（发酵工程专业论文）菌株sfgi1产赤霉素发酵条件的研究.pdf

， ， j d e s n t g s o d p o d c a t a d i e t h y ls u l f a t e n i t r o s o g u a n i d i n e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e p e r o x i d a s e c a t a l a s e a b s o r p t i o nv a l u e s 明 ，。 k 专 ， o 一 ， k i 目录 1 ：； ! ； 5 1 1 1 赤霉素的发现与命名5 1 1 2 赤霉素的结构与性质。5 1 2 赤霉素的合成途径7 1 2 1g g d p 的合成7 1 2 2g g d p 转化为g a l 2 醛7 1 2 3g a l 2 醛转变为其它种类的g a 8 1 3 发酵法生产赤霉素的研究进展9 1 3 1 赤霉素生产菌种9 1 3 2 赤霉素的发酵方式1 1 1 3 3 影响赤霉素合成的主要因素1 2 1 4 赤霉素的提取技术1 5 1 4 1 溶剂萃取法15 1 4 2 活性炭吸附法1 5 1 4 3 树脂吸附法1 6 1 4 4 离子交换法1 6 1 4 5 膜分离法1 7 1 5 赤霉素的应用1 7 1 5 1 赤霉素在农业生产中的应用1 7 1 5 2 赤霉素在啤酒工业上的应用18 1 5 3 赤霉素在果蔬保鲜方面的应用1 8 1 6 本课题的立题背景及研究意义1 9 1 7 本课题的主要研究内容19 1 7 1 赤霉素液体发酵条件的优化1 9 1 7 2 赤霉素固体发酵的研究2 0 1 7 3 赤霉素的提取工艺的研究2 0 2 材料与方法。2 1 2 1 实验材料。2 1 2 1 1 菌种21 2 1 2 培养基2 1 2 1 3 主要仪器及设备2 1 2 1 4 主要试剂：2 2 2 2 实验方法2 3 2 2 1 发酵液中赤霉素的定性鉴定2 3 2 2 2 液化淀粉的制备方法2 3 2 2 3 分析方法2 4 3 结果与分析。2 7 3 1 赤霉素检测方法的确立2 7 3 1 1 溶剂的蒸干方式2 7 3 1 2 福林试剂及盐酸用量的确定2 8 3 1 3 显色时间2 8 3 1 4 显色溶液的稳定性2 9 3 1 5 与液相色谱法检测结果的比较2 9 3 1 6 小结：3 0 3 2 发酵液中赤霉素的定性鉴定3 0 3 3 赤霉素在发酵液中的存在位置3l 3 4 液体发酵培养基的初步确定。3 l 3 5 液体发酵培养基的优化3 2 3 5 1 碳源对菌株s f g i 1 产赤霉素的影响3 2 3 5 2 氮源对菌株产赤霉素的影响3 3 3 5 3 无机盐对菌株产赤霉素的影响3 6 3 5 4 其它营养因子对菌株产赤霉素的影响3 8 3 5 5 小结4 0 3 6 培养条件对菌株液体发酵产赤霉素的影响4 0 3 6 1 接种量对菌株产赤霉素的影响4 0 3 6 2 发酵温度对菌株产赤霉素的影响4 l l l a p b l 3 6 3 溶氧对菌株产赤霉素的影响4 2 3 6 4 初始p h 对菌株产赤霉素的影响4 2 3 6 5 菌株s f g i 1 的发酵进程曲线4 3 3 7 固体发酵生产赤霉素的研究4 4 3 7 1 培养时间对赤霉素产量的影响4 4 3 7 2 固液比对发酵效价的影响4 5 3 7 3 碳源对发酵效价的影响4 6 3 7 4 氮源对发酵效价的影响4 6 3 7 5 大米培养基中的固体发酵4 7 3 7 6 小结。4 8 3 8 赤霉素提取工艺的研究4 8 3 8 1 液体发酵产品的提取4 8 3 8 2 固体发酵产物中赤霉素的提取5 2 3 8 3 小结5 4 4 讨论5 5 4 1 培养基中添加前体物质对赤霉素发酵的影响5 5 4 2 赤霉素的提取方法。：5 5 5 结论：5 6 5 1 赤霉素的测定方法5 6 5 2 液体发酵培养条件的优化5 6 5 3 赤霉素固体发酵的研究5 6 5 4 赤霉素的最佳提取条件5 6 参考文献5 8 致谢6 6 攻读学位期间发表论文目录6 7 i i i 鼻 f 曲 一 i k 山东农业大学硕士学位论文 摘要 赤霉素( g i b b e e r l l i n s ) 作为一类天然的植物生长调节剂，在农业生 产中有着广泛的应用。目前，市场上的赤霉素产品主要是以藤仓赤霉菌 发酵生产的。因此对霉菌发酵生产赤霉素的工艺技术进行深入研究具有 重要意义。提高赤霉素的产量一般从两方面着手：通过改良菌株或优化 培养条件提高赤霉素的发酵效价：改良提取工艺，最大化的从产物中提 取赤霉素。本文就实验室保藏的一株赤霉菌s f g i 1 的发酵情况以及发酵 培养物中赤霉素的提取进行了研究，主要研究结果如下： 通过试验确定了菌株s f g i l 产赤霉素的最佳培养基组成和培养条 件。较佳培养基组成：淀粉l o o g l ，花生饼粉1 5 9 l ，豆粕粉3 9 l ，硫 酸镁0 7 5 9 l ，磷酸二氢钾l g l 。发酵培养基中加入0 2 9 l 的氯化钻， 0 s g l 的柠檬酸盐会对赤霉素合成起促进作用。较佳培养条件为：初始 p h 5 5 ，发酵温度3 0 ，摇床转速1 8 0 r m i n ，装液量3 5 m l 2 5 0 m l ，接种 量5 。菌株s f 伍1 在最佳培养基和较优培养条件下培养，发酵液中赤 霉素含量最高可达1 4 2 4 m g l ，发酵效价约为优化前的5 6 倍。 对菌株s f g i 1 的固体发酵情况进行了研究，确定了两种较合适的固 体发酵培养基：( 1 ) 麸皮5 0 ，玉米面5 0 ，磷酸二氢钾o 1 ，硫酸镁 o 1 ，葡萄糖1 。3 0 下，菌株在此培养基中培养1 2 天，赤霉素发酵 效价( 干基) 可达6 3 5 8 m g k g 。( 2 ) 大米培养基：大米，4 花生饼粉， 磷酸二氢钾0 1 ，硫酸镁o 1 。3 0 下，菌株在此培养基中培养1 2 天， 赤霉素发酵效价( 干基) 可达7 9 8 2 m g k g 。 对培养物中赤霉素的提取条件进行了研究。确定了固体发酵培养物 中赤霉素提取的最适条件为：用水浸泡提取固体培养中的赤霉素，加水 比例为1 ：6 ，提取时间为5 小时。液体发酵培养液中赤霉素的提取选用 溶剂萃取法，确定了酸化过滤、硅藻土助滤、活性炭脱色等操作以及乙 酸乙酯萃取的较适条件为：p h 2 0 ，提取温度为3 0 ，乙酸乙酯分两次 萃取，总用量为发酵液体积的2 倍。利用此法提取赤霉素的回收率最高 达7 5 8 。 本课题对菌株s f 伍1 发酵产赤霉素的条件进行了优化，并确定了培 壁蔓翌业查苎耋垄壁垒丝堕婴窒 养物中赤霉素提取的条件，为进一步研究赤霉素生产奠定了基础。 体发酵，固体发酵，提取 2 k f o ro p t i m i z i n gc u l t u r e c o n d i t i o n s ；m a x i m i z i n ge x t r a c t i o ne f f i c i e n c yo f g i b b e r e l l i n sb y 删u s t i n ge x t r a c t i n gp r o c e s s i nt h i sp a p e r , w es t u d i e dt h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fg i b b e r e l l af u j i k u r o is f g i - 1p r e s e r v a t e db yo u r l a b o r a t o r ya n dt h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n so fg i b b e r e l l i n s 耽em a i nr e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： t h ec u l t u r em e d i u ma n dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i n s f g i 1 p r o d u c i n gg i b b e r e l l i n sw e r eo p t i m i z e db yt h ee x p e r i m e n t 1 1 1 e o p t i m u mc u l t u r em e d i u mw a s ：10 0 9 ls t a r c h ，15 # lp e a n u tm e a l ，3 9 l s o y b e a nm e a l ，o 7 5 9 lm a g n e s i u ms u l f a t e ，lg lp o t a s s i u m d i h y d r o g e n p h o s p h a t e a d d i n g0 2 9 lc o b a l tc h l o r i d ea n do 5 9 lc i t r a t ei n t oc u l t u r e m e d i u mb e n e f i t e dt og i b b e r e l l i n ss y n t h e s i s n es u i t a b l ec u l t u r ec o n d i t i o n s w e r ea sf o l l o w s ：i n i t i a lp h5 5 ，t e m p e r a t u r e3 0 。c ，r o t a t i o ns p e e do fr o c k i n g b e d18 0 r m i n , b r o t h sv o l u m ei ns h a k ef l a s k3 5 m l 2 5 0 m l ，i n o c u l a t i o n a m o u n t5 u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n , t h ep r o d u c t i o no fg i b b e r e l l i n s a c h i e v e d1 4 2 4 m g l ，i tw a s5 6t i m e sm o l et h a nt h ev a l u et ot h ei n i t i a l t h es o l i df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o mo ft h es t r a i ns f g i 1w e r es t u d i e d t w om o r es u i t a b l es o l i df e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u mw e r ed e t e r m i n e d ：( 1 ) 5 0 w h e a tb r a n , 5 0 c o mm e a l ，0 1 p o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t e ， 0 1 m a g n e s i u ms u l f a t e ，1 g l u c o s e 1 1 1 ep r o d u c t i o no fg i b b e r e l l i n sw a s 6 3 5 8 m g k gb yc u l t i v a t i n gt w e l v ed a y si nt h i sc u l t u r em e d i u mu n d e r3 0 ( 2 ) r i c em e d i u m ：r i c e ，4 p e a n u tm e a l ，o 1 p o t a s s i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e ，o 1 m a g n e s i u ms u l f a t e t h ep r o d u c t i o no fg i b b e r e l l i n sr e a c h e d 7 9 8 2 m g k gb yc u l t i v a t i n gt w e l v ed a y si nt h i sc u l t u r em e d i u mu n d e r3 0 3 菌株s f g i - i 产赤霉素发酵条件的研究 t h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n so fg i b b e r e l l i n sf r o mc u l t u r ew e r es t u d i e d t h e a p p r o p r i a t ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n so fg i b b e r e l l i n sf r o ms o l i dc u l t u r ew e r ea s f o l l o w s ：s o l i dc u l t u r ew a sd o u s e db yw a t e ri no r d e rt oe x t r a c tg i b b e r e l l i n s ， t h ew a t e ra d d i n gp r o p o r t i o nw a sl ：6 ，t h ee x t r a c t i o nt i m ew a s5h o u r s n e e x t r a c t i o no fg i b b e r e l l i n sf r o mf e r m e n t a t i o nb r o t ha d o p t e ds o l v e n te x t r a c t i o n i tm a i n l yc o n t a i n e da c i d i z i n gf i l t r a t i o n ，d i a t o m i t ea i df i l t r a t i o n ，a c t i v a t e d c a r b o nd e c o l o r i z i n g ，e x t r a c t i n gw i t he t h y la c e t a t e t h es u i t a b l ec o n d i t i o n so f e x t r a c t i n gw i 也e t h y la c e t a t ew a s ：p h 2 0 ，e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r ew a s3 0 ， t h ee t h y la c e t a t ee x t r a c t i n gt i m ew a st w ot i m e s ，t h ea m o u n to fe t h y la c e t a t e f o ro n et i m ew a se q u a lt oa m o u n to ff e r m e n t a t i o nb r o t h 1 1 1 er e c o v e r yr a t i o o f g i b b e r e l l i n sb y t h em e t h o da c h i e v e d7 5 8 i nt h i st h e s i s t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i ns f g i 1 p r o d u c i n gg i b b e r e l l i n sw e r eo p t i m i z e da n dt h ee x t r a c t i o n c o n d i t i o n so f g i b b e r e l l i n sf r o mc u l t u r ew e r ed e t e r m i n e d i tl a i da f o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e r s t u d yo fg a sp r o d u c t i o n k e y w o r d s ：g i b b e r e l l af u f i k u r o i , g i b b e r e l l i n s ，l i q u i df e r m e n t a t i o n ，s o l i d f e r m e n t a t i o n ，e x t r a c t i o n 4 ， f 曲 k ， 零，是一种天然的植 以调节植物生根、发 在农作物生产及蔬菜 种植中有着广泛应用。虽然植物在生长过程中可在茎和花蕾部位产生部 分赤霉素，但其产量很低，目前农业上应用的赤霉素主要是利用微生物 特别是藤仓赤霉菌发酵生产的。 1 1 1 赤霉素的发现与命名 赤霉素是由日本植物病理学家在研究水稻恶苗病时发现的。1 0 0 多 年前，日本水稻田中出现了稻苗疯长、不结穗的现象，当时被称为“恶 苗病 ；1 8 9 8 年，h o r i 最早指出这种异常徒长现象起因于真菌病害：1 9 1 2 年，s a w a d a 进一步提出这种病症是由所感染的真菌分泌的一种物质引起 的；1 9 3 0 年，k u r o s a w a 由稻株分离得到多种赤霉菌，都能产生某种能 够促进植物生长的水溶性化合物：1 9 3 4 年，t e i j 的y a b u t a 等从水稻恶苗 病菌的发酵滤液中分离获得有效成分的非结晶体，发现该成分能促进水 稻的徒长，并于1 9 3 8 年正式命名为赤霉素( g i b b e r e l l i n ) ；2 0 世纪5 0 年 代初，英、美科学家从真菌培养液中获得了这种物质的化学纯产品，英 国科学家称之为赤霉酸( g i b b e r e l l i ea c i d ) ，美国科学家称之为赤霉素x ， 后来证明赤霉酸和赤霉素x 为同一物质，都是g a 3 ：1 9 5 5 年，日本东京 大学的科学家对他们的赤霉素a 进行了进一步的纯化，从中分离出了三 种赤霉素，即赤霉素a l ( g a i ) 、赤霉素a 2 ( g a 2 ) 和赤霉素a 3 ( g a 3 ) 。 此后，新的赤霉素成分不断被发现，到目前鉴定的赤霉素种类已达到1 3 6 种( u b 6 n 等，2 0 0 4 ) 。赤霉素通常以其发现的先后顺序依次命名为 g a l g a n 。其中，g a 3 ( 赤霉酸) 的活性较高，分布也较广，因此常 被作为赤霉素的代表物。 1 1 2 赤霉素的结构与性质 赤霉素是一类环状双萜化合物的总称，其基本骨架为赤霉烷环，由 四个异戊二烯单位组成，有四个环，其化学结构如图1 1 。 5 菌株s f g i 1 产赤霉素发酵条件的研究 图1 i 赤霉烷环的结构 f i g 1 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fg i b b e r e l l i ca l k y lr i n g 赤霉素的结构与其活性存在着联系：当a 或d 环破裂后则活性消失， a 环可以是饱和的或含一个双键，但当a 环芳构化后，则完全丧失活性 ( 如异赤酸，图1 2 ) ；b 环上的羧基和末端上的亚甲基，以及正确的立 体配位也是活性表现的主要结构( 殷欣等，1 9 9 0 ) ；跨过a 环的内酯环 ( 如g a 3 上) 对活性并非必要( m a n d e r ，1 9 9 2 ) 。 h o o h c h 2 d l c 如 赤霉酸( g a 3 ) ( 高活性)异赤酸( 无活性) 图1 2 高活性和无活性赤霉素的化学结构 f i g 1 2t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fh i g ha c t i v a t e dg aa n du n a c t i v eg a 根据赤霉素分子中碳原子数目的不同，可分为2 0 ，c 赤霉素和1 9 c 赤霉素。前者含有赤霉烷中所有的2 0 个碳原子( 如g a l s 、g a i t 、g a l 9 、 g a 2 4 、g a 2 5 等) ，而后者只含有1 9 个碳原子，第2 0 位的碳原子已丢失 ( 如g a t 、g a s 、g a 4 、g a 9 、g a 2 0 等) 。相对而言，1 9 c 赤霉素的种类 在数量上高于2 0 c 赤霉素，在活性方面也高于后者( 庄木坤，2 0 0 7 ) 。 6 k ， 苯、氯仿等。溶液呈酸性，在酸性及弱酸性条件下稳定，遇碱易分解， 溶解后有芳香气味。热稳定性较差，5 0 ( 2 就开始分解、破坏。在低温干 燥条件下，赤霉素能长期保存。 1 2 赤霉素的合成途径 赤霉素的合成主要包括三个阶段：前体栊牛儿栊牛儿焦磷酸 ( g e r a n y l g e r a n y ld i p h o s p h a t e ，g g d p ) 的合成，由g g d p 转化为g a l 2 醛的阶段，g a l 2 醛转变为其它种类的g a 。 1 2 1g g d p 的合成 赤霉素属于萜类化合物，与其它萜类化合物如胡萝卜素、固醇、泛 素等具有共同的合成前体物栊牛儿栊牛儿焦磷酸。其生物合成途径是： 乙酰辅酶a 经过乙酰乙酰辅酶a 、甲羟戊二酸单酰辅酶a ( h y d r o x y m e n t h y l g l u t a r y lc o e n z y m ea ，h m g a ) 、甲羟戊酸( m e v m o m c a c i d ，m v a ) 、5 磷酸甲羟戊酸、5 焦磷酸甲羟戊酸( 5 - p y r o p h o s p h o m e v m o n a t e ) 、异戊烯焦磷酸( i s o p e n t e n y lp y r o p h o s p h a t e ，i p p ) 、3 ，3 二甲 烯丙基焦磷酸( 3 ，3 一d i m e t h y l a l l y lp y r o p h o s p h a t e ) 、栊牛儿焦磷酸( g e r a n y l p y r o p h o s p h a t e ，g p p ) 、法尼焦磷酸( f a r n e s y lp y r o p h o s p h a t e ，f p p ) 而得 到( 王镜岩，2 0 0 3 ) 。与类胡萝卜素和泛素不同的是赤霉素合成途径的早 期受g g s 2 基因簇调控，而前者合成途径的早期受g g s l 基因簇调控 ( t u d z y n s k i ，1 9 9 9 ) 。 1 2 2g g d p 转化为g a l 2 醛 g g d p 在古巴焦磷酸合成酶( c p s ) 和内根贝壳杉烯合成酶( k s ) 7 菌株s f g i 1 产赤霉素发酵条件的研究 催化下环化为赤霉素的前身内根贝壳杉烯( e n t k a u r e n e ) 。内根贝壳 杉烯的c 一1 9 的甲基在内根贝壳杉烯氧化酶催化下不断被氧化，经由内 根一贝壳杉烯醇和内根一贝壳杉烯醛变成内根贝壳杉烯酸。内根贝壳杉烯 酸再在多功能细胞色素p 4 5 0 单氧化酶催化下经内一7 0 【羟基贝壳杉烯酸形 成g a j 2 醛( m a c m i l l a n ，1 9 9 7 ) 。g g d p 环化形成古巴焦磷酸( c o p a l y l d i p h o s p h a t e ，c d p ) 是赤霉素合成途径的第一个特异性的关键步骤，并 被认为是真菌中赤霉素生物合成的限制性步骤( h e d d e na n dk a m i y a ， 1 9 9 7 ) 。 1 2 3g a l 2 醛转变为其它种类的g a 由甲羟戊酸到g a l 2 醛的合成过程为高等植物和真菌所共有，而在 g a l 2 醛合成后，真菌合成赤霉素的过程不同于高等植物，且不同植物之 间合成过程也存在差异。在真菌中g a l 2 醛的c 3 位导入b 羟基，从而形 成g a l 4 醛，进而经过g a 4 、g a 7 形成g a 3 ，该途径被称为3 b 羟基化途 径( m a c m i l l a n ，1 9 9 7 ) 。这也是通过对产g a 3 菌株进行诱变筛选得到高 产g a 4 和g a 7 菌株或对产g a 3 发酵过程进行代谢调控改变赤霉菌代谢 途径以得到g a 4 和g a 7 的原因( 王继刚，2 0 0 5 ) 。高等植物中，从g a l 2 醛开始的反应通常有一个共同的顺序，即c 2 0 逐渐氧化，以丧失c 0 2 的方式转变为1 9 c g a ，使得c 1 9 和c 1 0 位形成一个内酯，然后在3 d 位引入羟基，这样形成具有生物活性的1 9 c g a ：若在2 p 位引入羟基则 形成无活性的g a ( t h e ol ，1 9 9 8 ) 。在高等植物中g a 氧化常有3 条途 径：早期3 一羟基化途径，早期1 3 羟基化途径和早期非3 ，1 3 羟基化途 径( 周明兵等，2 0 0 4 ) 。赤霉素的主要合成途径汇总于图1 4 。 譬触骼j m 3 - x 瑶 懋匕m 西 曲啊j 8 1 3 - 崎吐埘吨i 啪 学期l ”墓化造径 e i 由i 妯y d r e a y l a t i m 譬朋孓砼麟他选轻 b 岫3p i y d m l y 枷蛳 l l 物和真璃共钉途径 c o m m o nb m o s ”t h c s l s p a t h w a y o f p l 眦a n d f u n g i 图1 4 赤霉素合成途径示意图( 谈心等，2 0 0 8 ) f i g 1 4g e n e r a lb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f g i b b e r e l l i n s 1 3 发酵法生产赤霉素的研究进展 1 3 1 赤霉素生产菌种 赤霉素广泛分布于自然界，绿色植物、褐藻、绿藻、真菌和细菌中 都发现有赤霉素的存在。尽管绿色植物自身能产生多种赤霉素，但含量 甚微，往往仅能满足自身的需求，不适于工业化生产。近年来产赤霉素 的细菌不断被发现并得到利用，如r h z o b i u mm e l i l o t i 和a z o s p i r i l l u m 9 菌株s f g i 1 产赤霉素发酵条件的研究 l i p o f e r u m ( r u b 6 n 等，2 0 0 4 ) ，b r a d y r h i z o b i u m j a p o n i c u m ( d a n am o r r o n e 等，2 0 0 9 ) 。目前，关于赤霉素产生菌应用最多的是藤仓赤霉菌( g i b b e r e l l a f u g i k u r o i ) ，其无性阶段被称为串珠镰孢菌( f u s a r i u mm a n i h o t i c o l a ) 。它 可产生多种有活性的赤霉素，如g a 3 ，g a 4 ，g a 7 等，是工业发酵生产 赤霉素的主要菌种。 国外对生产赤霉素菌种的研究工作开始于二十世纪六十年代，近年 来有关赤霉素高产稳定菌株选育成果的报道并不多，研究内容主要集中 于赤霉菌分子生物学水平，如赤霉素合成途径缺失突变体的获得，这些 突变菌株在基础研究尤其是赤霉素合成途径的研究中起重要作用。例如， c a n d a u 等采用亚硝基胍诱变野生型赤霉菌菌株i m l 5 8 2 8 9 得到了g a 合 成途径不同反应点发生阻断的缺陷突变株s g l 2 1 、s g l 3 6 、s g l 3 8 和 s g l 3 9 ，为了解赤霉菌中赤霉素的代谢途径提供了有利的实验材料 ( c a n d a u 等，1 9 9 1 ) 。 我国对赤霉素生产菌种的研究集中于高产菌株的选育工作上，始于 上个世纪七十年代。1 9 7 5 年，上海九二零菌种选育协作组曾得到茵号为 “4 3 0 3 ”的高产变种，并成为国内工业上应用的主要生产菌株，但 4 3 0 3 ” 菌株丧失了产孢子能力，只形成多细胞菌丝体，这对菌种的继续改良带 来了技术上的困难。针对菌株不能产生孢子的问题，人们试图通过对原 生质体进行诱变获得高产菌株。余卿等对赤霉素产生菌8 5 1 0 4 的原生质 体进行紫外诱变得到的诱变菌株个别摇瓶发酵效价可达3 6 2 5 r m l ( 余卿 等，1 9 8 7 ) 。李武军等对藤仓赤霉菌的原生质体进行x 射线诱变处理， 得到赤霉素摇瓶发酵效价较出发菌株提高了6 8 1 的突变株，该突变株 性能比较稳定( 李武军等，1 9 9 2 ) 。 早期的诱变育种大多采用的是单种诱变剂进行诱变，效果并不是很 理想。目前，大部分育种采用的是多种诱变方法复合的方式。钱海伦等 用紫外线、钻6 0 、d e s 连续处理赤霉素产生菌，获得的高产菌株摇瓶发 酵产量提高明显( 钱海伦等，1 9 9 1 ) 。赵炎生等人采用激光和化学诱变 的方法对赤霉菌进行复合诱变筛选。得到突变菌株发酵效价可达 3 1 0 0 m g l ( 赵炎生等，1 9 9 7 ) 。 诱变处理得到大量的突变菌株，需要适宜的筛选方法来寻找高产菌 1 0 山东农业大学硕士学位论文 株。2 0 0 5 年，张金儿等应用氯霉素抗性筛选法，将经n t g 诱变处理的 赤霉素产生菌一水稻恶苗病菌6 0 2 8 菌株的原生质体涂布在含有 2 0 0 0 肛g m l 氯霉素的致死再生培养基平板上，获得了大量氯霉素抗性突 变株，其中赤霉素产量高于出发菌的阳性效率达2 0 ，同时获得了在2 0 和6 0 吨罐上的产素能力比出发菌株分别提高7 5 8 和9 3 6 的7 1 0 6 4 高 产菌株，且该菌株经连续五次传代试验，产素能力无明显变化。 除了传统的方法外，基因工程手段也在菌株改良中得到应用。庄木 坤利用基因工程手段将透明颤菌血红蛋白基因( v g b ) 导入到赤霉菌的染 色体组中，它的表达使得限氧条件下，菌株赤霉素产量有明显的提高( 庄 木坤，2 0 0 7 ) 。 1 3 2 赤霉素的发酵方式 1 3 2 1 固态发酵 赤霉素的固态发酵早在2 0 世纪五六十年代就已应用。赤霉素的固体 发酵法生产和液体发酵法相比具有以下优点：( 1 ) 固体发酵设备简单、 操作容易；( 2 ) 发酵原料是农产品，较易获得且生产成本低：( 3 ) 培养 基中高浓度的碳源和氮源不会对发酵过程产生抑制，高浓度的发酵产物 也不会对发酵过程产生阻遏，因此提高发酵单位的潜力大，并且稳定， 发酵高峰不会下跌。有研究指出，在相同的碳源用量条件下用固体发酵 法产生的g a 3 总量比液体深层发酵的高( k u m a r 和l o n s a n e ，1 9 8 7 ) 。专 利文献g d rp a t e n td d 2 5 2 0 0 中曾报导，在大米培养基中发酵1 0 至1 2 天后g a 3 的产量可达8 9 k g 。( 4 ) 能源消耗少，生产成本低，对环境污 染小。有资料显示，同样产量固体发酵法的成本仅是液体法的4 0 。但 固体发酵也存在一些缺点：固体发酵过程操作困难，固态下各项参数不 易检测，尤其是液体发酵的各种探针不适用于固体发酵，使得p h 值、 湿度、基质浓度不易调控，生物量不易量测；较致密的环境下发酵，其 代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能； 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法达到均 匀；劳动强度大，不便于机械化操作。固体发酵生产的缺点使它在相同 经济性能的条件下不被优先选择，目前我国工业化生产赤霉素多采用液 体深层发酵。 菌株s f g i 1 产赤霉素发酵条件的研究 1 3 2 2 液体深层发酵 液体深层发酵是赤霉素发酵的主要方式，其研究兴起于二十世纪六 七十年代，多集中于发酵培养基的组成和培养条件方面，这方面的内容 将在1 3 3 中做详细介绍。另外，七十年代末期人们开始对补料分批发酵 工艺进行研究。与传统的分批发酵相比，补料分批发酵可以克服底物抑 制、葡萄糖效应和代谢产物的抑制等现象，并通过定时或连续补加碳源 的方法来延长产素期提高发酵效价。赤霉素发酵的分批补料多是根据发 酵过程中的残糖和溶氧值的变化采取补料( m o d a k 等，1 9 8 6 ) ，补料可 以是补加葡萄糖等碳源类物质也可以是补加前体物质，例如英国专利 9 5 7 6 3 4 中提n , b a n 甲瓦龙酸可以提高g a 3 的总产量( c r o s s ，1 9 6 4 ) ；陈 勇指出在发酵过程中补加磷酸盐可以提高赤霉素的发酵单位，其发酵效 价比对照高出1 0 0 m g l ( 陈勇，1 9 9 3 ) 。r u c h i 等在g a 3 液态深层发酵过 程中建立动力学模型，并根据模型确定在不同发酵时期进行不同浓度的 碳源和氮源底物的* b a n ，得到的g a 3 效价较分批发酵提高了2 9 倍 ( r u e h i ，2 0 0 5 ) 。 1 3 2 3 固定化细胞技术 固定化细胞技术是将动植物或微生物细胞固定于合适的不溶性载体 上，作为固体生物催化剂而加以利用的- i - j 技术。固定化细胞技术生产 赤霉素的研究开始于2 0 世纪7 0 年代，采用的是固定活菌丝体的方式。 固定化细胞技术的应用使得细胞寿命有所延长，生产效率得以提高，且 在生产后期细胞容易分离、回收。s a u c e d o 等人研究指出，在生物量水 平差不多时，连续发酵体系中固定化菌丝体产生的g a 3 几乎是未固定的 两倍( s a u e e d o ，1 9 9 6 ) 。1 9 9 5 年，l u 等将赤霉菌菌丝体固定在纤维载体 表面得到的固定化细胞，能够8 4 天持续不断地高效生产g a 3 ，效价稳 定为2 1 0 0 m g l 。2 0 0 0 年，e l e a z a r 等将藤仓赤霉菌固定在聚半乳糖醛酸 钙小珠上，在沸腾反应器中发酵生产得到的g a 3 效价最高可达 3 9 0 0 m g l ，是液态深层发酵效价的3 倍。 1 3 3 影响赤霉素合成的主要因素 赤霉素作为赤霉菌的次级代谢产物，其合成随培养基组分和培养条 件的变化而变化，主要受碳源、氮源、碳氮比、溶氧量、温度、p h 等的 m u r o n m t s e ya n da g n i s t o v a 小组就植物油对赤霉素发酵的影响进行了研 究，结果表明葵花籽油对赤霉素的合成有利。2 0 0 6 年，庄木坤等人研究 了植物油对赤霉素发酵影响，发现藤仓赤霉菌m 1 3 在分别以芝麻油、豆 油、橄榄油、葡萄糖为主要碳源的培养基中，发酵赤霉酸的最高效价分 别达到1 4 8 0 、1 3 0 0 、1 2 5 0 和8 9 0 m g l 。有研究认为使用复合碳源发酵会 比使用单一碳源的g a 3 产量效果好。例如，k i t a m u r a 和d a r k e n 研究认 为使用甘油、葡萄糖、乳糖等三者的混合碳源，比单独使用任何一种碳 源效果都好。 高浓度的起始葡萄糖会对g a 3 合成产生抑制，而在发酵过程中当发 酵液中的氮源耗尽时若含有适量浓度的碳源有助于效价的提高，因此工 业生产中经常使用经过淀粉酶液化的淀粉为碳源，这样不仅可以降低成 本，而且还可提供速效碳源( 如葡萄糖) 和缓慢利用的碳源( 如糊精、淀 粉之类) ，供菌丝生长期生长和生产期赤霉素积累的需要。 1 3 3 2 氮源及碳氮比的影响 氮源的种类和用量，对赤霉素发酵结果影响巨大。在速效氮源中， 硫酸铵的效果要优于硝酸钠，但是过高浓度的铵盐对赤霉素发酵不利 ( b r u c k n e r 等，1 9 9 1 ) ，就整个发酵而言，f u s k a 认为花生饼粉和黄豆饼 粉作为氮源的效果较好，优于蛋白胨等动物来源的氮源( 王继刚，2 0 0 5 ) 。 在赤霉素的工业发酵中常采用复合氮源，如花生饼粉和黄豆饼粉的复合。 1 9 9 8 年，段振华研究发现在花生饼粉、黄豆饼粉做氮源的基础上添加玉 米浆可明显提高赤霉素的发酵单位。 目前研究显示稳定高产赤霉素的原料配比都是低氮比的。氮源是影 响赤霉素合成的限制性因素：对数生长期过后，如果培养基中氮源和磷 1 3 菌株s f g i l 产赤霉素发酵条件的研究 酸盐依然保留，则赤霉素不会产生，只有氮源被耗尽时赤霉素的合成才 开始( b o r r o w 等，1 9 6 4 ) 。作为次级代谢产物，g a 的发酵明显存在两个 阶段：菌丝体生长阶段和产g a 阶段。这两个阶段要求的c ：n 也不相同： 茵丝体生长阶段，保持氮源限量或平衡，其c ：n 在1 0 ：1 - - - 2 5 ：1 ：产赤霉 素阶段，氮源耗尽，菌丝体生长缓慢，其c ：n 在2 5 ：1 - - 2 0 0 ：1 ( b o r r o w 等，1 9 6 4 ) 。另外，不同种类赤霉素的生产对c ：n 的要求不同，如g a 3 生产的c ：n 为3 0 ：1 - 5 5 ：1 ，g a 7 生产的c ：n 为9 5 ：1 。 1 3 3 3 金属离子和微量元素 镁、磷、钾是g a 3 的合成所必需的，适当的增加其用量可以提高赤 霉素的含量。但添加量要适度，过量的磷酸盐往往会对g a 3 的合成产生 抑制。另外有些文献报道锌、锰