（化学工艺专业论文）化妆品天然乳化剂的研究.pdf

摘要 摘要 本课题主要完成了大豆磷脂的分离提纯、酶水解改性及其改性产物性能测定 以及使用大豆磷脂制各维生素c 脂质体的研究。 采用浓缩大豆磷脂为原料，探索了以乙醇、乙酸乙酯、异丙醇作为溶剂以及 使用无机盐沉淀方法提取大豆磷脂主要乳化成分磷脂酰胆碱的工艺条件。最终确 定以乙醇作为提取溶剂，提取温度为4 5 ( 士1 ) ，料液比为1 ：4 ，提取次数为 6 次，磷脂酰胆碱在提取物中的百分含量达到4 5 以上，提取率在8 0 以上。 使用提纯后的产物进行酶水解改性的研究，其最优条件是：反应温度为3 8 ( - 4 - 1 ) 、反应时间为7 h 、酶的用量为1 0 0 i u m l 、钙离子的浓度为0 0 2 5 m l 、 缓冲液的p n 值为8 5 0 、底物浓度为1 0 o 。在最佳水解反应条件下所测得的酸 价为5 5 0 3 m g k o h g ，水解率在8 7 6 - 9 4 o 。 经硅胶柱层析分离可以得到不同极性的三类磷脂，担体与待分离物的比例为 1 0 0 ：1 。采用梯度洗脱方式进行分离，洗脱剂的条件是氯仿与甲醇的比例由l ：1 改变至1 ：2 到1 ：4 ，直至用甲醇洗脱。分别得到未知组分磷脂、卵磷脂以及溶血 磷脂的浓缩液。未知组分磷脂的高效液相色谱峰面积经归一化计算后达到 9 6 3 2 ，溶血磷脂的含量达到了6 7 5 2 。 采用r k g u p t a 法测定溶血磷脂的h l b 值为9 ，与水解前的磷脂相比提高 5 0 ，乳化稳定性与市售非离子乳化剂乳化效果相似。 采用薄膜分散超声乳化法制备，以包封率为考察指标，经正交优化选择， 确定脂质体的最佳配方：卵磷脂胆固醇维生素e 的摩尔比为4 ：2 ：0 3 4 ：维生 素c 的浓度为3 3 m g m l ：p b s 缓冲液的p h 值为7 9 3 ：成膜时所用氯仿的量为 2 5 m l ，此时包封率可达5 8 3 2 。用扫描电子显微镜观察脂质体的结构，平均粒 径为3 1 0 a m 。经脂质体包裹以后，维生素c 的稳定性增强。 关键词：乳化剂大豆磷脂磷脂酰胆碱溶血磷脂磷脂酶a 2 脂质体维 生素c 化妆品 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ee x t r a c t e dp h o s p h a t i d y l c h o l i n ef r o ms o y b c a np h o s p h o l i p d sa n dm o d i f i e d p h o s p h a t i d y l c h o l i n ew i t hp h o s p h o l i p a s e a 2 t e s t e dm o d i f i e dp r o d u c t se m u l s i f y i n g p r o p e r t i e sa n dr e s e a c h e do nt h ep r e p a r a t i o no fv i t r a i n cl i p o s o m em a d eb ys o y b c a n p h o s p h o l i p i d s p h o s p h a t i d y l c h o l i n ew a se x t r a c t e df r o ms o y b c a np h o s p h o l i p d sa n da l c o h o l 、e t h y l a e t a t e 、i s o p r o p a n o l a s o p t i m a l v e n t a n d i n o r g a n i cs a l tp r e c i p i t a t em e t h o d r e s p e e t u v e l y t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so ft h ee x t r a c tw e r e ：a l c h o h o la se x t r a c ts o l v e n t a n di t sv a l u m ew a s4t i m e st ot h es o y b c a np h o s p h o l i p d sw e i g h ta t4 5 ( 士1 ) f o r6 t i m e s t h ep h o s p h a t i d y l c h o l i n ec o n c e n t r a t i o nc o u l dr e a c ha b o v e4 5 a n dt h ey i e l d c o u l dr e a c ha b o v e8 0 p h o s p h a t i d y l c h o l i n ew a sm o d i f i e db yp h o s p h o l i p a s e a 2 t h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ： t h et e m p e r a t u r ew a s3 8 仕1 ) ，t h et i m eo f t h eh y d r o l y s i sw a s7 h ，t h ec o n c e n t r a t i o no f p l a 2w a s1 0 0 i l 7 m l 。t h ec o n c e n t r a t i o no fc a l c i u mw a s0 0 2 5 m o l m l ，t h ev a l u eo f t r i s h c lb u f f e r sw a i s8 5 0 t h ea c i d i t yo f t h eh y d r o l y s i si nt h i ss i t u a t i o nw a s5 5 0 3 t h e r a t eo f h y d r o l y s i sw a s8 7 6 * , - 9 4 o g a i nt h ev a l u eo fr fo fe a c hi n g r e d i e n tb yt l c ，t h er fv a l u eo fe a c hi n 掣e d i e n t w a so ，9 0 ，0 5 6 ，0 3 2 s e p a r a t e dt h ep r o d u c t so ft h e h y d r o l y s i sb y s i l i c a g e l c o l 啪d h r o m a t 0 鲫h ya n du s e dg r a d i e n t e l u t i o nf o rs e p a r a t i o n c h a n g e dt h e p r o p o r t i o no fc h l o r o f o r m m e t h a n o l1 ：lt ol ：2 a n dt h e nt o1 ：4 ，u n t i l lo n l yu s e d t h em e t h a n o la se l u a n t t h ec o n t e n to f l y s o p h o s p h o l i p i dg a i n e d6 7 5 2 l y s o p h o s p h o l i p i d sh l bv a l u es 鹊t e s t e db vr k g u p t am e t h o dw a s9a n d i m p r o v e d5 0 t h a nl e c i t h i n t h ee m u l s i f y i n gs t a b i l i t yo fl y s o p h o s p h o l i p i d sw a s n e a r l yt h es a m e a so t h e re m u l s i f i e r ，l i k ea e o t oo p t i m i z et h ep r e p a r a t i o nf o r m u l a t i o no fv i t a m i ncl i p o s o m e s t h el i p o s o m e s w e r ep r e p a r e db yf i l md i s p e r s i o n - u l t r a s o n i ce m u l s i f ym e t h o d t a k i n ge n t r a p m e n t e f f i c i e n c ya si n d e x a n dd e s i g n i n ga no r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h eo p t i m a lf o r m u l a t i o n w e r e ：p h o s p h a t i d y l c h o l i n e c h o l e s t e r i n v i t a m i ne ( m o l a rr a t i o h ：2 ：o 3 4 ； v i t a m i nc c o n c e n t r a t i o n ：3 3 m g m l ；p b sb u f f e rp hv a l u e ：7 9 3 ；c h l o r o f o r mf o rf i l mf o r m i n g ：2 5 m l u n d e rt h ef o r m u l a t i o nt h ee n t r a p m e n te 衢e i e n e yw a s5 8 3 2 1 1 1 es t r a e t u r eo f l i p o s o m ew a so b s e r v e du n d e rt h es c a ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p e t h em a i nd i a m e t e ro f t h el i p o s o m ep a r t i c l e sw a s31 0b i l l t h es t a b i l i t yo fv i t a m i n cw a si m p r o v e da f t e r c n t r a p e db yp h o s p h a t i d y l c h o l i n e k e yw o r d s ：e m u l s i f i e rs o y b e a np h o s p h o l i p i dp h o s p h a t i d y l c h o l i n el y s o p h o s p h o l i p i d s p h o s p h o l i p a s ea 2l i p o s o m e v i t a m i n cc o s m e t i c 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：型垒叁 导师签 日期： 第一章综述 1 引言 第一章综述 磷脂最早由u a u q u e l i n 于1 8 1 2 年从人脑中发现，又由g o b l e y 于1 8 4 4 年从蛋 黄中分离出来，并于1 8 5 0 年按希腊文l e k i t h o s ( 蛋黄) 命名为l e e i t h i n ( 卵磷脂) ，继 而陆续从许多动植物中分离、确认了许多磷脂物质1 1 - 3 1 8 6 1 年t o p l e r 又在植物 种子中发现了磷脂的存在，1 9 2 5 年i e v e n 将卵磷脂( 磷脂酰胆碱) 从其他磷脂中 分离出来。而迄今认为的最为丰富的大豆磷脂是1 9 3 0 年发现的弭3 。 有关磷脂的研究，于2 0 世纪3 0 年代始于德国，6 0 年代以来在发达国家已 实现工业化广泛应用在食品、医药、化妆品和工业助剂领域，进入7 0 年代后， 研究工作日趋活跃。1 9 8 0 年在意大利首都罗马召开了第一届国际大豆磷脂专题 研讨会( i n t e r n a t i o n a lc o l l o q u i u ms o y al e d t l l i n ) 。其后基本每隔一年召开一次，至 1 9 9 6 年己召开了七次会议特别是1 9 8 6 年在美国芝加哥召开的第四届国际磷脂会 议上成立的国际磷脂研究集团( t h e i n t e r n a t i o n a l l e c i t h i n s t u d y g r o u p ) ，互通科研， 生产、应用与销售方面的信息，并且使精细磷脂得以开发和应用，从而使磷脂在 国民经济和社会发展中占据了自己的位置。由此可见，磷脂在世界上已备受人们 青睐，特别是美国和西欧，人们对磷脂的重视程仅次于维生素c l i o 磷脂为含磷酸的复合脂质，因其广泛存在于皮肤和其他生物膜中，故很早就 作为化妆品的天然原料之一被使用了b 3 。由于磷脂具有乳化性，能使泡沫稳定， 分散性好，并且由于磷脂的渗透性能可赋予皮肤油分，产生保湿和抗氧化作用”。 磷脂用于化妆品中，既可改善润湿效果、营养效果、涂抹效果及附着效果，又可 改善皮肤之触感，降低油腻性，提高保水性，是化妆品的重要添加剂。如在肥皂、 洗发香波、护肤膏、雪花膏、高级浴液、护手霜、发蜡、口红、护发素、防晒油 等高级化妆品中均可使用磷脂。蛋黄卵磷脂制作的高档化妆品，具有抗氧化、渗 透、保湿等作用，是其他化妆品无法代替的产品”1 。而且，随着人们对磷脂认 识的不断深入和科学技术的不断发展，磷脂在化妆品中的使用价值将越来越重 要。 我国大豆资源丰富，因此每年生产出大量的大豆磷脂，但是由于大豆磷脂存 在色泽、气味较差和h l b 值较低的问题，一直限制着大豆磷脂在化妆品中的广 泛应用 8 1 0 有报道磷脂经过改性后，性能将得到改善，并且进行了物理、化学改 性的尝试，得到了很好的效果。 本课题正是在这样的前提下，作了两方面的研究工作。一方面研究大豆卵磷 脂发生水解反应的最佳条件，分离提纯水解产物以得到高纯度的溶血磷脂，并将 其进行改性，以达到化妆品乳化剂h l b 值的要求。这将开拓大豆磷脂的一个新 用途，使我国改善大豆磷脂的生产现状，提高其生产规模和改进落后的生产工艺。 江南大学硕士学位论文 另一方面使用现代科学技术可以将磷脂转变成最有效的形式脂质体，探索有 效的包封率测定方法，以包封率为主要考察指标，设计正交实验，寻找最优化制 备处方，并考察脂质体的稳定性。 2 大豆磷脂及其改性产物介绍 2 1 大豆磷脂的组成 大豆磷脂是1 9 3 0 年发现的，其主要成分为卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂等眇1 ， 其结构通式如下： c h 妇c j o r l i c b h o ：c o 。r 1p 尘鼍u l 明2 o 一2 o x 其脂肪酸结构见下表： x ：胆碱乙醇胺 丝氨酸肌醇等 r ：脂肪酸基团 表i 大豆磷脂中的脂肪酸组成 2 2 大豆磷脂的水解 2 2 1 大豆磷脂的酸碱水解 在强酸或强碱存在条件下，磷脂中脂肪酸被羟基所取代，亲水性增强，分子 2 第一章综述 反应活性提高，可以为其他改性方法准备条件。酸解：磷脂用酸水解时，生成游 离酸、甘油、磷酸和肌醇等，但是酸解产物颜色发暗；碱解：磷脂与碱的水溶液 或醇溶液一起加热，即可发生水解反应，生成皂化物、甘油磷酸酯、磷酸肌醇、 氨基化合物和羟基化合物。但是水解反应条件难以控制，若水解时间过长，易导 致生成脂肪酸、甘油磷酯、肌醇磷酸或它们的盐、氨基酸和糖类混合物，甚至进 一步水解成甘油、磷酸和肌醇3 。正因酸碱水解条件难以控制，水解产物的颜 色很深，现已基本被淘汰。 2 2 2 大豆磷脂的酶水解 天然磷脂的h l b 值小，亲水性差，在水相中不易分散1 。酶解磷脂是磷 脂在磷脂酶的作用下失去一分子脂肪酸而成，在其分子结构中除保留了普通磷脂 的亲水、亲油基团外，又因疏水基团的减少而明显增加了它的亲水性能“”，因 此较普通磷脂有更好的水分散性，适于制备水包油型乳状液。以乙酰化“”、羟 基化4 1 等化学方法改性，可以改善磷脂的乳化性提高其亲水性能，但是化学改 性破坏了磷脂的天然结构，安全性不好，不符合有些国家的食品法标准，故应用 受限。酶改性则具有反应物不需要纯化、反应条件温和、速度快、进行完全、副 产物少、酶制剂作用部位准确、来源方便等特点n 引。 p 舢凡f i i 黜 置一oh，攀0，璺h2 c - - - o 呻。 c 一9 f o x ，、v u 酶催化法由于反应条件温和，产品安全可靠，较为常用的磷脂酶有磷脂酶 a 2 、磷脂酶c 、磷脂酶d 。磷脂酶a 2 水解磷脂分子中2 位酯键，得到溶血磷脂和脂 肪酸h “。用磷脂酶a 2 水解浓缩磷脂制备溶血磷脂是界面反应，浓缩磷脂在水中较 难分散，而磷脂酶a 2 溶解于水中，磷脂酶a 2 并不和单个的磷脂分子结合，对其进行 水解利。只有当磷脂在水中的浓度超过临界胶束浓度( c m c ) 时磷脂在水中形成 单层( m o n o l a y e r ) 或双层o a i a y e r ) 的胶束，磷脂酶a 2 游离到胶束和水的界面，酶的 活性部位和磷脂胶束结合，发生水解，反应中需要c a 2 + 的参与“”，反应界面的 大小直接影响到反应的速度和水解的程度。关于磷脂酶a 2 水解大豆浓缩磷脂，国 外采用两种不同的反应体系：美国学者多采用非水相反应体系，即磷脂先溶解于 有机溶剂中，再加入少量水和乳化剂，加酶反应9 o m ；日本学者倾向于水相反 应体系，即让磷脂分散于水中，加入磷脂酶a 2 反应瞠2 h 埘。本文用水相反应体系 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) h c l 缓冲液作为反应体系，采用单因素实验方案，通 江南大学硕士学位论文 过酸价滴定确定水解反应进行程度，分析得到各个因素的最佳作用值，然后将各 个实验因素的最佳作用值进行组合得到大豆卵磷脂发生水解反应最佳条件。 2 2 3 溶血磷脂在化妆品中的应用 2 2 3 1 对皮肤活化功能应用 一份新解密的能活化5 层表皮细胞的护肤配方显示，其中活性成分是脂肪酸 碳链长度为1 4 2 2 的大豆溶血磷脂。溶血磷脂分子的结构有利于其深入细胞膜， 能改善细胞的通透性，加速皮肤的新陈代谢，使受损的表皮细胞更替加快。配方 中溶血磷脂用量为o 2 。2 - 脱氧溶血磷脂对恶劣环境下作业的工人护肤特别有 效，能起到调节皮肤呼吸，舒展皮肤皱纹，改善粗糙结构的作用旺4 1 。 2 2 3 2 乳化性能应用 含溶血磷脂和蔗糖单酯的透明润肤产品能够保持较长时间稳定，粘度也无 变化。将壳聚糖、阿拉伯胶与溶血磷脂反应，生成的两性壳聚糖衍生物作为皮肤 清洗剂的成分，得到储藏稳定性好，并具有抗菌和皮肤保湿效果的产品。同样， 含溶血磷脂的香波能提高头发的发质，在干、湿状态下都容易梳理，香波配方中 含溶血磷脂3 o 。含0 6 1 0 钛白粉微粒的增白霜再添加了溶血磷脂后，形成了 直径不超过5 0 微米的乳化稳定体系，在四十摄氏度条件下储藏三个月不产生沉 淀，对皮肤无过敏反应1 。 3 脂质体 1 9 6 5 年b a n g h a m 等发现将磷脂分散在水中会形成多层囊泡，每一层均为脂 质双分子层，囊泡中央和各层之间被水相隔开，并称之为脂质体。脂质体一经发 现，就引起了生物学家、药学家的兴趣。在很长一段时间内，脂质体一直被作为 生物膜的模型来研究膜的性质曙5 、。7 0 年代初g r e g o r i a d i s 根据脂质体特点，提 出可以用脂质体作药物载体的可能性，并用脂质体包封b 一半乳糖苷酶治疗糖累 积疾病。在此之后，人们开始应用脂质体作为药物载体，包封不同的物质来进行 研究。在脂质体包封药物应用于经皮给药有了一定的研究成果之后，人们将脂质 体应用于化妆品中旺”。 3 1 脂质体的组成结构和分类 磷脂是构成脂质体的主要膜材。目前常用的有天然磷脂( 蛋黄磷脂、大豆磷 脂) 和合成磷脂等，其中合成磷脂性质稳定，但价格昂贵：天然磷脂虽然比合成 材料要便宜，但是性质不稳定。将磷脂分散在水中时，其极性头部和极性头部相 结合，非极性尾部和非极性尾部相结合，形成具有双分子层的结构，如图1 所示。 4 第一章综述 图1 脂质体结构图 根据形状的不同，脂质体一般可分为：多层脂质体( m l v s ) 、大的单层体 ( l u v s ) 和小的单层体( s u v s ) ，一般粒径小于2 0 0 n t o 的称为s u v s 粒径在 2 0 0 1 0 0 0 n m 之间的单层体称为l u v s ：m l v s 的粒径在1 - 5 m 之间趿”。各种类型 脂质体的性能因结构不同而异，这一般取决于制备工艺。通过改变脂质体的组成， 可以制成不同特性的脂质体。化妆品中一般应用的脂质体是大的单层或多层，直 径在1 0 0 5 0 0 h m 之间，因为这个粒径范围的脂质体包覆率较高且渗透力好，能渗 透到角质层或更深”。 3 2 脂质体化妆品的特点 脂质体的组成和结构决定了它具有其他化妆品载体所没有的特点： 3 2 1 双亲性嚣1 脂质体是磷脂分子分散在水中形成的，每一层是脂质双分子层，每层之间被 水隔开，在脂质体的水相和脂质体双分子层组成的膜内可以包封多种物质，从实 用的观点出发，脂质体作为载体，其价值在于能掺入水溶性的物质和脂溶性的物 质，并且掺入方式完全是物理性的，对这些物质的化学性质无任何限制。 3 2 2 长效作用1 脂质体作为载体还具有长效作用。实验证明，脂质体及包封药物在血循环中 保留时间，多数要比游离药物长得多。体内动力学研究指出，不同脂质体物在体 内的时间可以从几分钟到几天。 3 2 3 保护作用 实验证明，将一些不稳定、易氧化的药物包封在脂质体中，药物因受到脂质 双层膜的保护，在很大程度上提高了药物的稳定性，同时脂质体也增加了药物在 体内的稳定性。 就化妆品而言，一些活性物质，如果只是简单地与其它基质混合在一起由 江南大学硕士学位论文 于物质的相互作用、氧化、p h 的影响等，许多活性物质尚未使用就早已失活。 敷于皮肤上后，即使还有活性的物质，会很快被风干而失去活性，如果将各种活 性物质包封在脂质体中，既避免了相互作用，又避免了风干失活，还可以防止活 性物质的降解与变质，增加稳定性、减小刺激性。如维生素c 、维生素e 、超氧 化物歧化酶( s o d ) 裹于脂质体中，既提高稳定性、缓释性，又增加了选择性和通 透性3 。 3 2 4 保湿作用 研究证实，脂质体化妆品对皮肤有良好的保湿作用，即使在空载的形式下， 脂质体在皮肤深层仍可起到活化细胞和保留水分作用。 3 2 5 护肤作用 人的皮肤是由一层质密的细胞构成，细胞膜对大分子生物活性物质是不通透 的，使得化妆品中的活性成份难以通过渗透、吸收等生理过程发挥功效。脂质体 的类细胞膜结构使它能与人体表皮细胞融合，增加表皮细胞膜的流动性；再加上 粒径大小和较好的液态和可变形性，有利于脂质体穿透表皮屏障，使被包封物的 有效成分能够进入真皮层中的微循环。脂质体渗入皮肤并在角质层中积聚，与细 胞间的脂层发生作用后，其双膜的流动性不断增加，磷脂中的不饱和脂肪酸和亲 水基首端组织不断分解到角质层中，不饱和脂肪酸一方面可补充由于某些原因所 造成的皮下组织细胞排列的不均；另一方面可减少多余脂肪和毒素在皮肤上的沉 积，同时磷脂的亲水基可以润湿角质化的组织。通过以上两种作用的综合，脂质 体对皮肤的粗糙度有明显的改善。与未使用脂质体的护肤品相比，其护肤效力强 几倍至几十倍。因此，有人称脂质体为皮肤“质子”。“。 4 结论和立题依据 爱美之心人皆有之，化妆品行业是永不衰退的行业。我国化妆品的发展经历 了以下几个阶段：上世纪8 0 年代以前处于原始阶段，研究重点是怎样制造产品。 8 0 年代改革开放后，国外化妆品开始进入中国市场，同时将国外的先进技术带 入中国，中国化妆品进入了起步阶段。9 0 年代后，经过十几年的发展，中国化 妆品进入了发展阶段，化妆品市场逐步规范化，化妆品的安全性、有用性受到了 极大的重视，并在这些方面取得了很好的发展。在2 0 世纪末期，皮肤学、药理 学、生理学、生物学等已开始渗透到化妆品科学中，高安全性并具有一定生理功 效的化妆品正逐步被消费者接受。2 1 世纪化妆品是2 0 世纪的延伸，将进入化妆 品与使用化妆品的人类相互融合的科学阶段，将融合近代多学科的高科技成果， 如生化工程、分离工程、基因工程等。在今后十多年，天然活性功能化妆品将是 6 第一章综述 中国化妆品的主题”，。 磷脂应用于化妆品中，一方面是利用它的表面活性和胶体性质，另一方面是 利用它为皮肤细胞的固有成分的特性，即磷脂为所有生物细胞的重要成分，在细 胞代谢和细胞渗透性调节方面起着重要作用，对人体肌肤有很好的保湿性和渗透 作用。由于磷脂特有的生理活性和表面活性，使其在化妆品中体现了多功能性， 并获得了广泛的应用范围。更为重要的是，作为天然物质，磷脂在毒理学方面是 安全的。在人们崇尚自然的今天，“天然物”是质优安全而受欢迎的产品。磷脂还 是一种能产生独特“皮肤感觉”的物质，这就使它在化妆品中具有得天独厚的条件 t i 】 鉴于以上所述，本课题主要从事以下几方面的研究： 首先，采用浓缩大豆磷脂作为原料，将其分离提纯，用高效液相色谱”2 1 测 试卵磷脂的提取率，并研究提取条件对提取率的影响。 其次，将水相反应体系三羟甲基氨基甲烷( m s ) h c l 缓冲液作为反应体系，采 用单因素实验方案，通过酸价滴定确定水解反应进行程度，分析得到各个因素的 最佳作用值，然后将各个实验因素的最佳作用值进行组合得到大豆卵磷脂发生水 解反应最佳条件，测试溶血磷脂的h l b 值，使其与水解前的磷脂在乳化效果、乳 化稳定性方面进行对比。 最后，以中低纯度卵磷脂制备v c 脂质体，用光学显微镜、电子显微镜观察 脂质体的形态；探索有效的包封率测定方法，以包封率为主要考察指标，设计正 交实验，寻找最优化制备处方；考察维生素c 及脂质体的稳定性，使不稳定的维 生素c 能够得以更好地应用。 7 江南大学硕士学位论文 第二章大豆磷脂的提纯 纯净的磷脂在常温下为无色无味的白色固体，由于制取或精制方法、储存条 件的不同而呈现淡黄色至棕色，并呈现可塑性或流动性。大豆磷脂的主要成分是 磷脂酰胆碱( p c ) 、磷脂酰肌醇( p d 、磷脂酰乙醇胺( p e ) 、磷脂酸( p s ) 等，其脂肪酸 组成中油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸占有很大的比重口引，具体组成见表2 。 表2 大豆磷脂组成 大豆磷脂中起乳化作用的主要成分是磷脂酰胆碱，为了更好的对比研究，先 将购得的市售大豆磷脂进行了提纯。 1 1 主要试剂与仪器 主要试剂 大豆粉末磷脂食品级 北京美亚斯磷脂技术有限公司 氯化锌分析纯国药集团化学试剂有限公司 乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司 丙酮分析纯国药集团化学试剂有限公司 氯仿分析纯国药集团化学试剂有限公司 乙酸乙酯分析纯国药集团化学试剂有限公司 异丙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司 乙醚 分析纯国药集团化学试剂有限公司 主要仪器 g s l 2 一b 电子恒速搅拌器上海安亭电子仪器厂 h h s1 1 1 电热恒温水浴锅上海医疗器械厂 第二章大豆磷脂的提纯 r 2 0 1 旋转蒸发仪 d z f 6 0 2 1 真空干燥箱 x m t h 数显温控仪 t g l l 6 g 型超速离心仪 高效液相色谱仪( 5 1 5 7 ) 1 2 实验方法 1 2 1 提取方法的选择 上海申顺科技有限公司 上海精宏实验设备有限公司 浙江余姚市远东数控仪器厂 上海西亭科学仪器厂 w a t e r s 公司 1 2 1 1 乙醇作为提取溶剂】 将5 9 大豆磷脂置于带电动搅拌装置的三颈烧瓶中，加入一定比例的无水乙 醇，装上温度计及冷凝回流管，将水浴温度控制在4 0 ，中速搅拌，提取3 0 m i n 。 停止搅拌，静置、冷却，分出棕黄色的乙醇溶液。重复上述操作2 次。合并分出 的乙醇液，最后得到的混合物用布氏漏斗真空过滤。将滤液合并进行旋转蒸发， 得到淡黄色粘稠状物质。用丙酮清洗淡黄色物质，蒸除丙酮，将产物真空干燥2 4 h 。 得到的提取物, p c 含量用高效液相色谱( h p l c ) 测定。 1 2 1 2 乙酸乙醇作为提取溶剂 将5 9 大豆磷脂置于带电动搅拌装置的三颈烧瓶中，加入一定比例乙酸乙酯溶 解，常温中速搅拌3 0 m i n ，静置。将溶液冷却至1 0 ，然后离心分离沉淀。重复 操作2 次。将乙酸乙酯进行旋转蒸发，得到淡黄色粘稠状物质，用丙酮清洗淡黄 色物质，蒸除丙酮，将产物真空干燥2 4 h 。得到的提取物中p c 含量用高效液相色 谱( h p l c ) 测定。 1 2 1 3 异丙醇作为提取溶剂口1 将5 9 大豆磷脂置于带电动搅拌装置的三颈烧瓶中，加入一定比例异丙醇溶 解，将水浴温度控制在0 ，中速搅拌，提取3 0 m i n ，静置，分离出异丙醇溶液， 重复操作两次。最后得到的混合物用布氏漏斗真空过滤。将滤液合并进行旋转蒸 发，得到淡黄色粘稠状物质。用丙酮清洗淡黄色物质，蒸除丙酮，将产物真空干 燥2 4 h 。得到的提取物中p c 含量用高效液相色谱( h p l c ) 测定。 1 2 1 4 无机盐复合沉淀法 当磷脂在有机溶剂中存在时，磷脂酰胆碱是以分子内盐的结构形式( 1 ) 存 在，此时磷脂的极性表现得很弱，质点体积也很小。磷脂的分子既有疏水基又具 有亲水基，当其吸水润湿时水与成盐的原子团结合，得到结构形式( 2 ) ，体积增 大，其胶体质点吸引圈随之扩大，质点相互凝结成为胶粒，胶粒相互吸引成团， 9 江南大学硕士学位论文 相对密度增加，从而沉淀析出。利用此原理可以尝试分离大豆磷脂中的磷脂酰胆 平0 。o r i 氧化锌水溶液 f m o c 0 8 1 晚们佣- 嚣乏慨 乜。1 冬罗c f 虻璐p 将5 9 大豆磷脂溶解在2 0 m l 的无水乙醇中，滴加6 0 的氯化锌水溶液，待生 成乳白色沉淀，分离出沉淀溶于氯仿，再用3 0 乙醇除去氯化锌，有机层蒸去氯 仿，用乙醚、丙酮清洗沉淀，蒸除乙醚、丙酮，将产物真空干燥2 4 h ，得到的提 溶剂提取法的关键在于寻找一个好的溶剂或溶剂体系，使它对于被提取的目 标产物具有好的溶解性和选择性。实验过程中采用的几个体系的结果见下表： 表3 提取方法结果对比 从表3 中可以知道，在乙醇作为溶剂时，p c 提取率最大为7 0 6 ，而在乙酸 乙酯作为溶剂时的提取率最小为3 1 2 ；在异丙醇作为提取溶剂时，p c 的相对含 量最大为4 7 5 ，但是此时p c 提取率要比乙醇提取时少2 0 左右；当使用无机盐 复合沉淀法提纯时，p c 提取率与p c 含量均与使用乙醇作为溶剂提取时的结果比 较接近，但是无机盐复合沉淀法需要使用多种溶剂进行处理，操作复杂且不易回 收溶剂。综合各种因素，实验采用乙醇作为溶剂提取大豆磷脂中的磷脂酰胆碱 ( p c ) 。 高效液相色谱条件：柱子流动相正己烷：异丙醇：水= 5 5 ：3 6 ：9 ：进样量2 0 ， 柱压8 0 0 p a s 柱温室温。 1 0 第二章大豆磷脂的提纯 图2 提取物产率的高效液相对比图 1 2 2 提取温度的选择 将5 9 大豆磷脂置于带电动搅拌装置的三颈烧瓶中，加入一定比例的无水乙 醇溶解，将水浴温度分别控制在2 5 、3 0 、4 0 、4 5 、5 0 ，中速搅拌，提 取3 0 r a i n ，停止搅拌，静置。分出上层乙醇溶液，重复操作2 次，最后得到的混合 物用布氏漏斗真空过滤。将滤液合并进行旋转蒸发，得到淡黄色粘稠状物质。用 丙酮清洗淡黄色物质，蒸除丙酮，将产物真空干燥2 4 h 。得到的提取物中p c 含量 用高效液相色谱( h p l c ) 测定。 图3 提取温度与p c 含量关系图 由图中可以观察到，当温度为4 5 1 2 时，磷脂酰胆碱的含量最高。这是由于温 度升高使得磷脂酰胆碱的溶解度增加，但是其它磷脂的溶解度也随着温度的升高 而增加，当温度高于4 5 1 2 时，磷脂酰胆碱的溶解度优势最大，所以温度选择为 4 5 。 1 2 3 料液比的选择 将5 9 大豆磷脂置于带电动搅拌装置的三颈烧瓶中，加入一定比例的无水乙醇 江南大学硕士学位论文 溶解，大豆磷脂与乙醇的比例分别选择为l ：2 、1 ：3 、1 ：4 、l ：5 ，温度选择为 4 5 ( 士1 ) ，其它操作步骤同1 2 2 ，结果见下表。 表4 料液比选择结果 随着乙醇使用量的增加，磷脂酰胆碱的产率增加，这是由于磷脂酰胆碱充分 溶解的缘故，当料液比为1 ：4 时，再增大料液比磷脂酰胆碱的产率增加已经不明 显，磷脂酰胆碱基本被萃取完全，所以我们选择料液比为1 ：4 。 1 2 4 提取次数的选择 将5 9 大豆磷脂置于带电动搅拌装置的三颈烧瓶中，加入2 0 r a l 的无水乙醇溶 解，温度选择为4 5 。c ，按照操作步骤1 2 2 分别进行3 、4 、5 、6 次提取，结果见下 图。 图4 提取次数与p c 提取率关系图 1 2 5 小结 通过各单因素试验得出大豆磷脂提取磷脂酰胆碱的最佳实验条件为：乙醇做 为提取溶剂，提取温度为4 5 ( 士1 ) 1 2 ，料液比为1 ：4 ，提取次数为6 ，磷脂酰胆 碱在提取物中的含量达至t j 4 5 以上，提取率在8 0 以上。 1 2 第三章大豆磷脂的水解 第三章大豆磷脂的水解 天然磷脂的h l b 值小，亲水性差，在水相中不易分散 1 1 1 0 酶解磷脂是磷脂 在磷脂酶的作用下失去一分子脂肪酸而成，在其分子结构内除保留了普通磷脂的 亲水、亲油基团外，又因疏水基团的减少而明显增加了它的亲水性能，因此较普 通磷脂有更好的水分散性，适于制备水包油型乳状液。 第一节大豆磷脂的水解条件的研究 引言 目前，我国生产的大豆磷脂，就是利用溶剂分提技术得到的一种粗磷脂产品。 这类产品不仅纯度低，乳化性能欠佳，而且生产成本高，溶剂残留量大，不能在 食品中广泛应用。如果利用磷脂酶a 2 的高度专一性和磷脂转移特性，对现有的来 源广泛的粗磷脂品( 如大豆卵磷脂) 进行转化和改性，就可以提高磷脂的营养价值 和使用性能；也可以制备一些稀有磷脂，开发磷脂新品种。在这方向，国外学者 已开展了大量的研究工作，并制备了不少高质量磷脂产品。 用于磷脂改性的酶有专一性较宽的酯酶和磷酸酯酶，但最有意义的是专一性 较强的磷脂酶，包括磷脂酶a l 、a 2 、c 、d 等。磷脂酶a 2 专一性地催化水解磷脂 的s n - 2 位酰基，生成溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶a 2 存在于蜂毒、蛇毒、牛和猪的 胰脏中以及一些链霉菌属的微生物中。利用磷脂酶a 2 对大豆磷脂进行改性，将磷 脂分子上b 位酯键水解生成大豆溶血磷脂 3 5 j 0 1 1 试剂与仪器 主要试剂 大豆粉末磷脂食品级北京美亚斯磷脂技术有限公司 l e c i t a s e ( 磷脂酶a 2 ) 生化级 n o v o z y m e s ( 诺维信) 无水氯化钙 分析纯中国金山区兴塔美兴化工厂 三( 羟甲基) 氨基甲烷 生化级中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司 正己烷分析纯国药集团化学试剂有限公司 溶血磷脂标准品分析纯 s i g m a 公司 卵磷脂标准品分析纯s i g m a 公司 主要仪器 g s l 2 b 电子恒速搅拌器上海安亭电子仪器厂 h h s1 1 1 电热恒温水浴锅 上海医疗器械厂 江南大学硕士学位论文 r 2 0 1 旋转蒸发仪 d z f 6 0 2 1 真空干燥箱 x m t h 数显温控仪 p h s 一3 c 精密p h 计 1 2 实验方法1 ”2 ，3 7 1 1 2 1 反应试剂的配制 上海申顺科技有限公司 上海精宏实验设备有限公司 浙江余姚市远东数控仪器厂 上海雷磁仪器厂 1 2 1 1 配制o 2 m o l l t r i s 水溶液 精确称取t r i s6 0 5 7 0 9 ，加入去离子水溶解，转移至2 5 0 m l 容量瓶，用去离 子水定容。 1 2 1 2 配制0 1 m o l l h c l 溶液 用移液管移取5 0 m l o 5 m l 的h c i 至2 5 0 m l 容量瓶，用去离子水定容。 1 2 1 3 配制t r i s h c i 缓冲液 用移液管移取0 2 m o l l h i s 溶液2 5 m l 至1 0 0 m l 容量瓶中，移取0 1 m o l l h c l 溶液1 5 m l 至1 0 0 m l 容量瓶中，用无水乙醇定容。使用p h 计精确测得其p h 为 8 5 3 。 按照相同的方法，配制所需的不同p h 值的t r i s h c i 缓冲液。 1 2 2 反应体系的选择 1 2 2 1 水溶剂反应体系 称取大豆卵磷脂1 0 1 3 8 9 放入带搅拌装置的三颈瓶中，无水c a c l 2 0 2 2 8 4 9 ， 移液管移取离子水定容的t d s - h c l 缓冲液1 0 m l ，用移液管移取o 1 m l 酶， 3 8 c 水浴加热，回流反应8 小时，反应体系为乳状液。之后将三颈瓶中的反应物等 转移到1 0 0 m l 的茄形瓶中，用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂。转移产物，放入真空 干燥箱，在真空度为o 0 8 m p a 下干燥2 4 h 。 水解程度由产物的酸价来衡量，酸价的测定方法按照a o a c 2 8 0 3 1 测定。 测定水溶液反应体系的酸价为1 0 9 7 3 。 1 2 3 2 正己烷反应体系 配制h i s h c l 正己烷缓冲液 方法同1 2 1 2 ，用正己烷定容。使用p h 计精确测得其p h 为8 5 0 。 称取大豆卵磷脂1 0 2 3 1 9 放入带搅拌装置的三颈瓶中，无水c a c l 2 0 2 2 6 7 9 ， 1 4 第三章大豆磷脂的水解 量取正己烷定容的t r i s - h c l 缓冲液1 0 m l ，用移液管移取0 1 m l 酶，3 8 时水浴 加热，回流反应8 小时，反应体系为乳状液。之后将三颈瓶中的反应物等转移到 1 0 0 m l 的茄形瓶中，用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂。转移产物，放入真空干燥箱， 在真空度为o 0 8 m p a 下干燥2 4 h ，测定酸价为8 3 7 1 1 2 2 3 乙醇水反应体系 称取大豆卵磷脂1 0 2 1 9 9 放入带搅拌装置的三颈瓶中，无水c a c l 2 0 2 2 2 9 9 ， 量取无水乙醇定容的t r i s - h c l 缓冲液1 0 5 m l ，用移液管移取0 1 m l 酶，3 8 ( 士1 ) 时水浴加热，回流反应8 小时，反应体系为乳液。之后将三颈瓶中的反应物等 转移到1 0 0 m l 的茄形瓶中，用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂。转移产物，放入真空 干燥箱，在真空度为0 0 8 m p a 下干燥2 4 h ，测定酸价为6 5 9 4 。 图6 反应体系的酸价趋势图 说明：反应代号1 为水溶液反应体系，2 为正己烷反应体系，3 为乙醇水溶液反应体系 用去离子水定容的t r i s h c l 缓冲液的反应体系，由于磷脂在水中是形成一个 胶体乳液体系，在这样一个反应体系中，水解的不只是磷脂酰胆碱，其他的磷脂 也会水解，从而使得酸价很高。 用正己烷定容的t r i s - h c l 缓冲液的反应体系，呈乳状液。其他的磷脂也会水 解，即存在较多的副反应。 而乙醇对磷脂酰胆碱的溶解度较大，在用无水乙醇定容的t r i s - h c l 缓冲液的 反应体系中，副反应较小。磷脂酶a 2 催化的主要反应是磷脂酰胆碱的水解。 故选择无水乙醇定容的t r i s - h c l 缓冲液作为水解反应的缓冲液。 江南大学硕士学位论文 1 2 3 温度的选择 将反应时间设定为7 h 、底物浓度为1 0 、酶的用量为1 0 0 i u m l 、缓冲液的 p h 值为8 5 0 、钙离子的浓度为0 2 m l ，在此条件下将温度分别控制在2 8 。c 、 3 8 c 、4 8 c 、5 8 、6 8 c ，考察产物的酸价变化。 图5 温度与酸价变化图 从图中可以看出，随着温度的增加，产物的酸价逐渐升高，在3 8 达到一 个最大值后又逐渐降低，这是因为3 8 是磷脂酶的最佳活性温度，此时的酶活 最大，所以催化效果最好，酸价也就最高。随后随温度升高酸价又逐渐下降，这 是因为酶是蛋白质，在高温下蛋白质会变性，失去其活性，所以催化效果会减弱， 酸价降低。但是在5 8 1 2 以后酸价又再次升高，这是由于升高温度增加底物分子 的热能，而且温度升高可以降低体系的黏度，提高扩散系数，从而使水解程度提 高，但是此时已经不是酶做催化作用。所以选择温度为3 8 。c 为水解反应的最佳 温度。 1 2 4 时间因素的选择 我们主要考察了在乙醇水反应体系中，将反应条件设定为：酶的用量为 1 0 0 i u