（发酵工程专业论文）微生物发酵法水解乳清粉制备生物活性肽的研究.pdf

犬津商学院硕十学位论文中文摘要 中文摘要 利用微生物发酵法制备生物活性肽已成为近年来研究的新热点，对于功能性食品的开 发具有十分重要的意义。本文从乳酸克鲁维酵母( 肌咿r o ，o 幔旧p 占妇c f 拈) t s 2 0 0 1 ，t s 2 0 0 2 ，t s 2 0 0 3 ，嗜酸乳杆菌( l ，a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) t s 2 0 0 4 和瑞士乳 杆菌( 幻c f o 蚰c “s 自p p 日 j c “s ) t s 2 0 0 5 ，t s 2 0 0 6 六株菌中筛选出了一株水解乳清蛋 白能力较强的菌株，瑞士乳杆菌t s 2 0 0 5 ，并且对其进行了基本性状的确定。同时，还对 其单因素发酵条件作了系统的研究，测定了生长曲线，蛋白酶合成曲线及产酸曲线，并 且测定了蛋白酶活力。然后，对发酵液进行了a c e 抑制活性的检测，通过对其发酵条件 的优化，确定了瑞士乳杆菌t s 2 0 0 5 生产a c e 抑制肽的最佳发酵条件，并且研究了发酵过 程中发酵液a c e 抑制活性的变化，确定了产品最佳收获时间。而后，对发酵液进行了超 滤，确定了a c e 抑制肽的基本分子量分布。最后，采用两种干燥方式对发酵产品进行干 燥，确定了a c e 抑制肽的生产方法。 实验结果表明：瑞士乳杆菌t s 2 0 0 5 为耐氧菌，菌体形态呈短析状，单个存在或相连 呈链状排列，最适生长温度为3 0 一4 2 ，最适生长p h 值为4 5 0 一7 5 0 。对于瑞士乳杆 菌水解乳清粉单因素发酵条件的研究，确定了乳清粉浓度为1 0 ，发酵方式采用静止培 养的方式，菌体蛋白酶最适水解温度为3 5 ，发酵初始p h 值为5 5 0 。在此条件下发酵 2 4 h 内生物量、蛋白酶活力以及产酸均达到最佳水平。蛋白酶活力经测定为5 u ，并证实 为细胞壁丝氨酸蛋白酶。对于瑞士乳杆菌t s 2 0 0 5 发酵液进行a c e ( a n g i o t e n s i n i c o n v e r t i n gb n z y m e 血管紧张素转移酶) 抑制活性的检测，确定了a c e 抑制率为2 4 1 6 ； 对其发酵条件进行优化，确定了生产a c e 抑制肽的最佳发酵条件为3 3 ，发酵液的初始 p i 为5 5 ，接种量为1 5 ，在此条件下培养瑞士乳杆菌，发酵1 6 小时收获，发酵液中游 离氨基酸含量为3 0 0 4 心m i ，活菌数达到1 0 ”c f u m l ，发酵液a c e 抑制活性为4 4 1 7 ， 比原来提高了大约两倍。发酵产品超滤结果显示，用1 0 0 0 0 d 分子量膜超滤后，其a c e 抑 制活性比未超滤前提高2 5 倍。最后对发酵产品进行喷雾干燥和冷冻干燥，发现这两种 干燥方法对产品a c e 抑制活性没有影响，冷冻干燥的方法产率比较高，可达到1 0 6 0 8 9 l ， 且i c 。为5 0 2 8 g m l 。 关键词：瑞士乳杆菌；乳清蛋白；蛋白水解能力；生物活性肽；a c e 抑制活性 天津商学院硕+ 学位论文a b s 仃a c t a b s t r a c t p r o d u c t i o no fa c t i v i t yp e p t i d e sf 色订n e n t e db ym i c r o o r g a l l i s mh a sb e c o m ean e wh o tp o ti n r e c e n ty e a r s ，a n di ti ss i g n 狮c a n tt ot h ed e v e i o p m e mo ft h ef u n c t i o n a lf o o dm a r k e t f r o m t h e s e s i x s 廿a i n s 目妙v p ，o 叼，? 凰t s 2 0 0 1 ，砂v p r d ，砂c g jk c 肪t s 2 0 0 2 ， 尉缈p 加，缈c 已5 肠c 凰t s 2 0 0 2 - l ，l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u st s 2 0 0 4 ，厶硎臼6 d c f ，f 淞矗已e f f c “s t s 2 0 0 5a n d 口c r d 6 臼c f 刀材s 矗p f v 已，f c o 心t s 2 0 0 6 ，三日c ，d 6 d c f 盯。心向p 知已“c o 盯t s 2 0 0 5h a db e e n c h o s e ni nm i sa r t i c l ew h i c hh a ds t r o n g e rp r o t e o i ”i ca c t i v i t yt h a nt h eo t h e rs t r a i n sa j l dt h e f u n d 锄e n t a lc h a r a c t e ro f 口c 幻6 口c f z f 淞a p f v e ，f c 村st s 2 0 0 5w a ss t u d i e d a tt h es a r n et i m e t h e s i r 堰l ef a c t o ro ff e r r i l e n t a t i o nc o n d i t i o nw a ss y s t e m i c a i i yr e s e a r c h e d g r o w t hc u r v eo f t s 2 0 0 5 ，c u r v eo f 锄i n oa c i dc o n s u m p t i o na n dc u r v eo fp hw e r em e a s u r e d t h ea c t i v i t yo f p r o t e i n a s ew a sm e a s u r e dt o o t h e n ，t h ea c e i n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h ep r o d u c t sw a sa l s o r e s e a r c h e d ，a n dt h eb e s tf 色唧e n t a t i o nc o n d i t i o nf o rp r o d u c i n ga c e i 1 1 l l i b i t o r yp e p t i d eb y 上础 d 6 n c 引饥s 矗e ，w f f c 甜占t s 2 0 0 5w a sc o n f i r m e da f t e ro p t i m i z i n ga n dt h ec h a n g eo fa c e i n h i b i t o r yp e p t i d ew a sa l s os t u d i e di nt h ec o u r s eo ff e r m e n t a t i o n t h em o l e c u l a rw e i 时no f a c e i n h i b i t o r yp e p t i d ew a sc o n f i m e db yu l t r a n l t r a t e d f i n a l l y ，t w om e t h o d so fd r y n e s s w e r er e s e a r c h e da n dt h e t e c h n i q u eo fp m d u c i n ga c e i n h i b i t o r yp e p t i d ef e r m e n t e db y m i c r o o r g a n i s mh a db e e ne s t a b l i s h e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s d c f 0 6 n c 讲“j 向e ，w ，缸“5t s 2 0 0 5w a sak i n do fa e r o t o i e m n t b a c t e r i u m ，s i n g l eo rc a t e n a t i o ne x i s t e d t h ep r o p e rg r o 、v t ht e m p e r a t u r ew a s3 0 4 2 a n dt h e p r o p e rg r o w c hp hw a s4 5 0 一7 5 0 t h es i n g l ef a c t o ro ff 宅r n l e n t a t i o nc h a r a c t e rw a sc o n f l r m e d ， t h ec o n c e n t r a t i o no fw h e yw a s10 ，t h eb e s th y d m l y z et e m p e r a t u r eo fs t a i np r o t e i n a s ew a s 3 5 ，t h eb e s tp hw a sa 由u s t e dt o5 5 0a n dt h eb e s tw a yt of e m l e n 诅t i o nw a ss t a t i cc u l t u r e t h e c e l ig r o w t h so ft h es t r a i n ，p r o t e i n a s ea c t i v i t ya n da c i dp r o d u c t i o nr e a c h e dt oo p t i m a ll e v e li n2 4 h o u r si nt h i sf e r r n e n t a t i o nc o n d i t i o n ，t h ea c t i v i t yo fp r o t e i n a s ew a s5u ，a n di tw a sc o n f i h n e d a sc e l lw a l ls e r h l ep r o t e i n a s e t h e a c t i v i t yo fa c e 一汕i b i t o r yo ff e n n e n t a t i o nb r o t hw a s r e s e a r c h e da n di tr e a c h e dt o2 4 ，1 6 t h eb e s tf 色r r n e n t a t i o nc o n d i t i o nt o p r o d u c e a c e i i l h i b i t o r yp e p t i d ew a sl e a m e da r e ro p t i m i z i n g i n o c u l a t e dw h e y ( 1 5 ，v ，v ) w a s i n c u b a t e da t3 3 ，a n dt h ep ho f f e 丌n e n t a t i o nn u i dw a s k e p ta t5 5 i nt h ec o n d i t i o n ，a f t e r1 6 h 妒m e n t a t i o n ，f k ea m i n oa c i di nt h ef e r m e n t a t i o nn u i dc a nr e a c ht o3 0 0 4 p g m la n dt h ec e l l c o 吼t so fl c “) 6 d c f “s 矗e ，v p f f c “si nf 宅i h l e n t a t i o np r o d u c t sr a i s e do b v i o u s l yu pt o10 8 c 列m l ， 天津商学院硕卜学化论文 a b s t r a c t 一_ - - _ - ， t h ea c b i n h i b i t o r ya c t i v i t yr e a c h e dt o4 4 17 ，t w i c et h a nt h ef o 蛐e rm e t h o do ff e r n l e n t a t i o n t h ep r o d u c tu l t r a f i l t r a t e db yl o o o o dm o l e c u l a rw e i g h tm e m b r a n ew a s2 5t i m e st h a nt h e p r o d u c tt h a tw a sn o tu n l t r a 丘l t r a t e d a tl a s t ，t w om e t h o d so fd r y n e s sw e r es t u d i e d ，o n ei ss p r a y d r y i n g ，m eo t h e ri sf r e e z e d r y i n g a c e - i n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h ep r o d u c tw a sn o te f f e c t e d b y t h e s et w om e t h o d s ，o u t p u to ft h ep m d u c tm a d eb yt h ef r e e z e d r i e dm e t h o d 啪sh i g h e r ， i t r e a c h e dt o10 6 0 8 9 l ，a n di c 5 0o ft h ep m d u c tw a s5 0 2 8 “g m l 。 k e yw o r d s ：上口c 向6 口c f f f 淞矗已f v 已疵1 “st s 2 0 0 5 ；w h e yp m t e i n ； a c t i v i t yp e p t i d e ； a c e - i n h i b i t o r ya c t i v i t y 天津商学院硕士学位论文 第一章前言 第一章前言 1 研究背景 1 1 乳清粉概况 乳清是生产干酪或干酪素时，用酶或酸把牛奶中的酪蛋白凝固分离后剩下的 副产品，是一种总固体含量在6 o 一6 5 的不透明的浅黄色液体，固形物占原料 乳总干物质的一半”。乳清中含有的营养成分基本上都是可溶的，其中乳糖含量 占7 0 以上，乳清蛋白含量0 7 左右( 占总乳蛋白的2 0 ) ，此外乳清中还含有 牛乳中的磷脂、脂肪、矿物质以及维生素等。 乳清粉就是液体乳清的干燥制品。乳清粉的生产过程基本上和奶粉生产工艺 设备相同，工艺要点是先净化然后杀菌、浓缩、喷雾干燥、包装，根据其加工方 法的不同，乳清粉可体现出多种特性。按其特性的不同，可基本分为四大类：甜 性乳情粉、酸性乳清粉、脱盐乳清粉、低乳糖乳清粉( 表1 1 为这几类乳清粉的 组成) 【2 。由于乳清粉中乳糖含量高，即易吸潮，因而限制了它的应用，可通过 去除部分乳糖制得低乳糖乳清粉加以改善。随着乳糖的降低，乳清产品逐渐转向 乳清浓缩蛋白( w p c ) 。w p c 系列通常包括w p c 3 4 、w p c 5 0 、p c 6 0 、w p c 7 5 、 w p c 8 0 ，数字代表制品种蛋白质最低的含量。另外还有乳清分离蛋白( w p i ) 是 指从乳清中完全去除非蛋白质成分，最终干燥产品中蛋白质的含量不低于9 0 的乳清蛋白制品( 其组成见表1 2 所示) 【孙。 表1 1 几类乳清粉的组成m t a b l e l - lt h ec o m p o s eo f s e v e r a lt y p e so f w h e yp o w e 以6 典型组成蛋白质灰分乳糖水分脂肪 甜性乳清粉1 1 o 1 4 58 2 8 86 3 o 7 5 o 3 5 5 ，o1 o 1 5 酸一性乳清粉 1 1 o - 1 3 59 8 - 1 2 - 36 1 0 _ 7 0 03 5 5 0o 5 1 5 低乳糖乳清粉 1 8 0 2 4 03 0 4 01 1 o 2 2 o1 0 4 o5 2 o 5 8 0 脱盐乳清粉 1 1 0 1 5 01 o 一7 o7 0 0 8 0 o3 o - 4 00 5 1 8 天津商学院硕士学位论文第一章前言 表1 2 不同乳清蛋白制品的典型组成， t 曲l e l - 2t h ec o m p o s eo f d i 艉r e n tw h e yp m t e i np r o d u c t s ， 产品蛋白质乳糖脂肪灰分水分 w p c 3 43 4 3 64 8 5 23 0 4 56 5 8 03 o - 4 ，5 、肿c 5 0 5 0 一5 23 3 3 75 0 6 04 5 5 53 5 4 5 w p c 6 06 0 一6 2 2 5 3 01 0 7 04 o - 6 o3 o 5 0 w p c 7 57 5 7 81 0 1 51 0 9 04 o 6 03 o 5 0 w p c 8 08 0 一8 24 0 8 01 0 6 03 o 4 o3 5 - 4 5 w p i9 0 9 20 5 - 1 o0 5 1 02 0 3 0 4 5 1 2 乳清蛋白概况 乳清蛋白是一种高营养价值的蛋白质，是可获得的营养最全面的天然蛋白质 之一。大多数乳清蛋白产品的蛋白质效价( p e r 值) 为3 1 ，超过了酪蛋白的p e r 值2 5 ，仅次于鸡蛋蛋清的p e r 值3 9 。一般认为当某蛋白质的p e r 值超过2 5 时，则被认为是高营养优质蛋白质 5 i 。通过比较表示蛋白质营养价值常用的三种 指标：蛋白质效价( p e r ) ，生物价( b v ) 和蛋白质净利用率( n p u ) ，可以得出乳清蛋 白是一种优质的蛋白质1 4 】。科学研究证实乳清蛋白不仅易于被消化吸收，而且 其必需氨基酸含量高于其它食用蛋白质，见表1 4 。 表1 3 主要蛋白质的营养价值 t a b l e l - 3p e ro f d i 胞r e n tp r o t e i n 蛋白质来源 b vp e rn p u 乳清浓缩蛋白1 0 4 3 29 2 大豆蛋白 7 42 16 1 全蛋 1 0 03 89 4 牛乳 9 l3 18 2 酪蛋白 7 72 57 6 牛肉 8 02 97 3 天津商学院硕士学位论文第一章前言 表1 - 4 乳蛋白、酪蛋白、乳清蛋白中必须氨基酸含量( 1 0 0 9 蛋白质) 【6 】 t 曲l e l 4 n e c e s s a r ya r n i n o a c i dc o n t e n t o f m i l k p r o t e i l lc 鹊e i na n d w h e yp r o t e i r i ，( 1 0 0 9p r o t e i n ) 氨基酸乳蛋白酪蛋白乳清蛋白氨基酸乳蛋白酪蛋白乳清蛋白 色氦酸 1 4 1 4 2 1苏氨酸5 1 4 68 o 苯丙氨酸 5 25 13 8 蛋氨酸 2 72 82 4 亮氨酸 1 041 0 41 1 1 赖氨酸 8 38 1 39 9 异亮氨酸 6 45 76 8 缬氨酸 6 86 86 8 1 2 1 乳清蛋白组成 牛奶中乳清蛋白中主要的蛋白质成分分别为b ，乳球蛋白( b l g ) 、n 乳白 蛋白( n l a ) 、牛血清蛋白( b s a ) 、免疫球蛋白、蛋白酶胨另外还存在的其他 少量组分，如乳铁蛋白( o 3 5 ) 和乳过氧化物酶( o 2 5 ) 等，它们的特性见 表1 5 所示。 ( 1 ) b 一乳球蛋白 在生理状态的p h 下，常以稳定的二聚体形式存在，二聚体像一个拉长的椭 圆体，长约6 9 5n m ，宽约3 6 n n l 。b 哥l 球蛋白的理化性质和p h 值关系很大， 在p h 1 1 5 、脂肪 7 9 4 、 灰分 6 5 、水分 发酵液的初始p h 。( 2 ) 极差分析中得到的发酵晟佳条件与实验中 所得的实验结果相一致，因此，我们确定最佳发酵条件为：乳清粉浓度为1 0 ， 发酵液初始p h 5 5 ，1 5 的接种量，3 3 静止培养。( 3 ) 在此条件下发酵，瑞士 乳杆菌活菌数可达1 0 8c 如，m i 游离氨基酸含量为3 0 0 4 m l 。 6 3 优化前与优化后a c e 抑制活性比较 与未优化工艺( 乳清粉浓度为1 0 ，接种量2 5 ，发酵液初始p h 值5 5 ， 温度3 5 静止培养瑞士乳杆菌) 发酵出的产品进行比较，发现其a c e 抑制活性 大大提高，由原来的2 4 1 6 提高到了4 4 1 7 。 6 4 瑞士乳杆菌t s 2 0 0 5 发酵过程中发酵液a c e 抑制活性变化曲线 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 06 07 0 时间( h ) + 活菌数( 1 9 c f u 向l )+ 发酵液中蛋白含量( o 1 g l ) l 一发酵液中游离氮基酸含量( 弘g m l )+ 抑制a c e 活性 l ，。，一，。，。一 图3 - 1 4 发酵过程中抑制a c e 活性变化 f i g 3 1 5t h ec h a n g eo fa c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yi nt h ec o u r s eo f f e r m e n t a t i o n 掣蜉8 磊最 咖 慨 m 邮 如 加 加 m 加o o 1 弘o o _日凹1o一日3“。_【 天津商学院硕士学位论文第三章结果与讨论 图3 1 5 乳酸菌蛋白水解系统模型 注：p r t p 一丝氪酸蛋白酶0 p p 一寡肽转移系统d t p t ，d t p p 一二肚三肽运输系统 从图3 1 4 可见，前1 6 小时发酵液中蛋白含量不断下降，发酵液中游离氨基 酸含量不断上升，此时菌体生长旺盛，蛋白酶活性高，乳清蛋白不断被水解。发 酵液中a c e 抑制率不断上升，a c e 抑制肽不断释放。 1 6 小时之后，从图3 一1 4 中可见发酵液a c e 抑制率在不断下降，说明此时发酵 液中a c e 抑制肽不断减少。前实验已确定瑞士乳杆菌t s 2 0 0 5 蛋白酶合成属于延续 合成型，蛋白酶可不断水解乳清蛋白，因此a c e 抑制肽是不断产生的，即使蛋白 酶活性较低，a c e 抑制肽产生较少，发酵液中a c e 抑制肽也是不断积累的，但是从 实验现象中观察到发酵液中a c e 抑制肽却不断减少，实验中采用的发酵环境又是 封闭的，由此推测最可能的原因是a c e 抑制肽通过某个运输系统进入细胞，被菌 体利用了。 研究证实，我们的推测与g a i l gf a n g ，b e r tp o o i m a n ，w i in k o n i n g s 【“】报导是 一致的。他们发现了乳酸菌的蛋白酶水解系统，见图3 1 量系统包括p n p 丝氨酸 蛋白酶，1 0 个不同的氨基酸运输系统，寡肽转移系统( o p p ) ，两个二肽三肽运 输系统( d t p p ，d t p t ) 。菌体利用蛋白主要步骤有三个：1 丝氨酸蛋白酶水解基 质中蛋白。2 水解出大片段的短肽通过寡肽转移系统进入细胞内。3 _ 由胞内肽酶 进一步水解成小片段的短肽以供菌体利用。二肽三肽和游离氨基酸即通过各自的 天津商学院硕士学位论文 第三章结果与讨论 运输系统进出。可以说明，1 6 小时后，由于蛋白酶活力减弱，水解乳清蛋白释放 出的a c e 抑制肽较进入胞内的a c e 抑制肽少，所以导致发酵液中a c e 抑制肽减 少。 2 4 小时后菌体生长进入稳定期，4 8 小时后进入生长衰退期，发酵液a c e 抑 制率不断上升，发酵液中a c e 抑制肽不断积累。由图3 1 4 可见，此过程中游离 氨基酸含量虽然也在上升，但上升幅度不高，说明蛋白酶活力不是很高。但从实 验中观察到发酵液a c e 抑制率上升幅度很高，考虑有另外的a c e 抑制肽产生。从 蛋白水解系统中可以看出，当乳清蛋白被水解成短肽后，大片段的短肽通过寡肽 转移系统进入细胞内，由胞内肽酶进一步水解成小片段的短肽，水解出的二肽三 肽还可通过d t p p ，d t p t 系统运送出胞外，因此，发酵液中a c e 抑制肽持续上升 也可能是胞内二肽三肽进入发酵液中所致。从图3 一1 4 中，可观察到发酵液中蛋 白含量持续增加，也说明了这一点。 综上所述，可以看出，a c e 抑制肽的产生和菌体发酵过程是密切相关的，为 了保证菌体有一定的生存活力，还有考虑经济因素，研究确定制备a c e 抑制产品 最佳的收获时间是发酵进行到1 6 小时，此时，菌体生长正处于对数期，活菌数 达到1 0 7 ，水解乳清蛋白释放出的a c e 抑制肽要比进入胞内的a c e 抑制肽来的多， a c e 抑制肽积累较多，此时发酵液中a c e 抑制率为4 4 1 7 。 本部分实验通过对发酵液a c e 抑制活性的测定，研究了a c e 抑制肽的产生过 程，并对瑞士乳杆菌利用乳清蛋白的基本状况做了研究。但是，对a c e 抑制肽的 基本来源只做了初步的研究，发酵液中a c e 抑