（环境科学专业论文）多重pcr技术快速检测海洋病原微生物.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t t h eo c e a ni sc o n c e i v e dt h ec r a d l eo fl i f eo nt h ee a r t h t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e nh u m a na n dt h eo c e a ni sv e r yc l o s e h o w e v e r , w i t ht h ee c o n o m i c p r o s p e r i t y o ft h ec o a s t a lc i t i e s ，m o r ea n dm o r es e w a g ea n di n d u s t r i a lw a s t e w a t e ri s d i s c h a g e d i n t ot h eo c e a n ，w h i c hr e s u l ti nt h em i c r o b i a lc o n t a m i n a t i o no ft h em a r i n e e n v i r o n m e n t t h ep a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m sa r ew i d e l yd i s t r i b u t e di nt h es e a w a t e r , s e d i m e n t sa n db o d yo fm a r i n el i f e t h r o u g hd i e to rc o n t a c t ，s o m e p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s c a l lc a u s ed i s e a s ei nh u m a n ss u c ha s v o m i t i n g ，d i a r r h e a ， g a s t r o e n t e r i t i s ，e v e nt h eh i g h l yi n f e c t i o u sd i s e a s e ss u c ha sc h o l e r a s o m eo ft h e p a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s md i s t r i b u t ei nt h es e a f o o dc a nc a u s ei l l n e s so ff i s ha n d s h e l l f i s h ，b r i n g i n gt r e m e n d o u sl o s s e sa n dh a r mt ot h ea q u a c u l t u r ei n d u s t r y i ti sv e r y i m p o r t a n tt om o n i t o r i n gp a t h o g e n i cm i c r o - o r g a n i s m si nt h em a r i n ee n v i r o n m e n tf o r a s s e s s i n gt h em a r i n ee n v i r o n m e n t a lq u a l i t ya n ds e a f o o ds a f e t y i ti sa l s oh e l p f u lf o r e a r l yw a r n i n ga n dp r e v e n t i o no fd i s e a s e st h e r e b yr e d u c i n gt h ep r o b a b i l i t yo fd i s e a s e s p r e a da n de c o n o m i cl o s s p c rt e c h n o l o g yi so n eo ft h ed e t e c t i o nt e c h n o l o g yt h a t r a p i d l yd e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s b e c a u s eo fi t sa d v a n t a g e so fs i m p l eo p e r a t i o n ， s t r o n gs p e c i f i c i t y , h i g hs e n s i t i v i t y , l o wr e q u i r e m e n t so ft h ep u r i t yo ft h es a m p l e ，i t s a p p l i c a t i o nr a n g ec o v e r sm a n yk i n d si n c l u d i n gt h ec l i n i c a lm e d i c i n e ，g e n e t i c s ， i m m u n o l o g ya n ds oo n m u l t i p l ep c rt e c h n o l o g ya sab r a n c ho fd e r i v a t i v ep c r ， p l a y sa ni m p o r t a n tm l ei nm o r ea n dm o r er e s e a r c hf i e l db e c a u s eo fi t sa d v a n t a g e s ， m o r es i m p l e ，t i m es a v i n g ，a n dh i g hc o s te f f i c i e n c y t h i sr e a r c hs u b j e c tn a m e d r a p i dd e t e c t i o no fp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m s a l o n gt h eb o h a is e a ，t i a n j i nu s i n gd e r i v a t i v ep c rt e c h n o l o g y i ti st h ep r o j e c to f r e s e a r c hp r o g r a mo fa p p l i c a t i o nf o u n d a t i o na n df r o n t i e rt e c h n o l o g i e s t h em a i ng o a l o ft h i s s u b j e c t i st o d e v e l o pr a p i d d e t e c t i o n t e c h n o l o g y o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m so fm a r i n ee n v i r o n m e n tt o r e f l e c tt h es i t u a t i o no fp a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m sp o l l u t i o no fm a r i n ee n v i r o n m e n t b a s e do nt h a tw ec a ne s t a b l i s h p r a c t i c a la n df e a s i b l ed e t e c t i o nm e t h o da n dp r o v i d ed a t ab a s ef o rt h ep r e v e n t i o no f i i a b s t r a c t i n f e c t i o u sd i s e a s e sa n de n v i r o n m e n t a la s s e s s m e n t t h ev o l u m eo fr e a c t i o ns y s t e mo ft h ed o u b l ep c rm e t h o de s t a b l i s h e di n t h i s p a p e ri s2 5 p 1 ，i nw h i c hc o n t a i n i n gm 9 2 + 1 5m m ，e a c ho ft h ep r i m e r so 2 5 m ， 4 x d n t p0 1 m m t a qd n ap o l y m e r a s eo 0 5 u l x l a n d1 p c rb u f f e r t h e d e t e c t a b i l i t yi s2 11c o u n t m lf o rv i b r i op a r a h a e m o l y t i c u sa n di s 1 8 4 c o u n t m lf o r v i b r i ov u l n i 沂c u s t h ev o l u m eo fr e a c t i o ns y s t e mo ft h e t r i p l ep c rm e t h o d e s t a b l i s h e di nt h i sp a p e ri s2 5 l t l ，c o n t a i n i n gm 9 2 十3 5m m ，e a c ho f t h ep r i m e r so 1 2 5 “m ，4 d n t po 1m m ，t a qd n ap o l y m e r a s e 0 0 5 u p 1a n d lx p c rb u f f e r t h e d e t e c t a b i l i t yi s 2 6 0 2c o u n t j m lf o rf i b r i oc h o l e r a e 2 1 lc o u n t m lf o rv i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u sa n d1 8 4 c o u n t m lf o rv i b r i ov u l n i f i c u s t h ep r o c e d u r eo f d o u b l ep c ra n dt r i p l ep c ra m p l i f i c a t i o ni s ：9 4 t h ed e g e n e r a t i o nf o r10 m i n u t e s ；t h r e et e m p e r a t u r ec y c l e35t i m e s ( 9 4 d e g e n e r a t i o nf o r4 0s e c o n d s ，5 8 a n n e a l i n gf o r6 0s e c o n d s 7 4 e x t e n s i o n sf o r6 0s e c o n d s ) ；7 4 e v e n t u a l l y e x t e n d e df o rl0m i n u t e s w eh a v eu s e dt h em e t h o ds e tu pi nt h i sp a p e rt ot e s t s e a w a t e rs a m p l e sc o l l e c t e df r o mt h eb o h a ic o a s t ，f i n g d i n gt h a tt h ec o n t e n to ft h e t h r e ep a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m sa r eq u i t ed i f f e r e n td u et od i f f e r e n ts e a s o n sa n d d i f f e r e n tr e g i o n s t h et e s tf o u n dt h a tt h ep c rm e t h o de s t a b l i s h e di nt h i sp a p e ri s s t i l li n a d e q u a t ea n dn e e df u r t h e ri m p r o v e m e n t k e y w o r d s ：m u l t i p l ep c r ，v i b r i oc h o l e r a e ，v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ，v i b r i o v u l n i f i c u s ，s e aw a t e rs a m p l e s i i i 第一章绪论 1 1 1 海洋环境 第一章绪论 第一节海洋环境中的病原微生物 占地球表面积近7 2 的海洋是孕育地球生命的摇篮。海洋环境包含了众多组 分，是一个高度复杂的系统。虽然人类并不生活在海洋中，但海洋却为人类的 生存、消费、生产、发展提供了不可缺少的物质和能量。一直以来，人类与海 洋有着十分密切的关系【1 】，如今，5 0 以上的超百万人口大城市以及七成以上的 人口都分布在距离海岸不足l o o k m 的范围内。自2 0 世纪五十年代以来，世界各地 的海洋事业发展都极为迅猛，现在，已有百余个国家进行了海上石油和天然气 等能源的探测和开采；每年从海洋开采的石油超过2 0 亿吨，从海洋中捕获的鱼、 虾、贝类逾1 亿吨。 随着科学技术的发展和经济水平的提高，人类开发海洋资源的规模越来越 大，对海洋的依赖程度越来越高，海洋对人类的影响也日益增大。面对困扰人 类的人口、资源、环境问题，越来越多的人们把目光投向了海洋，寄很大希望 于海洋的开发和利用。然而随着沿海城市经济的繁荣，损害与污染导致的环境 问题逐渐显现，石油泄漏，赤潮，过度捕捞，等等。海洋环境问题层出不穷， 范围越来越大，危害也越来越严重，海洋环境问题对人类生存发展的影响已经 引起了人们的广泛关注。 海洋环境主要包括海水环境和底质环境。我国在海水水质标准中规定，海 洋水产养殖区的海水质量不能低于二类海水标准；同时海洋沉积物质量要 求海洋底质质量不能低于一类标准。如果海洋生态环境受到污染，致使水产养 殖区的环境超过上述标准，就会对水产品的质量造成一定的影响【2 j 。探索保护海 洋生态系统的途径和方法是海洋环境研究工作的重要任务之一。 我国海域面积广，海洋资源十分丰富。如今，我国已初步形成了功能完善、 布局合理、类型齐全的海洋自然保护区体系。截止至u 2 0 0 6 年底，我国设立的各 级海洋自然环境保护区达1 4 9 个，保护面积( 包含涉及的海岸带面积) 达 第一章绪论 3 7 5 8 4 k m 2 ，约占我国管辖海域面积的1 2 。我国已建的海洋自然环境保护区包 括海洋和海岸生态系统、海洋生物多样性以及海洋自然历史遗迹三种类型，他们 的数量分别为8 5 个、5 1 个和1 3 个，依次占海洋自然环境保护区总数的5 7 、3 4 和9 。其中各类典型的生态系统，如滨海湿地、红树林、珊瑚礁、海湾、海岛、 重要渔业水域和入海河口等，以及各种濒危珍稀海洋生物和具有重大科学文化 价值的海洋自然历史遗迹、自然景观也已基本得到了有效的保护。 1 1 2 海洋环境中病原微生物的来源 海洋环境中存在着多种可感染人或海水养殖动植物的病原微生物。近年来， 随着沿海城市人口的增长和经济的发展，城乡生活污水和工业废水的排海量也 逐年增加，越来越多的病原微生物随污水进入到海洋环境中，广泛分布于海水、 沉积物以及生物体中，造成海洋环境微生物污染。 微生物污染是指细菌、病毒、藻类和寄生虫等的污染。海洋环境中的病原 微生物主要有两个来源：一是海洋环境自身产生的；二是人类生产活动和动物 产生的废物排放。海洋环境自身产生的病原微生物数量极少，海洋中的病原菌 有8 0 来自陆地，病原菌进入海洋环境的渠道有很多种，常见的包括废水排放、 船舶运输、河流径流等。此外，海洋环境中的有机物增加引起的海水富营养化， 改变了海水环境，也会导致海水中的细菌大量繁殖继而含量超标【2 】。 海洋近岸水域由于受人类活动多的影响，成为了接纳污染物最多的海域， 来自大陆的细菌、病毒、寄生虫、藻类等成为了危害海洋环境最重要的源头。 海水一旦受到污染，很容易会使鱼、虾、贝类染病，在被污染的海域中生长的水 产品体内可能含有多种致病菌( 如大肠杆菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希菌、沙 门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌，等) ，人们如果使用了这些未经完全 煮熟的海产品，食用者就可被感染而生病【2 】。 通常沿海城市生活或生产废水经处理后直接或间接排入海洋中。美国大约 3 7 的人口生活在沿海地区，每天产生达4 o 1 0 1 0 吨废水。全球沿海地区的发展 速度为内陆的2 倍，但一部分地区多达9 0 未经处理的废水直接排入海洋中。还 有很多废水只经过初级的沉淀等处理，未消毒即直接排入海洋。大多数地区处 理后废水中的病毒没有经过检测，通过细胞培养实验，未处理废水中病毒颗粒 的数量为1 8 2 1 0 2 - 9 2 1 0 4 个l ，经不同深度处理的废水大致范围为 2 第一章绪论 1 0 1 0 1 0 1 0 2 个l 。 2 0 0 5 年，我国陆源排海污水总量为3 1 7 亿吨，占全国污水排放总量的6 0 ； 沿海地区污水处理厂实际处理水量为1 7 1 0 万m 3 d ，经处理排入海洋的污水仅占排 海污水总量的2 0 3 1 。中国海洋环境状况公报显示：2 0 1 0 年，我国管辖海域中， 达到第一类海水水质标准的海域约占总海域面积的9 4 ，但水质劣于第四类海水 水质标准的近岸海域尚有4 8 万平方公里。在“十一五”期间，我国海洋环境的状 况总体上保持了稳定。尽管近年来主要超标排放物质在入海排污口的超标率开 始呈现下降趋势，但仍有大量污染物通过河水径流进入海洋，影响我国近岸海 域环境质量最主要的原因仍然是陆源入海排污口排污和江河携带污染物入海【4 】。 经过二级处理的污水，其细菌与病毒的含量会有所下降，但出水中病原微 生物的数量和检出率仍然不容乐观( 详见表1 1 ) 。未经处理的船舶生活污水和压 舱水直接排入海中，也会带入多种病原菌。沿海地区的畜禽养殖业管理不善， 粪便中的大量病原微生物会通过大气降水、地表径流进入海洋水体。海洋水产 养殖业也会产生大量病原微生物，投入水中的饵料有多达3 0 未被鱼虾贝类摄 食，残饵、残骸以及鱼虾贝类的排泄物沉到水底，影响了底栖环境，也会进一 步引起病原微生物的滋生。 表1 1 我国部分城市污水处理前后微生物指标嫡1 3 第一章绪论 1 1 3 海洋病原微生物的危害 1 1 3 1 病原微生物的种类 病原微生物，也称病原体，是指能够侵犯人或其他动物，引起感染甚至导 致传染病发生的微生物。目前，已经确定能够严重危害人和海水水产养殖动物 的致病微生物主要包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体和衣原体等，其中 以细菌和病毒的数量最多，且危害性最大【6 。海洋环境中，细菌作为微生物的一 个分支，是重要的化能异养微生物，可跨界面进行物质输送。各种细菌在分子 水平调节水体中可溶性生物来源的有机质，在自然状态下，有利于补充和丰富 食物网【7 】。然而近年来，由于人类活动，海洋环境的逐渐恶化，导致不同病原菌 的致病力已出现明显的变化和增强。 海洋环境中生存着各种各样的细菌，在海水、地质和海洋生物中都存在大 量人类和动物的致病菌，如致病性大肠杆菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、沙门氏 菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌，等。这些细菌有的能通过饮 食或接触引起人类疾病，例如沙门氏菌病( 包括伤寒和副伤寒) 、肠胃炎、细菌 性痢疾，甚至霍乱等传染性疾病；有的分布在海产品中，会引起鱼虾贝类生病， 给水产养殖业带来巨大的损失和危害；还有的能感染海洋中的其他生物，如海 龟、鲸、珊瑚等。 海洋环境中也存在着大量病毒，研究者在经济海洋生物中已发现超过10 0 种 病毒【8 1 ，许多动物病毒都能引起海洋生物以及人类的疾病。 1 1 3 2 病原微生物对人类健康的危害 全世界大部分人口分布在沿海地区，外环境水中存在多种细菌，其中由于人 和动物的粪便而带入的某些病原菌和水中固有存在的致病性弧菌均会引起人类 的肠道疾病【9 】。若海水中含有6 0 c f u 1 0 0 m l 的链球菌，患某些疾病的概率即大 大增加。许多国家和沿海地区，都曾经发生过因食用不洁海产品引起的暴发性 大规模流行肝炎和胃肠炎，我国也曾发生食用小杂鱼引发霍乱流行。据资料显 示，早在1 9 5 3 年，人们就已经发现腺病毒是引起人类急性上呼吸道感染的重要 原因。几乎所有病原微生物都可通过粪1 3 途径传播，这对人类的健康造成了很 大地威胁，老年人、儿童和免疫受到抑制的人更容易被严重的感染。 据统计，细菌性食物中毒占各类食物中毒总数的一半以上【l 。发达国家每 4 第一章绪论 年有近1 3 的人罹患食源性疾病，美国每年由于病原微生物引起的食物中毒约有 7 6 0 0 万例，国际社会对食品安全越来越重视，各国人民对食品中含有害微生物 的问题也越来越关注。近年来，随着以核酸为基础的微生物分子检测的发展， 特别是p c r 技术的应用，使致病菌检验发展到一个新的水平。多种致病菌的p c r 快速检验方法被建立起刑1 1 】。 据我国食源性疾病资料显示，2 0 0 5 年，按事件数统计，微生物性病原共1 5 7 起，占总数的4 2 4 ；按患者数统计，微生物性病原共4 5 1 1 人次，占总数的5 8 2 。2 0 0 3 年的食源性疾病暴发事件中，微生物病原致病的人数为化学物导致患 病人数的4 倍以上，达1 0 5 4 1 人。病原微生物可通过娱乐用水、海水养殖等途径 与人接触，进而使人感染。 1 9 9 0 年，香港有高于4 0 万人次患病是由于接触了受污染的海水，同年的流 行病学调查研究中显示，在海滩游泳后患肠胃炎的几率上升了五倍【l2 | 。在世界 各地的调查中发现，海水中的某些病原微生物( 例如链球菌) 不但能引起肠胃 道疾病，与呼吸道疾病的发生也有一定关系。彭云辉对2 5 0 0 0 名去过海滩的人进 行了走访调查，发现在海滩游泳致使皮肤、呼吸道、眼睛等疾病发生的概率比 没有在海滩游泳的高2 2 0 倍【l3 1 。但目前通过流行病学数据很难预测疾病的爆发， 直接监测相关的病原体是就成了一种更为实际的方法。 1 1 3 3 病原微生物对养殖业的影响 病原微生物能引起海水水产养殖动植物患病，甚至引起大规模的死亡病害， 这不但给养殖者带来了重大经济损失，而且严重阻碍了海水养殖业的发展。鲍 鱼、扇贝、对虾等常见海水养殖物种均受到细菌、病毒的困扰。由于目前尚缺 乏有效的抗病毒药物和治疗方法，早期预防病害发生就显得更为重要。 感染了创伤弧菌2 型菌株的鱼类体表会发生溃烂，此菌对鳗鲡有很强的专一 感染特性，是公认的鳗鲡弧菌病的原发性病原菌【1 4 】。大菱鲆在我国北方有超过 2 0 亿元的养殖规模，2 1 世纪最初的几年，由于疾病的频繁爆发，我国大菱鲆养 殖每年的经济损失约4 亿元。其中由于细菌感染而造成的烂鳍病是最常见的疾病 之一，导致累计死亡率高达9 0 【i 引。 水霉病是水产养殖的一种常见病，是水霉菌寄生在鱼体中引起的。当水环 境中存在水霉菌时，体表组织受损的鱼就有可能感染，水霉病孢子会从鱼体溃 烂处侵入，从鱼类的皮肤和身体里的吸取营养成分，进而在受伤处迅速繁殖， 5 第一章绪论 长出棉毛状的菌丝。菌丝与伤口处的细胞组织进一步缠结黏附，会导致鱼类皮 肤溃烂、组织坏死。随着病灶面积的扩大，鱼体食欲减退、逐渐消瘦、游动失 常、负担过重，病鱼最终衰竭亡。 1 1 3 4 病原微生物对我国滨海经济发展的影响 近年来，我国各地尤其是沿海地区发展迅速，人类活动对海洋环境的影响 加大，排放到海洋中的污染物逐年增多，沿海区域环境质量有逐年下降趋势。 海洋突发性污损事件频频发生，陆源排污和石油泄漏使得污染范围逐渐扩大， 过度捕捞和围海造田极大地破坏了海洋生态，我国海洋环境面临的压力越来越 大。人类活动导致的海洋病原微生物过度繁殖不仅对海洋生态系统造成巨大的 危害，而且对人体健康构成严威胁，也制约着沿海地区经济的可持续发展。 我国有长达1 8 万公里的海岸线，随着经济的不断发展，滨海旅游将是开发 的重要分支。但是我国海洋环境中存在大量病原微生物，表面海水中病毒的浓 度高达1 0 5 1 0 8 n i l 。天津以及全国大部分近岸海域水体都存在富营养化的趋势， 这种条件更适合包括病原生物在内的微生物生长。渤海天津沿岸海水中甲肝病 毒的浓度比美国和墨西哥边界海水中的高出- - n 四个数量级。海洋弧菌等致病 菌在海水和海产品中广泛分布，人类摄入或接触被病原菌污染的水源和食物就 有被感染的可能性。另外，相对于淡水而言，海水环境的理化条件更稳定，也 为很多病原微生物提供了更适宜的生存条件，这也是看上去较清澈的海水可能 反而病原微生物含量更高的原因之一。 1 1 4 海洋病原微生物的致病机理 病原微生物的种类不同，致病机理也不尽相同。 寄生虫生存在宿主体内，吸取宿主的物质与营养，对宿主产生危害。人们 曾在缢蛏体内检测到存在食蛏泄肠吸虫，这种寄生虫自毛蚴侵入缢蛏体内，随 缢蛏一起生长，吸取缢蛏体内的大量营养，发育成包蚴，并进行无性生殖，缢 蛏内脏组织几乎被虫体消耗殆尽，体质消瘦，直至死亡【1 6 】。病毒同寄生虫的致 病机理有些类似，侵入宿主细胞后，在宿主细胞内合成自身d n a 及蛋白质，组 装成子代病毒后使细胞大量解体。而细菌致病的主要原因是起体表和释放的蛋 白、糖类和酶等。 据美国环保局的报道，大多致病菌超过1 0c f u 的感染剂量时会引起疾病发生 6 第一章绪论 1 7 , 1 8 】。 细菌首先会黏附于宿主细胞表面，这是细菌侵入宿主并有效发挥毒素作用 使机体感染的先决条件。细菌外膜上发挥粘附作用的主要结构是外膜蛋白，外 膜蛋白与菌株的毒力也有密切关系。构成细菌内毒素的主要物质之一是脂多糖， 脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种重要组分，具有种属特异性，是重要的 致病因子。副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌的脂多糖都已被证明与其致病过 程紧密相关。外膜蛋白与脂多糖能结合成复合物，此类复合物与细菌的自凝作 用和粘附作用有密切关系。 目前己发现多重致病性弧菌均可产生胞外酶和细胞毒素，它们具有多种酶 活性，攻击人体健康细胞，或对健康细胞起破坏作用，可产生强烈的致病作用， 且致病作用大致相同：分解破坏宿主的组织成分，破坏或减弱宿主体质；破坏 机体凝血系统，降低酶活性；破坏血细胞导致溶血；破坏血清的免疫功能等， 最后导致人类疾病的发生。 副溶血弧菌首先选择性粘附在宿主表面，进而侵袭，突破宿主生理免疫防 疫屏障，释放溶血素和胞外酶，溶解宿主的红细胞。此过程中也会释放载铁体， 从胞外环境中摄取铁，细菌这种吸收贴而在宿主体内增殖也被认为是另一重要 的致病毒力因子【1 9 】。 研究发现，霍乱弧菌主要致病因子有三个：( 1 ) c t x 基因元件，其所含的c t x a b 基因片段能编码霍乱毒素，这种蛋白质能导致人类剧烈腹泻；( 2 ) t c p 致病性岛， 它可编码尺= ! 躏毛，调节霍乱弧菌的粘附作用；( 3 ) 基本的毒力调节基因t o x r ， 能够调控编码c 嘶口t c p 的基斟2 0 1 。霍乱弧菌的致病性是由这以上三个致病因子 共同作用产生的。 创伤弧茵的大多数致病菌株都能产生由w h a 结构基因编码的溶细胞素 ( w c ) 。目前人们对v v c 的毒性机理尚未完全明了，大多数研究人员认为该细 胞毒素具有血管渗透因子活性，与靶细胞的细胞膜结合后使细胞形成跨膜孔道； 诱导细胞产生超氧阴离子，释放大量一氧化氮导致细胞凋亡；诱导细胞中组胺 的释放；受金属蛋白激酶等因素调节实现【2 1 1 。 7 第一章绪论 第二节海洋病原微生物的监测与指示微生物 1 2 1 常见的病原微生物检测与监测 1 2 1 1 国内外病原微生物监测现状 自2 0 世纪四五十年代以来，世界各国对海洋环境污染逐渐有了深入的了 解，对海洋污染造成的影响也有了更深的认识，开始制定法律和政策，控制污 染物的排放，应用先进科学技术，对自然资源合理开采利用，改善环境质量。 与此同时，科研人员对海洋污染进行了大量调查研究，涉及化学、生物、生态、 医学等方面，从早期的污染现象，到危害效应，再到机理研究，积累了大量资 料。各个政府制定出符合当地情况的海洋水质标准和生物标准，对海洋环境进 行监测，以对海洋环境进行有效管理，改善海洋环境，保护海洋自然资源和生 物多样性，以期对海洋生态系统进行保护，将海洋污染对海洋环境本身和对人 类的损害降到最低程度。 环境监测是通过定期对影响环境质量因素的代表值进行测定，从而确定环 境质量( 或污染程度) 及其变化趋势。我国海洋监测已有近半个世纪的历史， 1 9 9 6 年，国家将海洋高科技列入了国家高科技研究发展计划，作为其中的第八 个领域【2 2 1 。近十几年来，通过制定宏观政策、加强海洋法制建设、发展清洁生 产和循环经济、建立有效防污染机制，使我国海洋环境有了很大改善，海洋应 急管理与海洋监测体系也越来越完善【2 3 1 。为加大对水资源的控制与治理力度， 我国已启动“水体污染控制与冶理”重大科技专项( 简称“水专项”) ，作为国家 中长期科学和技术发展规划纲要( 2 0 0 6 2 0 2 0 年) 设立的1 6 个重大科技专项之 一，水体病原微生物的监测是其中的一个重要方耐2 4 】。 各个沿海国家和地区都在积极发展海洋监测技术，美国、日本、俄罗斯、 加拿大和欧共体等发达的海洋强国或集团，不断强化和更新海洋环境监测系统 管辖下的水域，以及各国共享海域的海洋资源监测调查手段【2 5 1 。美国的海洋生 物监测开始于2 0 世纪六七十年代，到八十年代末，监测范围已覆盖了病理、生 理、生化、遗传、生态等学科范畴。海洋病原微生物的致病基因、海洋生物免 疫机制的探讨、海洋生物抗病相关基因的筛选、d n a 疫苗的研制等，已成为当 8 第一章绪论 前海洋生物技术的重点研究领域。然而，海水中病原性疾病发生的规律性不强， 再加上研究技术尚不够先进，缺乏实用、准确而快速的检测方法，人们因食用 被污染的水产养殖产品和通过接触被污染的海水而被感染进而生病，成为了一 个重要的公众健康问题。因此，开展海洋病原微生物的监测、深入相关病原微 生物的致病机理的研究，对于评估海洋水产产品安全，进行疾病的预防和早期 预报，减少疾病的传播概率，降低相关经济损失，具有十分重要的意义和应用 推广价值【2 6 j 。 1 2 1 2 常用病原微生物检测方法 传统细菌鉴定主要依据的是细菌或菌落的形态特征及生理生化性状，在实 际操作中，对细菌进行分离、纯化、培养后，从外观形态、生理生化特征和免 疫学特性等方面加以鉴赳27 1 。显色培养基技术是近年发展起来的新型快速检测 法，其原理是通过在分离培养基中加入特异性酶的显色底物，根据菌落颜色直 接就可以对菌种做出判断，减化了操作步骤，节省了时间，提高了检测效率【2 0 1 。 目前，对病原微生物的检测，除了传统的细胞培养的方式，越来越多的新方法 开始发挥更为有效的作用。 近几十年来，分子生物学和分子遗传学技术发展迅速。2 0 世纪6 0 年代开 始，细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和新方法被广泛应用在细 菌分类学中。所有细菌的基因中都含有1 6 s r d n a 片段，这些在染色体上存在多 个拷贝的基因序列在长期进化过程中一直保持稳定，是进化过程中最为保守的 基因序列。现在，1 6 s r d n a 作为标记基因，已经广泛应用于细菌分类和分子流 行病学的研究中【2 8 】。此外，科学研究工作者们已测定出大量已知微生物的d n a ， 并建立起国际基因数据库，使之成为鉴定微生物种类非常重要的参照系统。人 们可通过测定未知微生物d n a 序列，同基因数据库中的序列进行比较分析， 进而达到对其高效准确的鉴定菌种的目的。 微生物的毒力因子是可编码引起疾病的蛋白质的基因序列，各种毒力因子 己被确认是重要的致病性因素【2 9 1 。在对微生物的致病机理研究中，己将核酸技 术运用在检测上述毒力因子，随着研究的深入，核酸检测技术的发展非常迅速。 该技术是以病原微生物的核酸及其组成部分为主要研究对象，核酸技术也可与 其他生物化学手段相结合，从而扩大鉴定的范围。目前，在海洋病原微生物的 检测中，应用较广的有p c r 技术、d g g e 技术、1 6 s r n a 检测技术、免疫学方 9 第一章绪论 法、d n a 杂交等，其中以p c r 方法最为经济易行【3 0 】。焦豫良等通过多重p c r 技术一次可检测6 种常见病原微生物，包括霍乱弧菌、福氏志贺菌、蜡样芽胞 杆菌、肠毒性大肠埃希菌、大肠埃希菌和伤寒沙门菌【3 0 1 。探针标记方法发展十 分迅速，为检测各种病原微生物提供了更为方便、安全、快捷的技术支持【6 】。 变性高效液相色谱( d h p l c ) 是利用离子对反向高效液相色谱原理，通过d n a 分离柱将核苷酸片段进行分离，以便于分析，是近几年发展起来的一种快速检 测p c r 扩增产物的新技术【2 。 免疫学检测技术是一种己广应用的病原菌检测方法，其原理是利用特定抗 原与相对应的抗体发生特异性反应，并将此方法与其他生物化学或物理学方法 相结合，主要包括免疫荧光技术、w e s t e r n 印迹法、免疫酶技术等【3 。在实际 样品的检测中，为了提高免疫反应的敏感性和特异性，人们通过标记技术( 向 反应体系中加入同位素、荧光或酶等) 使结果放大显示，从而对抗原或抗体进 行定性或定量检测【6 】；对于抗原或抗体含量甚微的样品，将免疫学方法同分子 生物学检测技术( 例如p c r 技术) 相结合，大幅提高检测方法的灵敏度，可用 于检测极微量的抗原抗体【6 3 1 1 。 总体而言，海洋病原性微生物的检测已由传统培养检测法发展到免疫学方 法和分子生物学检测方法，其操作越来越简单易行，检测结果也日趋精确。分 子生物学技术可从基因和核酸水平反映细菌的流行病学状况，不但可检测出阳 性菌株，而且能判定是否携带毒力因子，能够为食源性疾病的流行病学调查提 供有力的支持，大大提高了预防、控制疾病爆发的能力【2 0 1 。在对于实际样品的 检测中，要综合考量各种快速检测方法的长处和不足，兼顾定性与精确定量两 个方面。 1 2 2 海洋环境中的指示微生物 指示生物也称做生物指示物，是指在一定环境或区域范围内，具有一定的 代表性，它们的数量、种类、群落结构和生理生化反应等变化能够反映出环境 状况的变化，对人们预示环境破坏的生物。指示生物包括三类：指示动物、指 示植物以及指示微生物【3 2 3 3 。在海洋环境中，微生物种类多、体积小，受环境 影响时能最快出现反映，是作为指示生物的最佳选择。水体中的病原微生物进 行监测，对于保护人群的健康和养殖业的发展，具有十分重要的意义。 1 0 第一章绪论 细菌作为原核微生物的代表较早被作为指示生物，其中发光细菌是应用最 早、最典型的代表。当某些污染物存在时，会影响发光细菌的发光行为，是细 菌发光能力受阻，引起荧光强度的变化。另外较早确定的三个指示菌有三种肠 道细菌：大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l d 、粪肠球菌( e n t e r o c o c c u sf a e c a l i s ) 和产 气荚膜梭菌( c l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n s ) 。粪大肠杆菌是各种自然水体和饮用水常 用的污染指示微生物【3 4 。 理想的指示微生物应该具有以下条件：( 1 ) 普遍存在于人类和其他动物体 内和粪便中，且其数量要高于病原微生物；( 2 ) 正常状态下，未受粪便污染的 水体中是不存在的，且在水体中不会自行繁殖，只有当水体受到粪便污染时才 会生存；( 3 ) 存活能力较强，对氯、臭氧等消毒剂和其他不良因素的抵抗力较 强，略强于病原微生物；( 4 ) 在受污染水体中分布比较均匀；( 5 ) 有适宜的检 测方法，能对其进行快速、准确的检钡i 1 1 3 5 3 。理想状态下，水体的指示微生物应 为水体中能够反映导致健康风险、可直接定量的微生物，但是实际情况下有很 多原因导致病原微生物不适合作为指示微生物。因此，人们多采用的是间接指 标，即指示微生物 3 6 3 7 】。 由于选择指示微生物的要求条件比较高，目前还没有哪一种微生物能够全 部满足这些要求，现在检测中所使用的微生物只能满足部分条件。海洋环境中 主要的指示微生物见表1 2 【蹦j 。 表1 2 海洋环境中主要的病原生物指示生物 第一章绪论 产气单胞菌属 空肠弯曲杆菌 产肠毒素大肠杆菌 粪大肠菌群 粪链球菌 海洋分支杆菌 沙门氏菌属 志贺氏菌属 动物人类粪便 动物人类粪便 动物人类粪便 动物人类粪便 动物人类粪便 海水 动物人类粪便 动物人类粪便 弧菌属海水，粪便 小肠结肠炎耶尔森菌 动物人类粪便 d w 指标微生物的检测方法主要有三类： 法。细菌学水质质量评价标准如表1 3 ， 肠菌群指标( 简称f c ) 3 9 , 4 0 。 培养法、分子生物学方法和免疫学方 包括总大肠菌群指标( 简称t c ) ，粪大 表1 3 水质细菌学质量评价标准( 个l ) 1 2 鳓。一一一 第一章绪论 目前海洋环境质量监测的方法主要分为以下两类：化学监测和生物监测。 化学监测主要研究各种物质的在海洋中的迁移及时空分布变化；生物监测则侧 重于研究不同污染对生物种群、群落、生化反应的形响。美国从1 9 7 6 年开始采 用生物指数法对其领域的海洋环境进行生物监测，侧重生态群落的数据收集和 研究。通过数学方法反映生物种群和群落结构变化的数值，来评价环境质量水 平和变化【4 1 | 。 1 9 9 8 年，v a n t a r a k i s 等对希腊南部佩特雷湾一带的海滩进行了病原微生物 的调查，其中通过p c r 技术检测到腺病毒和肠道病毒的检出率分别为2 8 和 1 7 。1 9 9 9 年有学者在对佛罗里达湾进行r t - - p c r 技术检测时发现，7 9 的 样品存在肠道病毒，其中甲肝病毒阳性样占6 3 ，诺沃克病毒阳性样占1 1 。 流行病学研究已表明，采用肠球菌标准更加准确，美国e p a 也曾建议利用肠球 菌对海水浴场进行监测，反应该环境的安全状况，但至今世界各地仍沿用大肠 菌群标准。 目前，各种水体的水质评价标准中，均有微生物的评价方法，通过测定水 体中指示微生物的数量，来表示水体受粪便等污染的情况、废水处理厂的处理 效率，以及给排水系统的安全性。但这些指标已经开始显示出不能满足环境监 测的需要。已有学者提出，指示微生物除了包括常规的大肠杆菌、细菌总数之 外，还应增加例如大肠杆菌噬菌体和脊髓灰质炎病毒等微生物，以更加全面地 了解水体受污染的情况。 以粪大肠菌为代表的细菌指标来评价水质，存在很多缺点。传统的指标并 不能有效的指示各种病原微生物的污染状况，因为微生物群落是一个十分复杂 的系统，各种微生物数量变化并不存在简单的数学关系，即使某种致病性细菌 学指标低于标准值，仍然无法及时准确地预测很多海洋病原体疾病的暴发。因 此，在水质的综合评价中加入部分致病菌的检测具有重要的现实意义。本论文 研究的三种致病菌，是常见的且致病性较强、引起疾病较为严重的弧菌，能对 疾病的发生起到预防和警示作用。 1 3 第一章绪论 第三节聚合酶链反应( p c r ) 技术及研究现状 1 3 1p c r 反应机理 聚合酶链式反应英文全称为p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，简称p c r ，又称 为无细胞克隆技术( f r e eb a c t e r i ac l o n i n gt e c h n i q u e ) ，是参照生物体内d n a 复制 的特点，对特定d n a 序列在生物体外进行快速酶促合成并扩增的技术。1 9 8 5 年，美国科学家p e ( p e r k i ne l m e r 珀金埃尔默) 公司遗传部的d r m u l l i s 及其 同事发明了p c r 技术。由于该技术在理论上和实际应用中都具有十分重要意 义，m u l l i s 于1 9 9 3 年获得了诺贝尔化学奖。此后的二十多年来，p c r 技术及 其衍生技术迅速发展，在核酸检测中得到了广泛的运用。如今，p c r 技术的应 用范围已扩展到基因改造、基因克隆、遗传指纹鉴定、扩展到传染病源分析等， 甚至医学、食品、环境等非生物领域，该技术已经成为最便捷、最准确、应用 最广的分子生物学技术之一。 与传统的生物学方法相比，p c r 技术具有操作简便、省时省力、特异性强、 灵敏度高、对样品的纯度要求低等优点，不仅可用于基因分离克隆的基础研究， 还可应用于任何有d n a 或r n a 的地方。p c r 技术可快速检测样品中的病原微 生物，具有重要的实际意义和应用价值，因而越来越受到人们的关注。 p c r 反应体系主要由引物( 寡核苷酸) 、4 种脱氧核苷酸( d n t p ) 、t a q d n a 聚合酶、靶序列d n a 、m 9 2 + 和p c r 反应缓冲液体系组成。半保留复制和碱基 互补配对原则是p c r 技术得以实现的基础。特定靶序列的一次扩增包括高温解 链、低温退火、中温延伸三个步骤：双链d n a 在高温( 一般为9 4 ) 和多种 酶的作用下解旋形成两条单链，作为扩增的模板；温度降低( 一般为5 5 6 5 ) ， 引物与模板结合；温度适当升高( 一般为7 2 左右) ，游离的脱氧核苷酸在 t a q d n a 聚合酶的作用下按照碱基互补配对原则与d n a 单链配对结合，延伸为 子代的d n