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姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究 中文摘要 1 磁场中均匀定向纳米粒子的合成与性质研究 在含有0 2t o o ld m 。3 苯胺和1 2t o o ld m 3 盐酸的混合溶液中，在7 8 0mt 磁 场强度下，用恒电位法( o 7v ) 合成了平均直径约为9 5 纳米的均匀定向的聚苯 胺纳米粒子。研究了合成时间和底物材料对聚苯胺膜性质的影响。实验结果表 明：磁场对苯胺的聚合有定向作用。扫描电镜结果表明：在磁场下，可以形成聚 苯胺纳米粒子。循环伏安和交流阻抗结果表明：磁场可以减小电荷传递电阻，增 大聚合物膜的氧化还原电流。红外光谱和紫外光谱用于聚苯胺纳米粒子的表征。 2 基于离子液体中合成的选择性聚苯胺尿酸酶生物传感器 本文首次报道了由高p h 下电活性聚苯胺制得的选择性尿酸酶生物传感器。 在0 5m m o ld m - 3 尿酸溶液中测定了正常生理浓度下电活性干扰物如：对乙酰氨 基酚，谷胱甘肽，半胱氨酸，和抗坏血酸对聚苯胺尿酸酶生物传感器响应电流的 影响。结果表明：这些总众所周知的干扰物对生物传感器的响应电流测定没有显 著影响。测量电势在0 2 0 到0 5 0v 范围内，响应电流随测量电势的增加而增 大。在p h2 1 2 广阔的范围内，响应电流随着p h 值的增加而增大，最适p n 值没有出现。我们分析了聚苯胺尿酸酶生物传感器最佳p h 值没有出现的可能 原因。在尿酸浓度从1 o 1 0 。1 0m m o ld m - 3 范围内，响应电流和尿酸浓度 呈现很好的线性关系。米氏常数量m 是7 s 3m m 0 1d m ，最大响应电流m a x 是 5 8 0 7 肛a 。此生物传感器的响应电流随着温度的升高而增大，活化能既是 4 0 1 8k jt o o l 一。红外，紫外和交流阻抗被用于表征此生物传感器。 2 扬卅大学硕士论文 3 高p 1 值下电活性聚苯胺的葡萄糖生物传感器 本文报道了高p h 下具有良好导电性和电活性聚苯胺为基体固定的葡萄糖氧 化酶生物传感器。电位在0 3 5 v 0 7 0 v 范围内，葡萄糖氧化酶传感器响应电 流随电位的增加而增大。在p h3 0 1 1 0 范围内，酶传感器的响应电流随p h 的增加先增加后减小，最大响应电流出现在p h 约等于8 处。在葡萄糖浓度 5 0 x 1 0 4 1 0 0m m o ld m 3 范围内，响应电流和葡萄糖浓度呈线性关系。最大 响应电流。是2 1 2 8 “a ，表观米氏常数x 。是3 1 5 9m m o ld m 一，酶催化反 应的活化能是3 2 5 8k jt o o l 。紫外光谱，红外光谱和交流阻抗被用于此生物传 感器的表征。 姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究 a b s t r a c t 1 s t u d i e so ns y n t h e s i sa n dp r o p e r t i e so fu n i f o r ma n do r d e r e d p o i y a h ii i n on a n o p a r t i c i e si nt h em a g n e t i cf i e i d i nt h i sp a p e r , t h eu n i f o r ma n do r d e r e dp o l y a n i l i n en a n o p a r t i c l e sw i t ht h ea v e r a g e d i a m e t e ra b o u t9 5 蛳w e r ee l e c t r o p o l y m e r i z e di ns o l u t i o nc o n t a i n i n g0 2r e e ld m 。 a n i l i n ea n d1 2r e e ld r n 3h c lu s i n gt h em e t h o do fc o n s t a n tp o t e n t i a la to 7vj i lt h e p r e s e n c eo fm a g n e t i cf i e l d ( 7 8 0m r ) e f f e c t so f t h em a t e r i a lo fs u b s t r a t ea n dt i m eo n p r o p e r t i e so fp o l y a n i l i n ef i l mw e r ei n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h e m a g n e t i cf i e l dh a so r i e n t a t i o n e f f e c to na n i l i n ep o l y m e r i z a t i o n d i s t i n c ts c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) m o r p h o l o g i e ss h o wp o l y a n i l i n en a n o p a r t i c l e sc a l lb e f o r m e di nt h ep r e s e n c eo ft h em a g n e t i cf i e l d t h ec va n da ci m p e d a n c er e s u l t s i n d i c a t et h em a g n e t i cf i e l dm a k e st h ep o l y m e rf i l mr e d o xc u r r e n tl a r g e ra n dt h ec h a r g e t r a n s f e rr e s i s t a n c e ( 蚴s m a l l e r t h en a n o p a r t i c l e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yf t i rs p e c t r a , u v v i ss p e c t r a 2 s e i e c t i v eu r i c a s eb i o s e r s o fb a s e do np o i y a n iii r es y n t h e s iz e d i ni o n i cl i q u i d t h es e l e c t i v eu r i c a s eb i o s e n s o rp r e p a r e dw i t he l e c t r o a e t i v ep o l y a n i l i n e ( p a n i ) a t h i 曲p hi sf i r s t l yr e p o r t e di nt h i sp a p e r e f f e c t so fe l e c t r o a e t i v ei n t e r f e r e n t s ，s u c ha s a c e t a m i n o p h e n ，g l u t a t h i o n e ，1 - c y s t e i n ea n da s c o r b i ca c i do nt h ec u r r e n tr e s p o n s eo f p a n i - u r i c a s eb i o s e n s o rw e r ee x a m i n e di nt h ep r e s e n c eo ft h e i rp h y s i o l o g i c a ln o r m a l l e v e l sw i t hu r i ca c i dc o n c e n t r a t i o na t0 5m m o ld m 3 t h e s ew e l l k n o w ni n t e r f e r e n t s h a v eb e e ns h o w nt oh a v en om e a s u r a b l ee f f e c to nt h eb i o s e n s o r sc u r r e n tr e s p o n s e i n t h er a n g ef r o m0 2 0t o0 5 0v t h ec u r r e n tr e s p o n s ei n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gp o t e n t i a l i nt h ew i d ep hr a n g ef r o m2t o1 2 ，c u r r e n tr e s p o n s ei n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gp h ，a n d t h eo p t i m u mp hw a sn o ta p p e a r i n g w es u g g e s t e dt h er e a s o nw h yt h eo p t i m u mp ho f t h ep a n i u r i c a s eb i o s e n s o rd o e sn o ta p p e a r t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc u r r e n t r e s p o n s ea n du r i ca c i dc o n c e n t r a t i o ni sg o o dl i n e a ri nt h er a n g ef r o m1 0 x 1 0 。t o1 0 4 扬州大学硕士论文 m m 0 1d m 一t h e m i c h a e l i s _ _ m e n t e nc o n s t 锄t k m i s7 8 3 胁0 1d m 一3 锄dt 1 1 e m a x i m u mc u r r e n tr e s p o n s e m a xi s5 8 0 7 “a t h ec u r r e n tr e s p o n s eo ft h i sb i o s e n s o r i n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gt e m p e r a t u r ea n de ai s4 0 1 8k jm o l l li nt h eb rb u f f e r t h e b i o s e n s o rw a sc h a r a c t e r i z e dw i t hf t 取，u v - v i ss p e c t r aa n da c i m p e d a n c e 3 g i u c o s eb i o s e n s o rb a s e do ne i e c t r o a c t i v ep o ly a n iii r ea th i g h d h t h eu s eo fh i g h l yc o n d u c t i n ga n de l e c t r o a c t i v ep o l y a n i l i n e ( p a n da th i 曲p h 鹋 s u b s t r a t et oi m m o b i l i z eg l u c o s eo x i d a s ei s f i r s t l yr e p o r t e di nt h i sp a p e r i ti sf o u n dt h e b i o s e n s o r h a sa l a r g e rr e s p o n s ec u r r e n tc o m p a r e dw i t hb i o s e n s o r sp r e p a r e dw i t h c o n t r o lp a n is y n t h e s i z e di np r o t o na c i ds o l u t i o n i nt h er a n g ef r o mo 3 5t oo 7 0v t h e r e s p o n s ec u r r e n ti n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gp o t e n t i a l i nt h ew i d ep hr a n g ef r o m3 0 t o11 0 ，t h er e s p o n s ec u r r e n tf i r s ti n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gp h ，t h e nd e c r e a s e d ，a n d t h em a x n n l l l ur e s p o n s ec u r r e n to c c u r r e da ta b o u tp h8 0 t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n r e s p o n s ec u r r e n ta n dt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni sg o o dl i n e a ri nt h er a n g ef r o mo 0 0 5 t o1 0 0m m 0 1d m 一t h em i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a l l t 足。 i s31 5 9m m 0 1d m 一3 舭d t h em a x i m u mr e s p o n s ec u r r e n tl i s2 1 2 8 i i a t h er e s p o n s ec u r r e n to ft h i s b i o s e n s o ri n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e ，a n de ai s3 2 5 8k jm o l 1i nt h e b 求b u f f e r t h eb i o s e n s o rw a sc h a r a c t e r i z e dw i t hf t i r u v - v i ss p e c t r aa n da c i m p e d a n c e 姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究 1 1 导电高聚物 1 1 1 导电高聚物简介 第一章绪言 高聚物是种随处可见而又平淡无奇的物质，一向被认为导电性能很差， 常用作绝缘材料。自1 9 7 7 年s h i r a k a w a 等【1 - 2 1 发现，用h 掺杂的聚乙炔( p a ) 具 有明显的导电性，电导率从l o - 9s0 1 1 1 0 增加到1 0 3s0 1 1 1 一，新型交叉学科导电高 聚物领域就诞生了，并愈来愈显示了它的广阔前景。它的出现不仅打破了有机高 聚物都是绝缘体的传统概念，而且开创了导电高聚物的研究领域，诱发了世界范 围内导电高聚物的研究热潮，因而，具有重要的科学意义和应用前景。2 0 0 0 年 l o 月，瑞典皇家科学院将2 0 0 0 年的诺贝尔化学奖授予a j h e e g e r , a g m a c d i a r m i d 和h s h i r a k a w a ，以表彰他们在导电高聚物的发现和发展方面作出的 开创性的巨大贡献。这对导电高聚物研究者们来说是一个极大的鼓舞。 所谓导电高聚物是由一些具有共轭兀键的高聚物经化学或电化学“掺杂”后形 成的、电导率可从绝缘体延伸到导体范围的一类高聚物材料 3 - 5 。大量的研究表 明，许多共轭高聚物经掺杂后都能变为具有不同导电性的导电高聚物，具有代表 性的导电高聚物有聚乙炔闻，聚苯胺( p a n ) 7 - 9 1 。聚吡咯( p p y ) 1 0 - 1 3 等。目前，很多 新型导电高聚物不断被合成出来。导电高聚物的突出优点是既具有金属和无机半 导体的电学和光学特性，又具有有机高聚物柔韧的机械性能和可加工性；还具有 电化学氧化和还原活性。导电高聚物已有约3 0 年的历史，它经久不衰，其原因 是：( 1 ) 它具有特异的物理化学性能，尤其它的室温电导率可在绝缘体一半导体一 台r n 态0 0 - 9 - 1 0 5sb - * i n l ) 宽广的范围内变化，这是目前任何其它材料无法比拟的。 ( 2 ) 掺杂脱掺杂完全可逆。( 3 ) 结构和性能的可控性。( 4 ) 具有一般高聚物的特性， 如质轻和可加工等【1 4 】。 1 1 2 导电高聚物结构特征和导电机理 导电高聚物材料是具有共轭扛键的高聚物，离域的，【电子云在高聚物的长链 6 扬州大学硕士论文 中有较大的位移空间，受电场作用时定向极化而形成电流。导电高聚物材料包括 本征导电高聚物( 未掺杂的导电高聚物) 和掺杂导电高聚物，使本征导电高聚物含 有正离子的过程称为p 型掺杂；含有负离子的过程称为n 型掺杂 1 ”。导电高聚物 的导电机理既不同于金属。又不同于无机半导体。金属是靠自由电子导电，半导 体是靠电子和空穴导电，导电高聚物是靠孤子、极化子和双极化子导电。由于导 电高聚物具有 g 电子共轭结构，因此导电高聚物具有快速响应( l o d 3s ) 特点。 根据掺杂浓度的不同，高聚物材料可在绝缘体、半导体和金属导体范围内 变化。在聚苯胺中，“掺杂”有两种不同形式，“氧化还原掺杂”是通过加入氧化剂 和还原剂使其骨架中的电子迁移发生改变；酸或碱“质子化掺杂”则使其中电子数 保持不变，只是质子进入聚苯胺链使链带正电。为了维持电中性对阴离子也进入 聚苯胺主链 1 6 1 。经质子酸掺杂的p a n i 又与碱反应，可变成绝缘体。这种掺杂、 反掺杂反应在水相、有机相都可以进行并且可逆。聚苯胺的主要掺杂点是亚胺氮 原子，且苯二胺和醌二亚胺必须同时存在才能保证有效的质子酸掺杂。 聚苯胺的基本组成结构形式如下： 呕兮 虬岛。心喊( 。y 1 ) y 代表p a n i 的氧化程度，当y = l 时，为完全还原的全苯式结构：当y = 0 时， 为“苯一醌”交替结构；完全还原型和完全氧化型都为绝缘体。当y = 0 5 时，为苯 醌比是3 ：l 的半氧化半还原结构，掺杂后导电性最好【1 7 】。完全还原及完全氧化态 的聚苯胺在空气中会逐渐氧化或还原成较稳定且接近中间氧化态的聚苯胺。各形 态间的转换，如图1 1 所示【”】，聚苯胺的碱式形态( e b ) 经质子酸掺杂即得盐 式中间氧化态聚苯胺，一般认为质子酸掺杂发生在氧化单元的氮( i m i n e ) 上，形 成双极化子( b i p o l a r o n ) 结构： e h 卜n h 卜葑u 一壬2 n a 。 b i p o l a r o n 再经过分子内氧化还原反应形成极化子( p o l a r o n ) 的结构： 姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究7 廿n h 心扣一诊需h 壬2 以。 p o l a r o n 经加工处理去掺杂，又可以得到不导电的e b ，此掺杂去掺杂的步骤可以反 复进行，聚苯胺的导电性也可在导体绝缘体两种形态间转换，其颜色也在绿色 蓝色间变化。 e m e r a l d i n es a l t ( g r e e n ) 甏 + ：譬掣 + 2 矿2 旷 杀驴叫茹毒砷 图1 1 聚苯胺在不同形态间的变化 1 1 3 导电高聚物的应用 自7 0 年代末导电高聚物出现以来，由于其具有特殊的结构和优异的物理化学 性能而倍受各领域科学工作者的关注。导电高聚物在能源、光电子器件、信息、 传感器、分子导线和分子器件以及电磁屏蔽、金属防腐和隐身技术上有着广泛、 诱人的应用前景。近几年来，在组织工程上，为支持和刺激组织生长而进行的控 制药物传递和应用引起了广泛的关注。但是这种类型的功能材料很难选择，材料 必须是安全的，不会引起额外的免疫反应，拥有可接受的生物适应性，无毒，而 且可以被腐蚀。另一方面，材料必须具有适当的力学性质，方便于加工成高表面 积的气孔状结构。综合以上特征的材料可以被划分成两大类：天然聚合物，包括 藻酸盐，胶原质，壳聚糖和凝胶以及合成聚合物，包括聚酯，聚丙烯酸盐，和它 9 萎一 瓣七 8扬卅i 大学硕士论文 们的共聚物等【1 叼。将导电高聚物材料应用于传感器的研究始于8 0 年代末。以聚吡 咯( p p y ) 、聚苯胺( p a n l ) 、聚噻吩( p t h ) 为典型的导电高聚物，由于具有较低的成 本、较好的导电性、光电性、热电性、可以方便地沉积在各种基片上、可与其它 功能材料共聚或复合、可在常温或低温使用等优点，因而受到传感器研究者的青 睐【2 0 】。 导电高聚物固定酶具有以下优点【2 l 】：( 1 ) 、采用电化学聚合技术，酶可以很好 地包埋在高聚物膜内，生成的酶膜厚度均一、重现性好、与电极表面的粘附力 强，同时高聚物膜的厚度和高聚物上修饰酶的量易于调控，从而可能制备重现性 好的传感器；( 2 ) 、方法简单，高聚物合成和酶的固定化可一步完成，同时使用不 同的单体可得到具备不同导电性和电化学活性的酶膜；( 3 ) 、高聚物膜严格地在电 极的有限表面上形成，有利于在微电极和阵列电极上酶的固定；( 4 ) 、不少高聚物膜 具有选择性透过某些物质的功能，采用高聚物固定酶可以降低干扰；( 5 ) 、可采用 不同的酶方便地构建多层结构；( 6 ) 、可以通过改变高聚物的氧化还原态，调节酶 的生物反应活性。目前用于固定酶的导电高聚物主要有聚毗咯( p p v ) 、聚苯胺 ( p a n i ) 、聚噻吩( p t h ) 等。p a n i 具有良好的导电性、电化学活性和变色性，在空 气和水溶液中有着很高的稳定性，因此广泛用于酶的固定 2 2 2 4 。目前，用导电高 聚物固定酶的最大挑战是理解构造中的电子传递机理，和电极表面的双电层以及 聚合物表面的物质传递过程。 1 2 生物传感器 1 2 1 生物传感器概述 生物传感器的研究开始于2 0 世纪6 0 年代，自c l a r k 和l y o n s 第一次成功地 将“酶”与“电极”结合起来，形生了酶电极的雏形。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 研制 了世界上第一支葡萄糖传感器，自此各种类型的生物传感器相应问世，特别是近 二十年来生物传感器得到了飞速地发展【2 5 之7 】。 随着信息技术与生物工程技术的发展，生物传感器在医学领域中越来越具有 旺盛的生命力和广阔的应用前景。生物传感器是生物技术、材料技术、电子技术 等交叉结合而形成的新兴高科技产品，在临床医学和预防医学领域都有广泛的应 姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究 9 用，在医学发展中举足轻重。近年来生物传感器在医学中的应用越来越广泛，可 动态监测人体血压、体温、血液酸碱度、血氧含量；也可检测酶活性、蛋白质等 生化指标；在基因检测、药物分析、环境污染物监测等方面的研究则更为活跃， 生物传感器推动了现代医学已为世界所公认 2 8 , 2 9 1 。m a l h o t r ae ta 1 报道了生物传感 器的新发展，以及它们在食品分析，环境控制，医疗检测，药物和农业工业中的 新应用 3 0 1 。a d h i k a r ie ta 1 讨论了不同材料在传感器方面的应用，报道了聚合物在 传感器机制上所起的作用【3 1 】。k a o t i te ta 1 制备了一种可以快速简易测量浓度在 p p m 下莠去津含量生物传感器，这个技术包括阳极电聚合聚吡咯( p p y ) 过程中 同时固定多酚氧化酶( p p o ) 1 3 ”。w o t o w a c z 等人报道了一种把g o x 固定在聚吡咯 中的新方法 3 3 1 。b a r t l e t t 等人电化学聚合苯酚及其衍生物，然后利用它们把g o x 固 定在铂片电极表面。产物膜很薄，能控制包埋在其中的亚铁铁氰化物的含量。这 个膜对葡萄糖的氧化有催化作用，因此可以用来检测包埋在膜内的g o x 与葡萄糖 反应所产生的过氧化氢。对不同的酚膜，响应时间类似，都小于4s 【3 4 1 。 生物传感器可以从以下几个角度来进行分类： 】w o l f b e i s 认为生物传感器和化学传感器一样，都是基于电化学或光学传感的原 理，原则上可分为电化学式和光学式两大类。其中电化学式包括电位式、电流式 和电导式，光学式包括吸光式、反光式和发光式； 2 根据传感器输出信号的产生方式可分为：生物亲和型、代谢型和催化型。生 物亲和型生物传感器利用抗原与抗体间专一性识别或键合性质来对抗原、半抗原 或抗体进行检测，它检测的是热力学平衡的结果。而催化型生物传感器则利用酶 专一性和催化性，在接近中性和室温条件下对酶作用的底物进行检测，它检测的 是整个反应动力学过程的总效应； 3 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质可分为：酶传感器、微生 物传感器、组织传感器、基因传感器和免疫传感器等； 4 根据生物传感器的信号转换器类型可分为；电极式、热敏电阻式、离子场效 应晶体管式、压电晶体式、表面声波式和光纤式等。无论是基于电化学、光学、 热学还是压电晶体等不同类型的生物传感器，其基本原理都是将感应器上进行生 化反应中消耗和生成的化学物质或产生的光热等通过转换器变为电信号，最后把 所得的电信号经过电子技术处理后在仪器上显示或记录下来。 生物传感器大体上可以分为三代【3 6 】： 1 0 扬州大学硕士论文 ( 1 ) 一代生物传感器；反应产物直接扩散到变换器产生电化学响应。 二n a l y 恤协，茜三e n z y m e 父熬!协肉淼，入。$ ： ( 2 ) 第二代生物传感器：在反应物和变换器之间加了特殊的中继体，可以产生 更大的响应。二代生物传感器包含两个步骤：首先，在酶和底物之间有一 个氧化还原反应，它是由中继体的再氧化形成的；然后，中继体再被电极 氧化。 州analy砖ee e 未n z y m e ，人恸m 耋e d i a t o r 上 ( 3 ) 第三代生物传感器：起源于传感器独立的本质，即：反应自身产生响应，不 包含产物或中继体的扩散。第三代生物传感器包括酶和中继体共同固定在电 极表面，使得生物识别成分成为电极变换体的一个部分，如，酶与电极的直 接电接触。由于既不需要加入中继体也不需要加入酶，这种设计简化了重复 测量。 姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究1 1 1 2 2 酶的固定化方法 一次连续或半连续的常规酶法分析往往需要大量的酶试剂。这些酶由于不 能被重复使用而造成浪费，同时酶的价格比较昂贵，因而分析成本较高。如果能 找到一种方法，既能保持酶所特有的催化活性，又得到不溶于水的性能稳定的酶 标准品，是最为理想的。而固定化酶就能实现这一目的。另外，固定化酶对研究 酶催化反应和生产都带来很大方便，因此，有必要研究酶的固定化。 酶大致可分为天然酶和修饰酶。固定化酶属于修饰酶。固定化酶分为包埋 型和结合型。包埋型酶自身不会发生结合反应，这是用一种不溶于水的半透膜高 分子材料将酶包裹起来而制成的。属于包埋型的酶还有格子型和微胶囊型。结合 型则是采用任意方法使酶成为不溶性的结合体，根据结合的形式不同，又分为吸 附型和共价结合型。 关于酶的固定化方法如前所述，较合理的方法大致有下列三种： 1 ) 载体结合法：即将酶固定在非水溶性载体上。 2 ) 交联法：即使酶与带两个以上的多官能团试剂( 双官能团的或多官能团 的) 进行交联。 3 ) 包埋法：即将酶包裹于凝胶的微小格子内或半透膜高聚物的超滤膜内。 包埋法包括格子型和微胶囊型。 酶固定化方法的分类如下图： 酶的固定化 载体结仓法交联法包埋法 厂_ r 广k 1 共价结合法离子结会泫 物理破附法格予型 微胶囊法 酶的固定化方法 具体示意图如下： 1 2 扬州大学硕士论文 肇鲞黼鼬 载体结合法胶联法格子型微胶囊璎 导电高聚物通常用电解法聚合到惰性电极上。一般有两种方法，即“一步 法”和“两步法”，前者首先由英国的p n b a r t l e t t 教授提出，后者首先由我校 的穆绍林教授提出。 “一步法”是指在聚合前将酶与单体、支持电解液混合，在电极上电解生成导 电高聚物膜的同时，将酶包裹于高聚物中【”3 9 】。这种方法的优势是简单、价廉， 缺点是单体和聚合时所用介质常严重影响酶的活性 4 0 4 “。其流程示意图如下： 一步法固定酶示意图 “两步法”克服了这一缺点，它是将单体( 苯胺或吡咯) 先在酸性溶液中进行 电化学聚合，在铂金电极上形成一层牢固的有结合力的高聚物膜降”。再根据酶 姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究 1 3 的等电点调节溶液的p h ，利用导电聚合物的掺杂和去掺杂性质将酶固定在高聚 物膜中。穆绍林等【4 2 “】采用此法以聚苯胺或聚吡咯为载体材料先后制成了葡萄 糖、脲酸、黄嘌呤、半乳糖、胆固醇、抗坏血酸、肌氨酸、过氧化氢等传感器。 “两步法”可以避免在形成生物传感器过程中因激烈的反应而导致酶的活性受到影 响。但“两步法”固定酶受导电高聚物粒子间距离的影响，对粒子间距离小于酶分 子粒径的导电高聚物，酶分子只能附着在导电高聚物的表面，这将导致测试过程 中酶易从导电高聚物膜中脱附，使酶传感器的稳定性受到明显影响。 两步法固定酶示意图 另一种方法是由扬州大学阚锦晴等提出的“模板法” 4 5 - 4 8 。此法是“一步法和 “两步法”的结合。这种方法先用“一步法”制备酶电极，然后将制得的酶电极在6 m o ld i n - 3 盐酸溶液中回流2 4 小时使酶电极中的酶充分水解，从高聚物膜中脱离 并留下与酶分子大小相近的孔隙，从而获得了固定酶的模板。最后将有活性的酶 重新固定进此高聚物模板中。采用这种方法克服了前面所述的“一步法”和“两步 法”的不足之处。制得的酶传感器不仅有良好的电化学性能，而且有高的稳定 性。 1 4扬州大学硕士论文 1 2 3 导电高聚物生物传感器的工作原理 模板法固定酶示意图 导电高聚物生物传感器主要是用导电高聚物为载体或包覆材料固定生物活 性成分( 酶、抗原、抗体、微生物等) ，并以此作为敏感元件，再与适当的信号转 换和检测装置结合而成的器件。其基本组成和工作原理如下图所示。 姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究1 5 琴图一圈一图 性电扳 1 2 4 酶传感器测定响应电流干扰的消除 2 0 世纪7 0 年代，诞生了测定血液游离物质含量的电化学生物传感器。由于它 具有选择性高、操作简单、成本低廉、可反复使用等特点，因此，逐渐得到社会 各界的广泛重视。近年来，生物传感器应用研究日益增多，研究重点都集中在电 极的修饰上【4 9 】，但都由于抗干扰性差、线性范围窄、响应时间长或使用寿命短 等因素，在临床检测应用上受到限制。血液中易于氧化的物质，如抗坏血酸等在 电极表面发生氧化反应，对测定产生干扰【5 0 1 。因此，消除干扰是传感器研究中重 点之一。 已报道的消除干扰的方法可大致归纳为五类。第一类，用一选择性渗透膜 来阻止干扰物到达电极表面，而只允许底物分子通过 5 1 - s 5 】。此方法的缺陷是：选 择性渗透膜的选择犹如大海捞针，非常耗时和昂贵：消除干扰的效果并不是十分 理想，还会有一些干扰物到达电极表面，对测定结果产生影响。第二类是在测量 体系中或固定材料中加入电子中继体来降低检测电压，使干扰物不被氧化 5 6 - 6 1 】。 但是电子中继体难以选择。第三类是将干扰物预氧化。包括电化学和化学预氧化 法( 后者加入不参与电极反应的氧化剂使干扰物先氧化掉) 慨6 3 1 。第四类是使用 纳米颗粒大幅度地提高固定化酶的催化活性，增加电极的电流响应灵敏度，改迸 生物传感器的抗干扰性能，提高信噪比嗍，6 5 】。第五类是化学放大法：添加被固 定酶的激活剂，提高被测物的电化学响应( 可将原液稀释，使干扰物的电化学响 应降到可忽略程度) 。还有添加干扰物的抑制剂或屏蔽剂等等。 c h e n 等设计了一种新型的双工作电极体系来消除杂质干扰，该法不仅能有 溷舱 恸t 警i l 玎眙 如。o 一 敏导 扬卅【大学硕士论文 效地消除干扰，且制作简单易行，该法如下图所示 i 双工作电极工作原理示意图 ( 1 ) 、基于电势控制放大器的恒电位系统；( 2 ) 、电解池；( 3 ) 、电流差减器。 w i ：p p y - g o d 电极；w 2 ：p p y 电极：c ：辅助电极； r ：参比电极； i = 1 w 1 一1 w 2 。 双工作电极包含一支含酶的膜电极和一支无酶的膜电极，在两支工作电极上 加相同的电位，它们的响应电流差值直接显示在精密双恒电位仪上。因为两聚吡 咯膜是相同的，由不纯物引起的干扰电流在两支工作电极上也是相同的。当体系 中只有干扰物时，两支工作电极上的干扰电流差值为零。当双工作电极体系被置 入含有底物的缓冲溶液中，酶电极上所测的响应电流包含酶催化反应的响应电流 和干扰反应的响应电流，而膜电极上只有干扰反应的响应电流，他们之间的差值 即为纯的酶催化反应的响应电流。 由于酶传感器常常用于复杂体系的检测和分析，如果测定的电位过高，则干 扰物( 如抗坏血酸等杂质) 会对其应用有一定的干扰。若在酶传感器中加入能促进 酶催化反应的电子中继体，则可以使其测定电位降低。自从2 0 年前c a s s 等人 首次报道了含电子中继体的酶电极 6 7 1 ，这样的酶传感器一直受到研究者的广泛 关注。二茂铁及其衍生物可以被可逆的氧化和还原，因而它们可以作为酶催化反 应的电荷转移中继体，据文献报道，二茂铁及其衍生物可将酶传感器的测定电位 降低，从而有效地降低抗坏血酸等杂质的干扰。 苯胺邻氨基苯酚共聚物具有良好的性能，k a n 等人将其作为制备尿酸酶传 感器的载体。由扫描电镜的实验结果可知：具有适合固定尿酸酶孔隙的共聚物膜 姜燕导电高聚物合成及生物传感器研究1 7 被获得。更多的有活性的酶能够被固定进这个模板中，并且传感器的响应电流更 大。通过连续测定，由“模板法”制得的共聚物尿酸酶传感器具有良好的稳定性。 由实验测定二茂铁苯胺邻氨基苯酚共聚物尿酸酶传感器的测定电位可降至 o 2 5 v ，从而可以有效地排除。抗坏血酸的影响。他们工作中所得活化能小于文 献报道值，这有利于酶催化反应的进行。由紫外光谱和红外光谱以及扫描电镜可 知：由“模板法”尿酸酶能很好地掺杂进共聚物膜中。由温度、p h 与响应电流之 间的关系可知，苯胺邻氨基苯酚共聚物能更好地保护尿酸酶。 1 3 本论文的研究内容 1 改进合成条件。外加磁场能影响材料的分子或电子自旋态，能够改变分子 取向。本文中在磁场且没有任何化学添加剂和模板条件下，电化学合成排布规则 大小均一的聚苯胺纳米粒子，研究了其性质及磁场、电极材料、聚合时间等对其 的影响。 2 改进固定材料。聚苯胺是常规的固定材料，在本文中对聚苯胺的合成进 行了改进，在离子液体中合成的高p h 值下电活性本征态聚苯胺，用它制得的 尿酸酶生物传感器，不但具有较大的响应电流，而且具有很高的选择性，能有效 消除常见电活性物质的干扰。 参考文献 【l 】1a e d i a z , j i c a s t i l l o ，j a l o g a n ，w y l c e ，e l e c t r o c h e m i s t r yo fc o n d u c t i n gp o l y p y r r o l ef i l m s ， j e l e c t r o a n 础c h e m 1 2 9 ( 1 9 8 01 1 5 - 1 3 2 【2 】c e b r o w n , p k o v a c i c ，c a w i l k i e ，j a k i n s i n g e r , r e ，h e i n , s i ，y a n i g e r , r b c o d y ， p o l y n u c l e a ra n dh a l o g e n a t e ds u u c t u r e si np o l y p h e n y l e n e ss y n t h e s i z e df r o mb e l l z e n c ，b i p h e n y l a n dp - t e r p h e n y lu n d e rv a r i o u sc o n d i t i o n s ：c h a r a c t e r i z a t i o nb yl a s e rd e s o r p t i o n f o u r i e r w a r t s f o r mm a s ss p e c t r o m e t r y , j o u r n a lo f p o l y m e r s c i e n c e , p a a ：p o l y m e rc h e ，l i s t r y ，2 4 ( 2 ) ( 1 9 8 旬5 5 6 7 【3 】h s h i r a k a w a , e j l o u i s ，a g m a c d i a r m i d , c i c c h i a n g , a j h e e g e r , s y n t h e s i so fe l e c t r i c a l l y l s扬州大学硕士论文 c o n d u c t i n go r g a n i cp o l y m e r s ：h a l o g e nd e r i v a t i v e so fp o l y a c e t y l e n e ， h ) x j c h e m s o c c h e n c o m m u n ，1 6 ( 1 9 7 7 ) 5 7 8 4 】n b a s e s c u ，z x l i u ，d m o s e s ，a j h e e g e r ，h n a a r m a n n ，n t h e o p h i l o u ，h i g h e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t yi nd o p e dp o l y a c e t y l e n e ，n a t u r e ，3 2 7 ( 1 9 8 7 ) 4 0 3 - 4 0 5 【5 e n b a r t l e t t , p r b i r k i n ，f p a l r a i s a n o ，g d b e n c d e t t o ，e l e c t r o a c t i v i t y , s t a b i l i t ya n da p p l i c a t i o ni n a l le n z y m es w i t c ha t p h7 o f p o l y ( a n i l i n e ) - p o l y ( s t y r e n e s u l f o n a t e ) c o m p o s i t ef i l m s ， 上c h e r m s o e f a r a d a yt r a n s ，9 2 ( 1 9 9 6 _ ) 4 1 3 7 - 4 1 4 3 【6 】m m a ，h l i u ，j x u , y l i ，y w a n ，e l e c t r o c h e m i c a lp o l y m e r i z a t i o no fo - d i h y d r o x y b e n ea n d c h a r a c t e r i z a t i o no fi t sp o l y m e r sa sp o l y a c e t y l e n ed e r i v a t i v e s ，j o u r n a lo f p h y s i c a lc h e m i s t r y c1 1 1 ( 1 8 ) ( 2 0 0 7 ) 6 8 8 9 - 6 8 9 6 【7 】s d p a t i l ，s c r a g i l a v e n d f a m r e v a n s i d d a p p a , e n a r s i m h a , m v n a p r a s a d ，s y n t h e s i s ， t r a n s p o r ta n dd i e l e c t r i cp r o p e r t i e so fp o l y a n i l i n e c 0 3 0 4c o m p o s i t e s ，b u l l e t i no f m a t e r i a l s s c i e n c e , 3 0 ( 2 ) ( 2 0 0 7 ) 8 9 9 2 【8 jl c f o l g u e r a s ，e l n o h a r a , r f a e 弓m ，c ，r e z e n d e ，d i e l e c t r i cm i c r o w a v ea b s o r b i n gm a t e r i a l p r o c e s s e db yi m p r e g n a t i o no fc a r b o nf i b e rf a b f i cw i t hp o l y a n i l i n e ，m a t e r i a l sr e s e a r c h ( s a o c a r l o s , b r a