（食品科学专业论文）D塔格糖的化学合成及分离纯化.pdf

摘要 摘要 d - 塔格糖是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀有糖的一种，稀有糖是 指在自然界存在但含量极少的一类单糖。d 塔格糖是果糖的“差向异构体 ，甜度是蔗 糖的9 2 ，甜味与蔗糖相似，不产生不良风味和后味，是一种很好的功能性甜味剂。经 过测试发现d 塔格糖没有毒性和致癌效应，在食品工业上可以安全使用。与蔗糖相比 d 塔格糖具有许多优点：低热量，降血糖、抗龋齿、抗衰老，改善肠道菌群及良好的理 化性质等。 d 塔格糖由半乳糖通过化学法或生物法异构获得，本课题是采用化学催化的方法生 产d 塔格糖。相比于生物催化法，化学法具有反应周期短，成本低，产量高的优点。 通过乳糖酶将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖是一种很好的获得半乳糖的方法。通过o n p g 法测定乳糖酶活性，可得乳糖酶活力为3 0 0 0u m l 。用葡萄糖试剂盒测定乳糖水解率， 结果显示，在最佳条件下，乳糖水解率可达到9 0 以上。 研究了化学法生产d 塔格糖的工艺过程。通过单因素实验，确定了以d 半乳糖为 原料进行化学法合成d 塔格糖的工艺条件为：c a c l 2 ( 催化剂) 的添加量在0 0 1 - - - 0 0 3 m o l l ，反应时间在2 0 - 4 0r a i n ，并用醋酸、c 0 2 、磷酸中和时d 塔格糖产率较高。通 过正交设计实验优化反应条件，最终确定以o 0 2m o l l 的c a c l 2 为催化剂，反应时间3 0 r a i n ，用醋酸中和金属氢氧化物d 塔格糖复合物时，d 塔格糖的产率最高，可达到 4 9 0 5 。但是由于醋酸钙可溶，不易脱盐，故一般用磷酸代替醋酸。 d 塔格糖与d 半乳糖分离对d 塔格糖的产业化是有重要意义的。以化学法合成的 d 一塔格糖为原料，采用c a 2 + 型离子交换层析、阴阳离子交换树脂脱盐脱色的方法分离纯 化d 塔格糖。c a 2 + 型离子交换柱层析条件：柱温7 0 ，流速1 0m l m i n ，进样体积2 0i i l l ， d 塔格糖回收率达到了8 3 ，纯度达到9 0 。经强酸性阳离子和弱碱性阴离子交换树脂 一次串联脱盐脱色，脱盐率达9 3 ，d 塔格糖回收率为8 7 。 采用蒸发浓缩、冷却降温、乙醇结晶、分离和烘干等工艺流程生产结晶d 塔格糖。 结果表明：d 塔格糖5 5 真空浓缩到7 0 8 0o b x ，加入2 倍体积的无水乙醇，在4 冰 箱内放置2 4h ，结晶量为5 2 。通过红外光谱分析，证实分离纯化后的产物是d 塔格 糖。 关键词：d 塔格糖，化学合成，分离，结晶 a b s t r a c t a b s t r a c t d t a g a t o s e ，ar a r en a t u r a lh e x o k e t o s e ，i so n eo ft h er a r es u g a r s ，w h i c ha r ed e f i n e da s m o n o s a c c h a r i d e sa n dt h e i rd e r i v a t i v e st h a tr a r e l ye x i s ti nn a t u r e t a g a t o s ei sac 一4f r u c t o s e e p i m e r , w i t h9 2 o ft h es w e e t n e s so fs u c r o s e i th a sa ne x c e l l e n ts u c r o s el i k et a s t e ，n o a f t e r t a s t eo rp o t e n t i a t i o no fo f f - f l a v o u r , a n dc a nb ec o n s i d e r e da sap o s s i b l ea l t e r n a t i v e b u l k i n gs w e e t e n e r i th a sb e e nt e s t e dt h a td - m g a t o s ec a nb eu s e di nf o o di n d u s t r yg r a s d t a g a t o s eh a sl o w c a l o r i cv a l u e ，a n dn oe f f e c to np l a s m ag l u c o s el e v e l s i na d d i t i o n ，i tc a l l c o n t r o ld e n t a lc a r i e s i m p r o v eh e a l t h yb a c t e r i u ma n ds oo n l a c t o s ew a sh y d r o l y z e db ye n z y m e ，a n dc a t a l y z e dh y d r o l y s i sy i e l d i n gam i x t u r eo f d g a l a c t o s ea n dd g l u c o s e n l el a c t o s ee n z y m ea c t i v i t yw a sm e a s u r e db yt h em e t h o do f o n p qa n dt h ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e d3 0 0 0u m 1 g l u c o s ea s s a yk i tt e s t e d1 a c t o s e h y d r o l y t i c lr a t e a n dt h er e s u l ts h o w e dt h eh y d r o l y t i c lr a t ew a so v e r9 0 i nt h eo p t i m u m c o n d i t i o n t l l i sp a p e rr e s e a r c h e dt h ep r o c e s s e sf o rt h ec o n v e r s i o nf r o mg a l a c t o s et oi s o m e r i c t a g a t o s ew i t hc h e m i c a lc a t a l y z e r ，玎1 ee f f e c to fd i f f e r e n tc a l c i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o n ， r e a c t i o nt i m ea n dn e u t r a l i z e da c i do ny i e l do ft a g a t o s ew a si n v e s t i g a t e db ys i n g l ef a c t o rt e s t s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n d i t i o n , s u c ha sc a l c i u mc h l o r i d e ( o o1 o 0 3m o l l ) ，r e a c t i o n t i m e ( 2 0 - - 4 0m i n ) ，a c e t u m ，c a r b o nd i o x i d e ，p h o s p h a t ea c i dt os y n t h e s i z et a g a t o s ew a s s u i t a b l e t h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o nf o rt a g a t o s es y n t h e s i z a t i o nw a s d e t e r m i n e dt ob e0 0 2m o l lc a l c i u mc h l o r i d e ，3 0m i n ，a c e t u mn e u t r a l i z a t i o n t h ey i e l do f t a g a t o s ew a s4 9 0 5 a sc a l c i u ma c e t a t ec a nb ed i s s o l v e d ，a n dm a k es o m ed i f f i c u l t yf o r d e s a l t ，t h u su s u a l l yp h o s p h a t ea c i dr e p l a c e di t ，n l et e c h n o l o g yo fs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fd - t a g a t o s ew a se s t a b l i s h e da c c o r d i n g t ot h em e t h o d so fd t f o1c a 2 十c a t i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , i o ne x c h a n g er e s i nd e s a l t i n g a n db l e a c h i n g 1 1 l eo p t i m a lc a z + c a t i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n s ：c o l u m n t e m p e r a t u r eo f7 0 ，t h ei n p u tv o l u m eo f2 0m l a n dt h ef l o wv e l o c i t yo f1 0m l m i n ，i nw h i c h t h er e c o v e r yo fd - t a g a t o s ew a s8 3 a n di t sp u r i t yr e a c h e d9 0 d e s a l t i n ga n db l e a c h i n gw i t h a n i o na n dc a t i o ne x c h a n g er e s i ni ns e r i e so n c e ，9 3 s a l tw a sd e s a l i n i z e da n dt h er e c o v e r yo f d - t a g a t o s ew a s8 7 t h et e c h n o l o g yo fc r y s t a l l i z a t i o no fd t a g a t o s ew a se s t a b l i s h e d ，w h i c hu s i n gt h e c o m p o s i t i v ep r o c e s so fv a c u u mc o n c e n t r a t e ，c o o l i n g ，e t h a n o lc r y s t a l l i z a t i o n ，s e p a r a t i o na n d d e s i c c a t i o n t h er e s u l ts h o w e dc r y s t a l l i z a t i o nr a t er e a c h e d5 2 ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o n si s v a c u u mc o n c e n t r a t eo f7 0 8 0o b xw i t h5 5 ，e t h a n o lo fd o u b l ev o l u m e ，s t a y i n go f2 4hi n4 f r o mt h ei n f r a r e ds p e c t r o s c o p ed a t a , i ts h o w e dt h a tt h ec r y s t a lw a sd t a g a t o s e k e y w o r d s ：d - t a g a t o s e ，c h e m i c a ls y n t h e s i s ，s e p a r a t i o n ，c r y s t a l l i z a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：堕! 蜀宣 日期：加召6 o 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：煎! 望霆 导师签名： _ r 名 纱侈钐专 日期：细占6 i o 第一章绪论 第一章绪论 1 1 功能性稀有糖 1 1 1 稀有糖概念 稀有糖是近年来国际上研究功能性甜味剂的一个热点。2 0 0 2 年，在日本香川大学主 办的第二届国际稀有糖会议上，国际稀有糖协会( i s r s ) 把稀有糖定义为“在自然界存 在但含量极少的一类单糖。在随后两届稀有糖国际会议上对稀有糖概念进一步拓展为 “在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”【l 。2 1 。 1 1 2 稀有糖研究现状 稀有糖生物转化主要利用d t a g a t o s e3 - e p i m e r a s e 、a l o d o s er e d u c t a s e 、p o l y o l d e h y d r o g e n a s e 和a l d o s ei s o m e r a s e 等酶作为催化剂，通过对各种单糖( 主要是四碳糖、 五碳糖、六碳糖) 之间的相互转化而获得各种稀有糖。目前研究较多的是五碳和六碳稀 有糖。i z u m o r i n g 研究发现d t a g a t o s e3 - e p i m e r a s e 能催化所有五碳酮糖和六碳酮糖c 3 位上的差向异构体，生成相应的酮糖p 刈。同时还利用这种酶制备出大量不同稀有糖： 从d 果糖差向异构成d 阿洛酮糖1 5 卅；把d 一塔格糖转化成d 山梨糖，还可以催化l - 山梨 糖、l 阿洛酮糖分别生成l 塔格糖和l 果糖【7 j 。a l o d o s er c d u c t a s c 能催化多元醇和酮糖 之间的相互转化，如以g a l a c t i t o l 为底物制备d 塔格糖，而利用其逆反应，可以把d 塔 格糖转化成d 塔圉糖醇o 】、d 阿洛酮糖氧化还原成d 蒜糖醇和d 塔圉糖醇1 1 也】、d 山 梨糖则还原d 艾杜醇【1 3 】。g 埘l s 倘m 【1 4 】等人分离纯化的d 木糖还原酶转化木糖为木糖醇， 而且也能还原d 和l 型阿拉伯糖、核糖和来苏糖；不同来源的a l d o s ei s o m e r a s e 转化六 碳酮糖生成相应的醛糖，b h u i y a n 1 5 - 1 6 j 等人利用l 鼠李糖异构酶分别把d 阿洛酮糖、l 果糖转化成d 一阿洛糖和l 甘露糖；i f i i p a s t i n e n 1 7 j 等人利用d 木糖异构酶转化d 阿洛酮糖 为d 阿洛糖和d 阿卓糖；v u o l a n t o 1 8 】等人研究发现d 木糖异构酶对所有d 和l 型四糖能 进行异构化反应生成各种稀有糖。h u w i g 和t a k e s h i t a t l 9 - 2 0 j 等人利用来自不同细菌g a l a c t i t o l d e h y d r o g e n a s e ，生产l 阿洛酮糖，并研究了l 阿洛酮糖在医药领域中的优良性质。 i z u m o f i n g 根据目前对稀有糖的研究资料，建立了各种稀有糖之间的相互转化及可能的生 产途径，且p l z u m o r i n g 环型理论( 图1 1 ) ，包括四碳糖环、五碳糖环及六碳糖环【2 。目 前主要研究了六碳稀有糖中的d 型，而大多数稀有糖的结构和功能仍没有研究清楚。 近年来科学家致力于研究的稀有糖主要有d 阿洛酮糖( d p s i c o s e ) 、d 阿洛糖 ( d a l l o s e ) 、d 塔格糖( d t a g a t o s e ) 等。日本学者研究发现，d - 5 可洛酮糖和d 阿洛糖具 有重要的生理功能，不但具有甜味剂效应，而且可以抑制肿瘤和保护肝脏，还能作为合 成医药的中间体。目前日本利用果糖通过微生物发酵生产阿洛糖和阿洛酮糖正进行中 试，2 0 0 6 年，m o d m o t o 等人使用连续生物反应器和分离系统，进行大规模制备d 阿洛 酮糖获得成功，相信不久将来工业化产品就能上市【2 2 - 2 4 】。 江南大学硕上学位论文 。、禽毋 ： i v ：擎 ：；垮i 。、孪，一 ：。；j ：冷! j - 1 。 ! 。 图1 1 己糖类的i z o r i n g 麓略 f i gi lh e x o s e s i z u m o r i n gs t r a t e g y 糖的生产可以追溯到公元1 7 世纪，从那时起制糖工业发展迅速。到2 0 0 2 年，全球 的糖产量达到每年1 33 亿吨口“。随着食品、甜食、软饮料中糖的添加量的增加，健康 问题也越来越受到人们的关注，糖尿病、肥胖、癌症和心血管疾病患者每年都在增加。 但是甜味又是人们十分喜爱，日常饮食中不可能缺少的一种调味，如何让人们在享受甜 o 厶 第一章绪论 味的同时远离疾病已成为当今关注的热点。木糖醇的成功应用，使得寻找传统甜味剂的 替代品成为可能。木糖醇是一种五碳多羟化合物，具有对人体有利的性质，如防止龋齿 和治疗儿童中耳炎等。 淀粉、乳清粉、半纤维素等都可以作为工业化生产稀少糖的原材料，从这些原材料 中得到的d 果糖、d 半乳糖和d 木糖等系列单糖，可以应用于稀少糖的生产【2 6 1 。 理论推测自然界约存在5 0 种稀少糖，到目前为止已发现有3 4 种稀少糖，l 型和 d 型各占一半。主要研究的为d 型稀少糖，而多数稀少糖的结构和功能仍没有研究清 楚。 1 1 3 功能性甜味剂 1 1 3 1 功能性甜味剂的定义 除营养( 一次功能) 和感觉( 二次功能) 之外，还具有调节生理活动( 三次功能) 的食品称为功能性食品，进一步明确定义为“其成分对人体能充分显示身体防御功能、 调节生理节律以及预防疾病和促进康复等有关身体调节功能的工程化食品【2 7 1 。 相对应于“功能性食品”( f u n c t i o n a lf o o d s ) 而出现的“功能性甜味剂( f u n c t i o n a l s w e e t e n e r s ) 可定义为“具有特殊生理功能或特殊用途的食品甜味剂，也可理解为“可 代替蔗糖应用在功能性食品中的甜昧剂 【2 引。它包含两层含义： ( 1 ) 最基本的，对健康无不良影响的，解决了多吃蔗糖无益于身体健康的问题。 ( 2 ) 更高层次的，对人体健康起有益的调节或促进的作用。作为一种理想的功能 性甜味剂，需要同时具备：在机体中的代谢途径与胰岛素无关，进入体内后不会引起血 糖波动，可供糖尿病人食用；不是口腔微生物的适宜作用底物，不会引起牙齿龋变，甚 至具有抗龋齿活性；具有某些特殊的生理功能，如促进机体肠道中双歧杆菌的生长繁殖； 绝对的食用安全性；良好的味觉特性，无不良口味或后味；适宜的溶解度与稳定性，以 便在食品工业中的应用；价格适宜，生产成本不能太高等条件。且还需具备以下三点之 一： ( 1 ) 不参与机体代谢，进入体内后将原原本本地排出体外，能量值为零。 ( 2 ) 不被机体消化吸收，代谢方式类似膳食纤维，能量值很低或为零。 ( 3 ) 虽可完全被机体消化吸收，但甜度较大或很大，在正常摄入范围内所提供的 能量值较低或很低。 然而，目前人们已发现的所有功能性甜味剂。尚没有一种能达到这种理想化的要求。 因此，人类对功能性甜味剂的研究与探索，仍在继续进行中。 1 1 3 2 功能性甜味剂的分类 根据上述定义，可将属于功能性甜味剂的产品分类如下【2 8 】： ( 1 ) 功能性单糖，包括高果糖浆、结晶果糖和l 糖等。 ( 2 ) 功能性低聚糖，包括异麦芽酮糖、乳酮糖、棉子糖、大豆低聚糖、低聚果糖、 低聚乳果糖、低聚木糖和低聚异麦芽糖等。 江南大学硕士学位论文 ( 3 ) 多元糖醇，包括赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、异麦 芽糖醇和氢化淀粉水解物等。 ( 4 ) 糖苷，包括甜菊苷、甜菊双糖苷、二氢查耳酮和干草甜素等。 ( 5 ) 二肽，包括甜味素和阿力甜等。 ( 6 ) 蛋白质，包括索马甜、莫奈林和奇异果素等。 ( 7 ) 蔗糖衍生物，例如三氯蔗糖等。 ( 8 ) 人工合成甜味剂，包括糖精、甜蜜素和安赛蜜等。 1 2d 塔格糖功能特性及在食品中的应用 1 2 1d 一塔格糖结构和理化性质 d 塔格糖( d t a g a t o s e ) 属于稀有糖的一种，是一种罕见的天然己酮糖，是d 一半乳 糖醛酮同分异构体，也是d 果糖在c 一4 位置上的差向异构体2 9 1 。分子式为c 6 h 1 2 0 6 ，三者 关系如图1 2 。 ；h o：h 2 0 h 牟hh 阜 h 叶hh o + h 叶o hh + o h c h 2 0 h c h 2 0 h d一半乳糖d塔格糖d果糖 图1 - 2d 半乳糖、d 塔格糖和d 果糖的结构 f i g 1 - 2 咖c t u r e so fd - g a l a c t o s e ，d t a g a t o s ea n dd f r u c t o s e d 塔格糖环式结构： h 彳h 二- o h 一一m - 、- 一_ 彳h 2 0 h | _ 讽hj 觊h d i a g d t o s e w l a n o s e l o l m l d t a g d l o s e f l i ! d l l o g e f o i m i 图卜3d - 塔格糖的环状结构 f i g 1 - 3r i n gs n l 】c n l r eo fd - t a g a t o s e d 塔格糖是一种己酮糖，纯品为白色晶体，熔化温度1 3 3 1 3 7o c ，熔点1 3 4o c ，玻 璃化温度1 5o c 。易溶于水，水溶液清澈无色，微溶于乙醇，溶于水后会引起沸点升高 和冰点降低，但并不吸热，因此不会产生清凉的口感。在p h 3 7 范围内均可稳定存在。 容易发生美拉德反应，在较低温度下即可发生焦糖化反应。甜味类似于蔗糖，而热量值 只有1 5 k c a l g ，相当于蔗糖热量值的3 0 ；1 0 ( w w ) 浓度d 塔格糖甜度为蔗糖的9 2 ， 没有后味也不会产生任何不良风味，是f d a 批准的5 种低能量甜味剂中唯一一个口感、 甜度和蔗糖最相似的甜味剂【3 0 1 。相对而言，d 一塔格糖的甜味刺激较蔗糖快，和果糖相似。 4 第一章绪论 此外，d 塔格糖对强力甜味剂还有很好的协同增效作用，包括甜蜜素、糖精、阿斯巴甜、 安赛蜜、甜菊糖、纽甜和三氯蔗糖等1 3 1 】。 塔格糖首先发现于热带植物s t e r c u l i a ( 一种常青树) 的树胶中，另外苔藓、地衣等 低等植物中也存在少量塔格糖，后来从加热过的牛奶、奶粉、酸奶、奶酪等奶制品中也 检测到塔格糖的存在( 2 8 0 0m g k g ) ，由于牛奶和奶粉在食品加工中普遍使用，因此塔 格糖也普遍存在于各类食品中【3 2 】。 1 2 2d 塔格糖的安佥巨 k r u g e r 3 3 】等人对d 塔格糖进行了9 0d 毒理学和遗传毒理学研究。在9 0d 小鼠实验 中，实验组每天喂食中添加5 、1 0 、15 、2 0 d 塔格糖，研究结果发现：在高剂量 1 5 、2 0 时，实验组部分小鼠有时出现轻微腹泻，而全部实验小鼠体重普遍增加。同 时发现实验组小鼠肝重增加和很小限度肝细胞肥大，而没有发现病理变化。研究认为实 验组肝重增加和肝细胞肥大是对高剂量d 塔格糖的一种适应造成的结果，而5 d 塔格 糖没有产生任何上述不良影响。通过采用五种标准遗传毒理学研究方法，从致癌性、微 粒体、卵巢细胞染色体、淋巴细胞及骨髓微细胞核对d 塔格糖遗传毒理学进行了深入 研究。研究发现在实验剂量内，没有发现变异细胞数量的增加和卵巢细胞染色体变异显 著变化，也没有出现淋巴细胞变异频率的增加和骨髓微细胞核显著变化。所以可以认为 d 塔格糖不会造成慢性和遗传毒理性病变，因此在食品中使用是安全可靠的。2 0 0 1 年， 被美国食品与药物管理局( f d a ) 确定为普遍公认安全食品( g r a s ) 。 1 2 3d 一塔格糖的功能性质 1 2 3 1 低热量 对d 塔格糖产生低能量的原因目前有两种解释阴】：一是d 塔格糖抑制了其它碳水 化合物的吸收，即通过抑制小肠黏膜上相关碳水化合物的转运酶，对小肠黏膜上酶的动 力学研究发现，d 塔格糖抑制了蔗糖转移酶；二是d 塔格糖是一种不易消化吸收的单 糖，许多动物实验发现，d 塔格糖消化吸收率只有2 0 0 , - 2 5 ，d 塔格糖在小肠中只有 很小部分吸收，大部分进入大肠发酵。s a u n d e r s t 3 ”等人利用小鼠研究发现d 塔格糖所提 供的能量远低于蔗糖，而使用c 1 4 标记的d 塔格糖进行代谢研究显示，它在体内和静脉 内的代谢有效能量值为零。由此认为d 塔格糖是一种低能量甚至零能量甜味剂。 1 2 3 2 降血糖 d 塔格糖具有抗糖尿病，减轻高血糖病症等功效。糖尿病患者的血糖水平可升至正 常人的3 - 5 倍，高血糖加速了糖基化作用，一方面加速了人体的衰老，另一方面引起 了一些慢性合并症。食用d 塔格糖能降低血糖水平，因此也能减少一些糖尿病合并症 的发生。d o n n e r l 2 9 】等人研究了单独服用d 塔格糖和结合葡萄糖食用后产生的急性血糖 效应。研究发现无论健康或2 型糖尿病患者服用( 7 5g 人天) d 塔格糖后均没有出现 血糖或胰岛素上升现象。另外研究还发现1 0 位2 型糖尿病患者在食用葡萄糖( 7 5g 人) 前3 0m i n 分别先食用1 0 3 0gd 塔格糖，发现显著减缓了血糖的上升。另外通过对蔗糖、 江南大学硕士学位论文 果糖、乳糖醇、木糖醇和麦芽糖醇食用后血糖生成指数( g i ) 的变化研究，发现食用 d 塔格糖后血糖生成指数增加最小。b u e m a n n 3 6 】等人通过对8 位健康志愿者1 3 服3 0gd 塔格糖后研究，发现同样没有血糖上升和胰岛素分泌增加现象，进一步确认了d 一塔格 糖具有降血糖功能，因而糖尿病人可以放心食用，d 塔格糖显示了在治疗和预防糖尿病 方面的巨大前景。 1 2 3 3 调节肠道菌群 机体所摄入的d 塔格糖有8 0 不能被小肠吸收，这部分不被吸收的d 塔格糖在结肠 中被一些微生物菌群发酵利用，促进有益菌增值，抑制有害菌生长，明显改善肠道菌群， 是一种很好的益生素。同时，d 塔格糖发酵还产生大量有益的短链脂肪酸。尤其是丁酸， 它是结肠上皮细胞的良好能量来源，并被认为在抑制结肠癌、抑制肠道致病菌( 如大肠 杆菌等) 以及促进乳酸菌等有益菌的生长等方面都有良好作用。有研究认为，d 塔格糖 起到明显益生素作用的最低剂量为7 5g 天。并有研究认为，d 塔格糖能起到抑制结肠 癌、抑制肠道致病菌以及促进乳酸菌等有益菌生长的作用【3 7 】。 1 2 3 4 防龋齿 l u 等人从口腔中分离出1 5 种常见的微生物，检测它们在牙齿上形成生物膜的能力， 然后在牙膏中通过添加d 塔格糖来抑制或消除生物膜的形成【3 8 】。在d 塔格糖浓度低于 7 5 0m m o l l ，可以消除6 0 的上述微生物形成的生物膜，而牙膏中常用的保湿剂d 山 梨醇没有发现有消除微生物形成的生物膜的能力。研究发现利用含有d 一塔格糖的牙膏 能有效预防和消除牙斑，同时相应改变了导致牙龈炎的微生物菌落，预示通过在牙膏中 添加d 塔格糖可以控制牙龈炎及其它牙齿疾病。2 0 0 2 年美国f d a 正式确认d 塔格糖 不被口腔细菌分解，不会引起龋齿，同时具有防止牙龈炎等牙齿疾病的能力。 1 2 3 5 抗衰老作用 d 塔格糖具有抗衰老功能。在人体内，非酶促糖基化作用伴随人的一生，是人们体 力与精力衰老的重要原因。糖基化作用机理是将葡萄糖、果糖及其磷酸化合物加于蛋白 质甚至是d n a 上，反应发生在醛氧或酮氧以及暴露的氨基之间，所生产的希夫碱发生 一系列的化学重排，引起蛋白质交联。研究表明，果糖的糖化速率是葡萄糖的l o 倍，而 d 塔格糖仅为葡萄糖的1 2 。基于此，d 塔格糖似有抗衰老的功效【3 9 】。 1 2 3 6 其他功能 另据专利报道m 1 ，d 一塔格糖对促进血液健康十分有利，能增加血液内高密度脂蛋白 一胆固醇( h d l - c h o l e s t e r 0 1 ) 含量，从而有助于防止心血管疾病，同时也有助于提高雌 鼠怀孕的几率并促进母体及胚胎健康。 1 3d 塔格糖的生产制备 6 第一章绪论 1 3 1d 塔格糖的自然分布 自然界中有天然的d 塔格糖被发现存在于酸奶、奶粉和奶酪中，但含量不高，通 常是乳品中乳糖被微生物发酵作用后的产物。有一种热带植物的树胶中含有d 塔格糖 的聚合物，它经水解后，所得的水解液中存在d 塔格糖，经分离精制后可得产品。 1 3 2d 塔格糖的生物转化 生物转化法是利用能够富集d 塔格糖的微生物进行生物代谢，得到一定浓度的d 塔格糖，然后分离精制得到产品。d 塔格糖的生物转化主要利用各种微生物所产生的脱 氢酶和l 阿拉伯糖异构酶进行催化作用。产生脱氢酶的醋酸杆菌( a c e t i ca c i db a c t e r i a ) 经过诱导筛选，使得半乳糖醇脱氢酶的活力和d 塔格糖产率显著提高，在适宜条件下 反应2 4 小时后，d 塔格糖的产量最高达到3 1 6 0m g l t 4 1 1 。但是用半乳糖醇生物转化d 塔格糖存在着很大不足，因为半乳糖醇价格较高，不适宜用作工业化生产的原料。 l 阿拉伯糖异构酶( e c5 3 1 4 l a m b i n o s ei s o m e r a s e ，简称a i ) 是一种胞内酶，能 转化l 阿拉伯糖成l 核酮糖，该酶对l 阿拉伯糖有较高的专一性，但它也能转化其他 糖类，例如d 半乳糖、d 、l 果糖和d 木糖等，使它们异构成酮糖结构。其中很多微生 物来源的灿都能将半乳糖转化生成d 塔格糖，为d 塔格糖的生物转化提供了新的研究 思路。目前有关d 塔格糖的生物转化主要是围绕灿进行，通过菌种选育、转基因表达 和酶分子改性来提高m 耐热性及对半乳糖的底物亲和性，从而提高d 塔格糖的产量【4 2 】。 生物法生产d 塔格糖有许多不利因素，例如酶法生产d 塔格糖的周期长，产量低， 成本高。 1 3 3d 塔格糖的化学合成 塔格糖的化学催化合成包括两种方法。第一种方法是用乳糖为原料，经过乳糖酶水 解作用，异构化，酸中和，结晶等工序完成结晶d 塔格糖成品的生产。另一种方法是 以d 半乳糖为原料，主要包括异构化和酸中和两个步骤1 5 0 1 。但是这两种方法的直接原 料都是半乳糖。 化学催化首先是以可溶性碱金属盐或碱土金属盐为催化剂，使半乳糖与金属氢氧化 物发生异构化反应，生成金属氢氧化物d 塔格糖复合物中间体沉淀。然后，以酸中和 复合物中间体，得到d 塔格糖终产物。半乳糖异构化是d 塔格糖化学合成反应的关键 步骤。异构化反应应在碱性、低温条件下进行；酸中和的目的是生成不溶性金属盐，从 而将d 塔格糖从复合物中间体中释放出来。在加酸过程中，反应体系温度应控制在2 5o c 以下，以避免不利副反应的产生。最后，将d 塔格糖从反应液中结晶过滤出来【4 3 1 。据 报道，国外已经运用化学法生产d 塔格糖，2 0 0 5 年a r l af o o d 公司年产量达到1 2 0 0 吨，而比利时的n u t r i l a b 公司希望到2 0 0 9 年9 月产量达到1 0 0 0 0 吨年。 化学方法有许多不利因素，例如在碱性反应条件下会形成许多副产物和化学污染 物，而形成的众多副产物又使纯化步骤变得复杂。所以近年来，研究人员都在寻找生物 转化的方法来生产d 塔格糖。 7 江南大学硕士学位论文 但是，相比于生物法生产d 塔格糖，化学法也有它自己的优势。首先，适合大规 模生产d 塔格糖，成本比较低，生产周期短：其次，化学法生产d 塔格糖的工艺比较 简单，对设备及环境的要求底，几乎没有什么附带的要求；另外，用这种方法生产d 塔格糖几乎没有副作用，不会对产品造成不利影响。 1 4d 一塔格糖的分离纯化 d 一塔格糖是d 半乳糖的醛酮糖异构体，自然界中极少存在。由于在自然界中含量 极少，d 一塔格糖的大量生产通常通过生物转化1 4 2 】或者化学转化法【4 3 】获得。这两种方法生 产d 塔格糖的直接原料均是d 半乳糖，最终反应产物是d 塔格糖和d 半乳糖的混合物， d 塔格糖与其他单糖之间的分离方法的建立对于d 塔格糖的批量生产将具有重要意义。 但是，国际上对如何分离d 塔格糖与其他单糖尚没有公认的方法，b e a d l e 在1 9 9 2 年的专利中报道【4 3 】用h p l c 分离d 塔格糖，收集样品；fm o n t a n 等人研究将d 塔格糖 从半乳糖的混合溶液中用超临界c 0 2 直接萃取出来【删。另外，刘佐才【4 5 】等人利用c a 2 + 型离子交换树脂层析实现了葡萄糖和果糖的分离，钱永m 】等人用c a 寸型离子交换树脂成 功分离了木糖和木糖醇，其分离的原理主要基于不同单糖成分与c a 2 + 络合程度的差异。 考虑到分离方法的实用性和可操作性，本实验用c a 2 + 型离子交换树脂柱层析分离d 塔 格糖和d 半乳糖，达到较好的效果。在这基础上，用离子交换树脂进行脱盐脱色，使 d 塔格糖的浓度达到9 8 以上。 1 5n - g - 格糖的结晶 所谓结晶就是物质从( 液态液体或熔融体) 或气态形成晶体的过程，是提纯固体物 质的重要方法之一。结晶方法主要可分为两类：( 1 ) 蒸发结晶法即去除一部分溶剂而 产生结晶；( 2 ) 冷却结晶法即不去除溶剂而产生结副4 7 j 。 蒸发结晶法是溶剂一部分蒸发或气化溶液浓缩达到过饱和而结晶，适用于溶解度随 温度下降而减少不多的物质，如氯化钠、氯化钾、碳酸钾等；冷却结晶法是溶液冷却达 到过饱和而结晶，适用于溶解度随温度下降而显著减少的物质，如硝酸钾等。根据实验 探索，在d 塔格糖生产中采用冷却结晶法比较合适。结晶主要分两个阶段即晶核的形 成和晶核的成长，两者通常是同时进行的，但多少也可以独立地加以控制。在介稳区内 只能有极少量的晶核生成，主要是原有晶核的成长，但加入晶种后，可以促使晶核形成 和成长，在不稳区内，晶核的生成与成长可以同时进行。所以，若能控制溶液的过饱和 度，便能控制晶核的数目，从而达到控制晶体大小的目的。在冷却结晶法中，一般说来， 缓慢冷却时，可得到较大和较完整的晶体，而迅速冷却及剧烈搅拌时，往往得到细小的 晶体，结晶操作很慢，一般需要7 2 1 2 0h 4 7 , 4 8 】。 d 塔格糖结晶大致分为三个阶段：( 1 ) 起晶与养晶，冷却结晶法均采用晶体起晶法 准备晶体，一般均采用投种法，需制备晶种，连续结晶采用返回晶种法；( 2 ) 晶体生长， 在有晶种的糖膏中，由于温度降低而达到过饱和状态，d 塔格糖在晶核上析出，使晶体 生长，此阶段结晶时间较长，一般在2 0h 以上。( 3 ) 结晶完全，随着温度的不断下降， 8 第一章绪论 d 塔格糖浓缩液不断达到过饱和状态，待结晶结束，抽滤分离或者离心分离，烘干，得 到d 塔格糖晶体。 1 6 立题背景及意义 甜味剂是一类十分重要的食品添加剂，不同的甜味剂具有不同的甜昧和功能特性， 对产品的色泽、香味、形态、质构和保存起着极其重要的影响。随着人们的物质生活水 平不断提高，由肥胖引起的生理功能障碍的人越来越多，我国2 0 0 0 年糖尿病患者达到 1 4 0 0 万。面对这些生理功能失调的人们，只能提供给他们低热量食品，因此开发安全、 低热量、低吸收品种甜味剂具有较大的市场优势。目前应用于市场的低聚糖包括异构化 乳糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、山梨糖、大豆低聚糖等。糖醇类主要有木糖 醇、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖醇等，这些物质热量低、不刺激胰岛素分泌，能缓解糖 尿病，可防止肥胖、预防龋齿。 2 0 0 2 年世界甜味剂市场规模达到1 0 9 2 亿美元，在食品添加剂市场中占有重要地位。 国际甜味剂发展趋势，今后五年作为新甜味剂的糖醇和强力替代用甜味剂消费量将增加 1 5 。由于甜味剂的应用相当广泛，食品科学家对它进行了深入的探索，发现并开发新 型甜味剂是研究的重点和热点。 d 塔格糖作为甜味剂具有独特的理化特性和生理功能，其甜度是蔗糖的9 2 ，而产 热量只有蔗糖的1 3 ；不能被口腔内细菌利用，不会引起龋齿；在不同食品系统中高剂 量使用时具有健康促进功能，低剂量使用则具有增加和改善风味的功能；不具有肝抗胰 岛素物质反应，抑制糖尿病人血液内葡萄糖浓度：作为医药和医药合成中间体可以用来 治疗贫血和血友病，促进哺乳动物生殖和胎儿发育；具有良好的肠道耐受性，而其它单 糖醇吃多了会导致肠鸣和腹泻；可以有选择的被肠道内的丁酸和乳酸菌利用；可以单独 使用，和其他甜味剂复合使用具有相互促进作用；同时具有良好的理化性质( 如耐热、 耐酸、耐碱、保湿性好等) ，因此适用于焙烤食品、饮料糖果和医药制剂( 如糖浆剂、 咀嚼片等) 中作为天然甜味剂。 2 0 0 1 年美国食品与药物管理局( f d a ) 已正式批准d 塔格糖作为甜味剂用于食品 饮料业以及医药制剂中；j e c f a 第5 7 次会议批准d 塔格糖作为食品添加剂，推荐a d i 值0 8 0m g k g ：欧盟也于2 0 0 5 年1 2 月批准d 塔格糖在欧洲上市；目前d 塔格糖在美 国已被大量用于健康饮料以及酸奶、果汁等产品中作为白糖的代用品。d 塔格糖产品目 前已获得美国、澳大利亚、日本、韩国、新西兰等食品卫生部门批准使用，在我国仍未 获得产业化。 在我国对稀有糖的研究主要集中在赤藓糖醇、木糖醇等成熟的产品，而对阿洛糖、 阿洛酮糖、d 塔格糖的研究几乎为空白。因此紧跟世界食品工业的发展，在我国开展上 述稀有糖的研究，开发拥有自主产权的生产技术显得尤为重要。 另外，由于d 塔格糖的功能特性，使其应用非常广泛，除了可以在一些常规的食 品中应用，比如谷物食品、肉制品、饮料、乳制品、焙烤食品、糖果中应用，还可以作 为糖尿病人的专用甜味剂生产各种糖尿病食品、低糖保健食品以及减肥食品；在医药中 9 江南大学硕士学位论文 塔格糖可用于咀嚼片、咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的粘合剂、洗口药以及口腔 消毒剂等，因此，对d 塔格糖的研究不仅有学术意义，更有商业价值。 因此，本文选取以化学法合成d 一塔格糖为研究对象，通过对d 塔格糖的合成、分 离纯化、结晶的研究，为开发出可取代蔗糖的新型功能性甜味剂打下基础。这对于加快 我国甜味剂市场的发展，完善和加强功能性食品的开发是非常有意义的。 1 7 本课题的研究内容 本课题的主要研究内容有： ( 1 ) 用p 半乳糖苷酶水解乳糖，确定适合的酶反应条件，用葡萄糖试剂盒测定乳 糖水解率。 ( 2 ) 用通过乳糖水解得到的半乳糖，通过化学法生产d 塔格糖。对其生产条件 进行优化，确定合适的反应时间、催化剂种类、浓度以及中和酸的种类等。 ( 3 )分离纯化d 塔格糖，通过c a 型离子交换树脂层析分离，结合薄层层析法 和h p l c 法分析检测，得到较纯的d 塔格糖样品，并将样品通过串联的阴阳离子脱盐 脱色，制备得到纯度更大的d 塔格糖样品。 ( 4 ) 将d 塔格糖样品真空浓缩后，以乙醇为溶剂，冷却结晶得到d 塔格糖晶体。 并初步确定了乙醇结晶的条件，包括溶液纯度、浓度、温度、投种量和乙醇浓度的影响。 1 0 第二章酶法生产d - 半乳糖的研究 第二章酶法生产d 一半乳糖的研究 2 1 前言 d 塔格糖的生产主要是以d 半乳糖为原料，通过生物方法和化学方法进行异构化生 产，也能够利用半乳糖醇氧化成d 塔格糖，m a n z o n i 等进行研究后发现醋酸菌可利用半 乳糖醇作为底物生成d 塔格糖，但是半乳糖醇的价格很高( 5 0 0 - 8 0 0 $ k g ) 1 4 9 1 ，因此， 利用半乳糖醇工业化生产d 塔格糖不可行。 d 塔格糖可以由d 半乳糖通过异构获得，