i t y l u m b r i g h t w e l l i i ( w e s og r u n o w ) 和斜纹藻( p l e u r o s i g m ae l o n g a t u m ) 等，导致浮 游植物的群落组成有明显的小型化趋势。 在海洋生态系统中，浮游植物作为最主要的初级生产者，在海洋生物链 中有着举足轻重的地位，石油污染使海面被油膜覆盖，影响浮游植物的光和 作用，阻断了水体与大气的气体交换，浮游植物又是海洋中甚至整个地球上 氧气的主要供应者( 占7 0 左右) ，海洋产氧量减少，最终导致海洋生态平 衡的失调i l 引。 1 2 2 2 对浮游动物的影响 浮游生物分布的垂直分布深度与光照深度成正比，有不少浮游甲克动物 如磷虾到了生殖季节经常上升至表层进行产卵，中华哲水蚤( c a l a m u s s i n i c u s ) 在7 月上旬生殖季节，在中午前后大量停留在表层，而石油污染改 变了海洋的光照，进而影响到浮游生物的垂直分布，可能改变其种群在空间 上的数量变动【1 8 】。乌克兰南海海洋研究所在日全蚀这种特殊条件下，对浮 游动物的运动进行跟踪观察范们发现当天色明显变暗以后，许多浮游动物如 小虾会错把白天视为夜幕降临，本能的从海水深处游向表层。被石油薄膜大 面积覆盖着的海域，浮游小虾会不分昼夜的滞留于海水表层。另外，路鸿燕 等【1 9 1 研究了大庆原油、直馏柴油、蒸发汽油、航空煤油对蒙古裸腹潘( m o i n a m o n g o l i c ad a d a y ) 的存活、生长、生殖及内禀生长率毒性影响，得出这四种 油类及其混合油对该潘4 8 hl c 5 0 分别为9 8 9 、7 1 7 、3 5 2 、3 4 8 、7 0 2m g l 。 4 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 徐汉光等2 0 1 报道大庆原油、直馏柴油、7 0 号汽油、航空煤油对中华哲水蚤 的4 8 hl c s o 分别为1 9 8 、15 8 、6 1 、3 5m g l ，可见蒙古裸腹潘对油的敏感 性大于中华哲水蚤。 1 2 3 石油污染对底栖生物的影响 陈荣等【2 l 】研究牡蛎全组织石油烃含量与其消化腺、鳃超氧化物歧化酶 s o d 、过氧化氢酶c a t 活性之间的关系，结果表明s o d 、c a t 活性均高于 鳃，牡蛎消化腺和鳃s o d 、c a t 活性均随石油烃含量的增加而增强。孙福 红等【2 2 】研究结果表明石油烃对沙蚕表现出较强的毒性，暴露3 d 后，其l d 5 0 为l1 7 5 此l 一。a n d e r s o n 等【2 3 j 和t a t e m 等【3 4 】将仔虾置于2 号燃料油、4 号 燃料油和原油溶液中，发现它们毒性大小顺序为：2 号燃料油 4 号燃料油 原油，即轻质燃料油 重质燃料油 原油。贾晓平、林钦等1 2 5 】测定了南 海原油、0 号柴油和2 0 号柴油对仔虾的毒性大小顺序为0 号柴油 2 0 号柴 油 南海原油，对三种贝类的毒性大小顺序为o 号柴油 南海原油，油类分 散液毒性大于水溶性组分，在曝油的3 种仔虾中，刀额新对虾 ( m e t a p w n a e u s e n s i s ) 对0 号柴油和2 0 号柴油耐受力最弱，而日本对虾 ( p e n a e u s a p o n i c u s ) 对南海原油最为敏感，贝类对0 号柴油和南海原油的 耐受力顺序为：文蛤 波纹巴菲蛤 毛蚶 翡翠贻贝，三类受试生物中对油 类的耐受力顺序为：贝类 鱼类 虾类。唐峰华等【2 6 】研究表明燃料油普遍 比原油的毒性效应大，相同生长阶段，抗油毒害性蟹类比虾类抗油毒害性强， 中国明对虾 日本囊对虾，锯缘青蟹 三疣梭子蟹。 1 3 水产动物相关酶研究概况 1 3 1 超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是主要分布于于胞浆 和线粒体的基质中的一类金属酶，能催化超氧阴离子发生歧化反应，是机体 防御过氧化损害系统的一种关键酶之一，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至 关重要的作用。s o d 的基本功能是清除生物体内过高浓度的超氧离子自由基 0 2 ，减轻自由基对细胞的氧化损伤。当污染物进入生物体进行生物转化 时，会生成大量的活性氧使d n a 断裂、蛋白质变性、酶失活等，引起机体 氧化应激反应，s o d 在这些活性氧产生及转化中起着非常重要的作用1 2 7 1 ， 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 s o d 是唯一可以以自由基为底物和催化0 2 。发生歧化反应( 2 h + + 20 2 一h 2 0 2 ) 的酶2 引。余群等【2 9 1 研究了在试验生态条件下不同浓度可溶性0 号 柴油的暴露对真鲷( p a g r o s o m u s m a j o r ) 幼鱼内脏组织超氧化岐化酶s o d 活 性的影响，结果表明：s o d 酶活性对于油污染胁迫呈现出剂量诱导效应关 系，在一定剂量浓度作用下，延长暴露时间，能诱导鱼体内s o d 酶活性。 1 3 2 过氧化氢酶 过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 是一种含f e 的血蛋白酶类，在生物体的 抗氧化防御系统中占有重要地位，可与谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 等一起， 清除s o d 歧化超氧阴离子自由基( 0 2 ) 产生的过氧化氢( h 2 0 2 ) 。余群等【2 9 1 研 究表明在试验生态条件下延长暴露时间不同浓度可溶性0 号柴油对对真鲷 ( p a g r o s o m u sm a j o r ) 幼鱼内脏组织过氧化氢酶c a t 活性有抑制作用。 1 3 3 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g p x ) 作为抗氧化防御 系统主要的酶性成分之一，能与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶一起将活性氧 自由基0 2 和h 2 0 2 还原为h 2 0 ，保护细胞免受活性氧自由基的伤害，它特异 的催化还原型谷胱甘肽( g s h ) 对过氧化氢的反应可以起到保护细胞膜结构 和功能完整的作用，有研究表明某些外源有机物会激发鱼类内脏组织g p x 活性的升高或降低l 如刁引。 1 3 4 谷胱甘肽转硫酶 谷胱甘肽转硫酶( g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e ，g s t ) 以同工酶的形式广 泛存在于动植物体内，是解毒系统第2 阶段的解毒酶，可催化g s h 与亲电 中间代谢物的结合，减少这些化合物与细胞内生物大分子如d n a 等结合的 可能性，还可清除脂类过氧化物，从而减轻d n a 的损伤程度，从而解除内 源性或外源性毒物的毒性，在解毒系统中起到了重要作用【3 毛3 4 】，具有清除 体内过氧化物和解毒双重功能，当肝脏受损时，g s t 常常很早释放到血中， 因而g s t 的升高可作为肝脏损伤的敏感指标。 6 i 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 1 3 5 过氧化物酶 过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，简称p o d ) 普遍存在于动物、植物及微生物中， 是生物体中重要的酶类之一，参与多种生理代谢反应1 3 引，主要催化分解生 物体内的氧化物和过氧化物0 6 】，对细胞生理代谢过程中产生的活性氧具有 清除作用，能减少自由基对正常细胞的损伤，从而提高机体的解毒免疫功能 和防病抗病能力，可以作为一种免疫指标来进行检测1 37 1 。贾秀英等【3 8 1 研究 表明受水中一定浓度的镉的影响，鲫鱼肾脏、肝胰脏、鳃组织的p o d 活性 显著增强，由此认为p o d 也可作为反映鱼类逆境生理的一个生化指标。 1 3 6 溶菌酶 溶茵酶( 1 y s o z y m e ，l s z ) 是一种碱性蛋白，广泛存在于动物、植物和 微生物的各种组织、体液和分泌物中，主要源于吞噬细胞，它与过氧化物酶 及磷酸酶、糖酵解酶等各种水解酶类组成溶酶体系，破坏和消除侵入体内的 异物，从而担负起机体的防御机能【”】，是生物体极为重要的非特异性免疫 因子之一【4 0 ，4 。作为鱼类非特异性免疫物质之一，溶菌酶在鱼体抵抗感染 性致病菌的最前沿防御机制中有重要作用【4 2 】。 刘占才等【4 3 j 研究表明汞对草鱼血清和肾脏溶菌酶活性有剂量效应关系 和h o r m e n s i s 现象，h o r m e n s i s 现象是指潜在低水平有毒物质所产生的刺激 效应，所引起的剂量效应曲线呈抛物线形式【“】。高春生等1 4 5 】研究了不同浓 度水体铜对黄河鲤的连续刺激，发现低质量浓度的c u 2 + ( 0 0 1m g l 、0 0 5 m g l ) 能显著增加黄河鲤溶菌酶的活性( p 0 0 5 ) ，而较高质量浓度的c u 2 + ( o 1 0m g l 、0 3 0m g l 、o 5 0m g l 、0 7 0m g l 和1 0 0m g l ) 能显著降低 黄河鲤溶菌酶的活性( p 0 0 5 ) 。 1 3 7n a + k + a t p a s e n a + - k + - a t p a s e 是组成n a + k + 泵活性的主要部分，在机体中起到至关重 要的作用，并且是多种毒物攻击的靶点h 引，在低等、高等水生生物体内普遍 存在，具有广泛的生态意义。此外，由于它是膜的组成成份，以膜上其它蛋 白、磷脂等成分为作用靶点的毒物也会间接地影响n a + k + a t p a s e 的活性 h 7 】。从分子生态毒理学的角度来看，n a + - k + - a t p a s e 可以广泛作为一项用于 评价污染压力的参数，是具有通用性和直接性的指标 4 8 , 4 9 l 。大多数水体中石 7 j 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 油的浓度往往达不到引起鱼类死亡的程度，而长时间低浓度石油污染对鱼类 的神经系统、呼吸系统以及生殖系统都有一定的影响5 0 1 。b o e s e 等1 1 9 1 发现精 炼石油废水可使l o p t o c o t t u s a r m a t u s 鳃n a + - k + - a t p a s e 的活性下降。 1 4 生物标志物概述 1 4 1 生物标志物 生物标志物由于能利用生物体组织及酶分子水平上的早期反应，从而对 水体中痕量有机、重金属污染物质进行预警，目前已经引起人们广泛的关注 【”】。1 9 8 7 年美国国家科学院国家研究委员会确定生物标志物的定义为“生 物学体系或样品的信息指示剂( i n d i c a t o r ss i g n a l i n ge v e n t si nb i o l o g i c a l s y s t e m so rs a m p l e s ) 刀1 5 2 】。g o k s e r 等【5 3 】认为生物标志物是生物体暴露于亚 致死量下的有毒化合物而发生异常变化的信号指标，可以特异性地检测环境 中致癌、致畸、致突变化合物并为环境质量退化提供早期警报。 1 4 2 生物标志物研究进展 利用生物标志物进行环境污染进行监测有几个方面的优越性：时间跨度 大，能够检测污染物真实和复杂的作用；能够表征特定化合物的生物效应， 比只是对污染物的环境水平进行定量有实际意义；对有关单个化合物或混合 物在复杂环境中的毒性具有早期预警的作用，有利于制定预防管理措施，从 而避免或减轻污染损害。 ( 1 ) 一般代谢酶 乙酞胆碱酶是一个很经典的毒理指标，多年来，这项毒理指标一直为生 态毒理学研究所采用。五十年代末，就有学者提出用鱼脑或无脊椎动物的乙 酞胆碱酯酶( a c h e ) 活性抑制程度对自然水环境中极低浓度的有机磷杀虫剂 进行检测，这个方法随即为国内许多学者接受，国内这方面曾有报道【2 7 。， 三磷酸腺苷酶( a t p a s e ) 存在于所有的细胞中，具有广泛的生态意义，在 机体中起着至关重要的作用，许多实验证明，n a + k + - a t p a s e 对环境中存在 的多种有毒物质敏感，并且已有研究表明毒物对n a + 1 0 a t p a s e 抑制的浓 度、时间依赖性【4 7 1 。研究发现多种水生生物包括鱼、虾、龟、乌贼、水生 昆虫等及鱼的多种组织如鳃、肾、脑的多种a t p a s e 对如有机氯农药、多氯 联苯、金属、炼油废水等不同污染物均有反应1 5 4 , 5 5 】。从分子毒理学角度看， 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 a t p a s c 至今仍是一项评价污染压力的重要参数【5 6 ，5 7 1 。 ( 2 ) 解毒系统 异生物质进入生物体后，通常会在代谢系统作用下发生两相反应。外源 物的i 相代谢包括氧化、还原和水解，是脱去或加上活性功能基团的过程【5 8 】。 对于大多数外源化合物，i 相反应是由混合功能氧化酶m f o 催化的。细胞 色素p 4 5 0 酶( c y p 4 5 0 ) 系对许多内源性和外源性的化学物质，尤其对环境 有害化学物质存在有氧氧化代谢作用以实现机体的解毒。c y p 4 5 0 总含量、 c y p i a 含量【5 9 ，6 们、脱乙基酶e r o d 6 0 ，6 1 1 、乙氧基香豆素脱乙基酶 ( e t h o x y c o u m a r i n o - d e e t h y l a s e ，e c o d ) 6 2 】和芳烃羟化酶( a r y lh y d r o c a r b o n h y d r o x y l a s e ，a h h ) 活性【6 3 1 ，细胞色素b 5 ( c y tb 5 ) 6 4 1 等都是常用的i 相酶生物 标志物。还有的研究表明底栖鱼的e r o d 诱导比其它的鱼要敏感，这提示 人们对易在沉积物中积累的亲脂性化合物进行监测时，用底栖鱼作为材料可 提高方法的灵敏度【2 7 1 。 i i 相反应就是外源化合物母体或者其代谢产物与内源配体的结合过程。 主要的i i 相酶催化这些结合反应，通过添加更极性的基团( 如：g s h ) 使外源 物更容易排出体外【6 5 】。同时i i 相酶在维持机体稳态和外源物的清除中扮演 重要角色。g s h ，g s t 和u d p 一葡糖醛酸基转移酶( u d p o t ) 是目前研究较 多的i i 相系统生物标志物【7 6 ，7 7 , 8 0 】 ( 3 ) 氧化胁迫参数 许多外源性化学物质是通过产生大量的活性氧，导致生物体的氧化损伤 作用，从而对机体诱发多种损害，而这种损伤作用对生物体内起抗氧化作用 的酶有诱导作用，因此我们可以用抗氧化系统成份来检测污染物的早期影 响。抗氧化防御系统，包含一系列的抗氧化酶：水溶性组份如谷胧甘肤 ( g s h ) ，维生素c ；脂溶性成分，如维生素e ，b 胡萝卜素；酶如谷胱甘肽 过氧化物酶( g p x ) ，超氧化物歧化酶( s o d ) ，过氧化氢酶( c a t ) 等【6 ，8 - 孙6 引。 但是抗氧化酶的活性会受到自然环境的诸多影响，例如季节变化、温度、氧 含量及生活阶段等，环境条件的微小差异都可能导致酶活性的变化，因而就 不难理解将抗氧化酶作为生物标志物时得到的结论有时并不统一【6 9 】。因此 当选用这些酶作为石油烃污染早期预警的标志物时，应该综合考虑几种酶的 研究结果。目前研究发现，暴露于可产生氧化还原循环的物质后，脂质过氧 化( 1 i p i dp e r o o x i d a t i o n ，l p o ) 也能证明污染物氧化性损伤的作用，脂质过 氧化程度常以机体( 肝组织，全血等) 中l p o 降解产物m d a ( m a l o n d i a l d e h y d e ， 丙二醛) 浓度来表示，机体中m d a 浓度越高，机体所受的脂质过氧化程度越 生物标志物法研究石油胁迫对半滑舌鳎的毒性效应 高。林建清等1 7 0 1 研究表明多环芳烃暴露导致鲈鱼肝的m d a 浓度升高，而且 m d a 浓度与水环境的多环芳烃暴露浓度呈良好的正相关关系。 ( 4 ) 免疫参数 目前对鱼类免疫学的认识程度远远低于哺乳类。象哺乳类一样，鱼类的 免疫学生物标志物也被认为会有广阔的应用前景1 7 l 】。鱼类免疫分为特异性 免疫和非特异性免疫，微生物入侵和有毒物质存在时非特异免疫可立即发生 作用，有效清除降解病原微生物和有害物质，是鱼类抵抗感染的第一道防线 【7 2 ，7 3 1 。作为鱼类非特异性免疫的重要组成部分，白细胞的数量可直接反映 鱼类非特异性免疫能力的高低。白细胞和淋巴细胞状态，非特异性防御因子 ( 如：溶菌酶活性) ，免疫器官重量和巨噬细胞功能等都正在被广泛而深入地研 究7 1 ，7 1 。 ( 5 ) d n a 加和物 多环芳烃、芳基胺有机污染物被生物体吸收后，其代谢产物与d n a 共 价结合形成d n a 加和物，引起d n a 结构的改变，是生物体吸收、代谢外 源物质和大分子修复等过程的综合结果1 7 5 1 。d n a 加和物适合作为水环境中 有机污染物暴露和危害效应的生物标志物【7 6 ，7 7 1 。目前d n a 加和物的主要测 定方法有：3 2 p 后标记法、免疫法、免疫毛细管电泳激光诱导荧光法、液相 色谱串联质谱法。 1 5 本文研究目的、意义及内容 1 5 1 研究目的和意义 2 l 世纪是“海洋的世纪”，如何有效地保护海洋环境，维护近海海域生 态平衡己成为各国制定本国可持续发展战略的重要组成部分。引起海洋污染 的途径很多，其中海洋溢油被认为是最严重、最广泛的海洋污染类型之一。 溢油事故对海洋生物乃至对海洋生态系统的影响不仅是海洋污染生物学的 一个研究重点，而且是评估溢油事故对环境与生态损害程度的一项重要内 容。污染的生物响应研究是海洋环境保护中的主要内容之一，而海洋生物对 溢