（生物化学与分子生物学专业论文）酸性脲酶的制备、纯化及其性质研究.pdf

摘要 摘要 酸性脲酶因能够耐受酸性环境，并且在大部分的低乙醇度酒精饮料中仍具有很高的 活性，因而可以用来去除其所含有的尿素，从而降低酒精饮料中的氨基甲酸乙酯。本论 文主要对来源于e n t e r o b a c t e rs p r s y b 0 8 2 的酸性脲酶进行了提取、纯化及性质研究。 在细胞破碎阶段主要考察了高压匀浆法，结果表明在匀浆压力8 0 m p a 、匀浆3 次、 菌体浓度1 5 0 9 l 的条件下破碎效果最佳，细胞破碎率达到了9 0 ，酶活收率为1 1 0 。 在粗分离阶段应用聚乙二醇磷酸氢二钾双水相体系对细胞破碎后的粗酶液进行萃 取，结果表明在聚乙二醇分子量为4 0 0 0 ，聚乙二醇浓度为1 5 ，磷酸氢二钾浓度为1 0 ， 体系p h 值6 0 ，n a c l 浓度4 时，酸性脲酶的收率达到了8 3 ，纯化倍数为4 5 。 粗酶经过s u p e r d e x 2 0 0 凝胶过滤层析和m o n o q 离子交换层析后，回收率4 2 ，纯化 倍数为9 1 8 。s d s p a g e 电泳为单一条带，其n 端8 个氨基酸残基序列为： s e r - p h e l y s m e t - a s p - a r g l y s g i n 。表明该条带为同种蛋白。凝胶过滤法测定全酶分子 量为4 3 0 k d a 左右，s d s p a g e 测定分子量为7 2 k d a 左右，表明该酶为同源六聚体。 酶反应的最适p h 值为4 5 ，最适温度为3 5 。酶的p h 稳定范围为4 0 6 0 ，在2 5 5 5 之间酶有较好的热稳定性，相对酶活都在8 0 以上。当酶液在较高温度( 6 5 ) 时，保 存3 h 相对酶活仍在5 0 左右。在3 5 ，p h 4 5 时，该酶表观及分别为1 9 5 9 m o l l 和1 0 9 9 m o lu r e a r a i n m g 。n a + 、m n 2 + 对酶有一定的激活作用，c a 2 + 、z n 2 + 有一定的抑 制作用，酒石酸、琥珀酸对酶有一定的激活作用，草酸、乙酸有一定的抑制作用。在两 种不同的黄酒中按照0 0 5 u m l 的酶量进行尿素去除实验，在3 7 下，处理四天，尿素 去除率分别达到了8 3 和7 9 。 关键词：酸性脲酶；高压匀浆；双水相萃取；纯化；性质 a b s t r a c t a b s t r a c t s i n c eu r e ai sap r e c u r s o ro fe t h y l c a r b a m a t e ，ap o t e n t i a lc a r c i n o g e n i cc o m p o u n d ，f e a s i b l e m e a s u r e sm u s tb et a k e nt oc o n t r o lt h el e v e lo fu r e a a c i du r e a s eh a ss p e c i a lp r o p e r t i e so f s h o w i n gi t sc a t a l y t i ca c t i v i t yi nl o wp hr a n g ea n dat o l e r a n c et oe t h a n 0 1 i th a sb e e n d e m o n s t r a t e dt h a ta c i du r e a s ei sc a p a b l eo fd e c o m p o s i n gu r e ai nf e r m e n t e db e v e r a g ea n d f o o d s t h eo b je c t so ft h i ss t u d yw e r et op u r l f ya n dc h a r a c t e r i z et h ee n z y m ef r o me n t e r o b a c t e r s p r s y b 0 8 2 i nc e l l sl y s a t ep h a s e ，h a r v e s t e dc e l lw a sl y s e db yah i g h p r e s s u r eh o m o g e n i z e s u n d e r e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ：8 0 m p a ，3p a s st h r o u g ht h eh o m o g e n i z e r , 10 0 9 l ，t h ec e l ld i s r u p t i o n c a nr e a c h9 0 a b o v ea n dt h er e c o v e r yw a s1 1o a q u e o u st w o p h a s es y s t e mw a se m p l o y e df o rt h ee x t r a c t i o no fa c i du r e a s ef r o md i s r u p t e d c e l l s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tf a c t o r ss u c ha s ，p o l y e t h y l e n e g l y c o lm o l e c u l a rw e i g h t ，t h e c o n c e n t r a t i o no fp e ga n dp o t a s s i u mp h o s p h a t e ，p ha n dt h ep r e s e n c eo fs o d i u mc h l o r i d eo n a c i du r e a s ep a r t i t i o n i n gw e r ea n a l y z e d a q u e o u st w o - p h a s ef o r m e db y15 p e g4 0 0 0a n d 10 p o t a s s i u mp h o s p h a t e p hv a l u e6 0a n d4 n a c ls h o w e dt h eb e s ts e p a r a t i o nc a p a b i l i t y u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ea c t i v i t yy i e l dw a su pt o8 3 a n dt h ep u r i f i c a t i o nf a c t o rw a s4 5 t h ec r u d ee n z y m ew a sp u r i f i e dt oe l e c t r o p h o r e t i ch o m o g e n e i t yu s i n gt w os u c c e s s i v es t e p s i n c l u d i n gs u p e r d e x2 0 0a n dm o n oqw i t hay i e l da n dp u r i f i c a t i o n f o l do f4 2 a n d9 18 r e s p e c t i v e l y t h en - t e r m i n a ls e q u e n c eo fa c i du r e a s ew a ss e r - p h e - l y s - m e t - a s p - a r g l y s g i n t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ee n z y m ew a se s t i m a t e dt ob e4 3 0 ，0 0 0 d ab yg e lf i l t r a t i o na n d 7 2 ，0 0 0 d ab ys d s p a g e ，s u g g e s t i n gt h a ti t sah e x a m e rc o m p r i s i n go fs i xi d e n t i c a ls u b u n i t s t h ep u r i f i e de n z y m ew a so p t i m a l l ya c t i v ea t3 5 ca n da tp h 4 5 t h ea c t i v i t yw a ss t a b l e b e t w e e nap hr a n g eo f4 0a n d6 0 i tw a ss t a b l ew h e nu pt o5 5 。c ，b u ts t a b i l i t yo fa c i du r e a s e d e c r e a s er a p i d l ya b o v e6 5 c t h ee n z y m ee x h i b i t e da na p p a r e n t o f19 5 1 a m o l la n da 缸 o f10 9 p m o lu r e a r a g 。m i na t3 5 a n dp h 4 5 n ea c t i v i t yc a nb ea c t i v a t e db yn a + ，m n 2 + ， t a r t a r i ca c i da n ds u c c i n i ca c i db u ti n h i b i t e db yc a 2 十，z n z + ，o x a l i ca c i da n da c e t i ca c i d 8 3 a n d7 9 o fu r e ai nt w ok i n d so fc h i n e s er i c ew i n ew a sd e c o m p o s e db yi n c u b a t i n gw i t ht h e e n z y m e ( 0 0 5u m l ) a t3 7 f o r 4 d a y s k e y w o r d s ：a c i du r e a s e ；h i g h - p r e s s u r eh o m o g e n i z e s ；a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o n ； p u r i f i c a t i o n ；c h a r a c t e r i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅乖借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 糊张峰 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 立题背景及意义 1 1 1 立题背景 对氨基甲酸乙酯的研究早在2 0 世纪中期开始。2 0 世纪4 0 年代，n e t t l es h i p 实验证 明了氨基甲酸乙酯( e t h y l c a r b a m a t e ，简称e c ) 具有致癌作用。其可以引起肺肿瘤、淋 巴癌、肝癌、皮肤癌等。现今e c 被广泛用于工业涂料及动物麻醉。氨基甲酸乙酯不仅 是香烟的天然成分，也是发酵食品( 如面包，酸牛奶，乳酪、酱油等) 和酒精饮料( 如 葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等) 的副产物。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通 过饮用酒精饮料。调查显示，如果饮用氨基甲酸乙酯含量超过3 x 1 0 巧g l 的酒精饮料， 人忠癌的机率会大大增加。根据加利福尼亚环保机构的一项统计数据得知，假设每个人 的患癌症的机率为1 x 1 0 一，可推断氨基甲酸乙酯的摄入量大约为o 7 i _ t g d t l l 。可见氨基甲 酸乙酯是危害人类健康的一个不可忽视的因素。1 9 8 5 年1 2 月，加拿大政府卫生与福利 组织率先颁布了酒中氨基甲酸乙酯的限量标准【2 】： 表1 - 1 加拿大政府卫生与福利组织e c 限量规定 t a b 1 1f cl i m i t so f h e a l t ha n dw e l f a r ei nc a n a d a 酒种e c 含量( 吲l ) 佐餐葡荀酒 加强酒( 雪利、波特等) 蒸馏酒 白兰地 3 0 1 0 0 1 5 0 4 0 0 之后日本把清酒和我国的黄酒也列入了加强酒标准中，并制定了酒中氨基甲酸乙酯 的限量标准。与此同时，各国学者对酒中氨基甲酸乙酯的测定方法，形成机理和降低其 含量等方面进行了深入的研究。 国内外对酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途径为尿素 途径，我国黄酒及日本清酒中9 0 以上的氨基甲酸乙酯是来源于酒中所含尿素与乙醇的 反应【3 ，4 】： h 2 n c o n i - 1 2 + c 2 h 5 0 h + c 2 h j o c o n h t + n i - - 1 3 从黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯形成机理( 见图1 1 ) ，可以看出黄酒中的尿素一方 面主要由微生物代谢产生，即精氨酸代谢产生的尿素，另一方面是酿造原辅材料成分中 所含的尿素。研究发现，尿素浓度，乙醇浓度，杀菌和保藏温度，保藏期都是氨基甲酸 乙酯形成的主要因素，其中杀菌和保藏温度对氨基甲酸乙酯形成影响较大。降低酒的杀 菌温度，缩短杀菌时间，降低贮酒温度，缩短贮酒时间等均可降低e c 含量，但这些方 法都会使酒的风味发生或多或少的改变。 根据氨基甲酸乙酯形成的机理和尿素的来源，各国学者们对降低酒中氨基甲酸乙酯 的方法进行了深入的研究，而研究的主要方向是通过降低酒中的尿素含量，以达到控制 氨基甲酸乙酯含量的目的。降低酒中的尿素主要有以下三种途径【5 】： 江南人学硕f ：学位论文 鹿内 烟腻 鹿蚪 精蕉酸 精氯颤奠 尿素+ 乙群一氮基甲酸乙置 j 原料 叠日履 图1 1 黄酒中氨基甲酸乙酯形成机理 f i g 1 1f o r m a t i o nm e c h a n i s mo fe ci nc h i n e s er i c ew i n e 其中向酒中添加酸性脲酶是最为简便、实用，也是目前较常用的方法，这种方法具 有显著的优点： ( 1 ) 不改变原酿造酒的酵母菌种和工艺条件，不影响正常生产。 ( 2 ) 不改变原酒的风味特性，这是由于添加量小，而且酸性脲酶经煎酒后失活。 ( 3 ) 降低酒中氨基甲酸乙酯的效果明显。 脲酶( e c 3 5 1 5 ) ，又称尿素氨基水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，它催 化尿素水解形成氨和二氧化碳： h2 n c o n h 2 + 2 h ，o 旦2 n h 3 + h ，c 0 3 根据脲酶的最适p h 值，可以将其分为酸性、中性和碱性脲酶。来自刀豆( c a n a v a l i a a d a n s ) 和巴氏芽孢杆菌( b a c i l l u sp a s t e u r i ) 的中性、碱性脲酶已经工业化生产，但要应用于 中国黄酒，用量大且作用效果甚微。中国黄酒p h 值为4 0 5 5 ，且有一定的乙醇浓度， 中性、碱性脲酶在黄酒环境中发挥不了作用甚至失活。因此筛选适用于黄酒的酸性脲酶 是降低我国黄酒中e c 含量的关键。 1 1 2 立题意义 我国是世界上年产酒量最大的国家，有着十分悠久的酿酒历史，不仅产量大，而且 品种多，尤其是我国黄酒在国际上享有较高的声誉。我国的绍兴黄酒在日本及东南亚拥 有广泛的市场。但在1 9 8 7 年，日本有关部门提出部分绍兴黄酒中氨基甲酸乙酯含量超 标( 大于1 0 0 1 t g l ) 。为了降低黄酒中氨基甲酸乙酯的含量，保障人民的身体健康，预防 国外的贸易技术壁垒，研究和生产适用于我国黄酒的酸性脲酶己成为当务之急。本课题 是“黄酒中微量组分控制技术与标准研究”科研项目的一个主要的组成部分一“酒用酸 性脲酶的研发”。 在酶的纯化、酶的分子量、高级结构及纯酶的酶学性质及应用方面，国内未见有相 关报道。本实验利用具有自主知识产权的菌株e n t e r o b a c t e rs p r s y b 0 8 2 进行发酵生产 酸性脲酶，并对酸性脲酶进行纯化获得纯酶，并对纯酶的分子量、高级结构及纯酶的酶 学性质及应用进行研究。得到纯酶后，可以测定纯酶的n 端氨基酸序列，为以后利用基 因工程手段进行育种奠定基础。 1 2 国内外研究概况 2 一 髓l 旦_ 精 第一章绪论 1 2 1 国外研究概况 目前，国外对酸性脲酶的研究较多，对酶的产生菌种、酶的性质、纯化及在清酒、 葡萄酒中的应用都进行了深入细致的研究。 1 9 7 6 年，m o r e a u 等人【6 】从鼠粪中筛选出一株产酸性脲酶的菌株，经鉴定为 l a c t o b a c i l l u ss p 菌，与同时筛到的一株产酸性脲酶的a c t i n o b a c i l l u ss p 菌相比，前者最适 p h 值为3 0 ，后者最适p h 值为6 0 。1 9 7 9 年s u z u k i 7 】等人对动物肠道中的产脲酶的厌氧 和兼性厌氧微生物做了分类，并指出许多细菌都能产脲酶( 见表1 2 ) ，而酸性脲酶产生菌 主要分布于s t r e p t o c o c c u s 、l a c t o b a c i l l u s 、e s c h e r i c h i a 、s t a p h ，l o c o c c u s 、b i f i d o b a c t e r i u m 和m o r g a n e l l a 等属中。 表1 - 2 不同来源的脲酶 t a b 1 - 2t h er e p o r to fu r e a s ef r o mb a c i l l u sa n dm i l d e w 1 9 8 9 年，下饭仁和近藤洋大等人1 8 - 1 0 1 土壤和排水沟污泥中筛选到一株产酸性脲酶的 菌株z o o g l o e as p 和p s e u d o m o n a ss p 。1 9 8 9 年，日本的s h i g e y a 等人【1 1 】从1 0 种动物的肠 道及粪便中分离出1 6 3 4 2 株酸性脲酶产生菌株，并对其中的7 0 0 株进行了分类学研究， 根据形态学性质和一些生理、生化性质进行了分类，其中的3 7 0 株为链球菌属，3 1 2 株 为乳杆菌属，9 株为埃希氏菌属，6 株为葡萄球菌属，2 株为摩根菌属，1 株为二裂杆菌 属。 自1 9 5 1 年从巴氏杆菌( b a c i l l u s p a s t c u i i ) 首次分离出纯化的脲酶以来，相继有不少 关于纯化的细菌及霉菌脲酶的报道。最初的脲酶的纯化只是使用了一些相当简单的方 法，诸如硫铵沉淀、c a 3 ( p 0 4 ) 2 及丙酮处理，用硫酸精蛋白或硫酸链霉素作为d n a 的沉 淀剂等。到了八十年代，酸性脲酶的分离纯化开始采用凝胶过滤、离子交换、疏水层析 等色谱方法及电泳技术【8 , 9 , 1 2 , 1 3 1 。 酸性脲酶分子量的测定常采用凝胶过滤色谱法，同时采用s d s p a g e 电泳分析其亚 基组成。对酸性脲酶等电点的测定几乎都采用等电聚焦的方法，一般酸性脲酶的等电点 在4 6 - 4 8 之间，对酸性脲酶基本的酶学性质研究较多，报道的最适温度在4 0 5 0 ， 温度在5 0 。c 以下比较稳定，最适p h 值3 o 5 5 ，p h 稳定范围不一【8 9 ，1 2 ，1 3 1 。 n i 2 + 可激活刀豆脲酶早在1 9 7 5 年就有报道，并通过实验证明n i 2 + 参与该酶活性中 江南人学硕一i ：学位论文 心的组成部分【”。7 】。以后的研究表明n i 2 + 对酸性脲酶具有同样的作用。1 9 8 9 年，s h i g e y a 等人【1 l 】在研究发酵乳杆菌所产的酸性脲酶时发现m n 2 + 对脲酶具有类似n i 2 + 的激活作用， 经原子吸收光谱分析m n 2 + 不参与酶活性中心的组成，其激活作用机理至今未有报道。 同年，柿本茂八等人【1 8 , 1 9 】对f e r m e n t u mj c m5 8 6 7 ，5 8 6 9 和s t a p h y l o c o c c u s6 0 协p g 1 8 6 ， p g 19 6 所产脲酶进行了研究，发现n i 2 + 与m n 2 + 对酶具有交互作用。 嘶0 1 i 和o u 曲【2 0 】以及s h i g e y a 等人【1 1 】先后研究了酸性脲酶的抑制因子，用实验证明 a 矿、h 矿、c u 2 + 、f e 2 + 、c a 2 + 、苯酚类化合物，s 0 2 以及乙醇对酸性脲酶具有不同程度 的抑制作用。有机酸中l - 苹果酸、l 乳酸、丙酮酸、8 t 酮戊二酸、醋酸、没食子酸、d 一 对氯汞苯甲酸和乙酸氧肟酸对乳酸菌的酸性脲酶具有强烈的抑制作用。目前对这些抑制 剂的抑制机理研究报道的不多。重金属离子如a 矿、h g + 和c a 2 十则能使蛋白质变性，从 而抑制酶的活性。1 9 8 9 年，k a k i m o t o 等人【2 1 】对l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i 所产酸性脲酶的酶 学性质进行了研究。1 9 9 0 年，k a k i m o t o 等人【2 2 】又分别对l a c t o b a c i l l u s f e r m e n t u m 和m i t i o r s p 菌所产酸性脲酶的酶学性质进行了研究。结果表明：三种酸性脲酶的酶学性质相近， 如氨基酸组成，底物专一性，活性中心的金属离子种类及浓度，三级结构即亚基及其组 成等。 对酸性脲酶的应用，国外尤其是日本进行了深入细致的研究【2 3 。2 8 1 。下饭仁，近藤洋 大等人用筛选出的动胶菌属细菌z o o g l o e as p 所产酸性脲酶以5 u l 1 0 u l 加入后酵酒或 完成发酵的清酒中，可使9 0 的尿素分解，有效地阻止了e c 的形成。吉尺淑等人研究 了温度、p h 对清酒中酸性脲酶反应速率的影响；在相同脲酶浓度和反应时间下，初始 尿素浓度对尿素去除率的影响；脲酶浓度对尿素去除率的影响等。结果表明酸性脲酶能 有效地降低清酒中的尿素及e c 含量。为了更有效利用酸性脲酶降低酒及发酵饮料中的 尿素及e c 含量，1 9 8 9 年美国t r i o l i 等人【2 0 】研究了葡萄酒中可能对酸性脲酶起抑制作用 的因素( 如金属离子、多酚、二氧化硫、酒精、有机酸等) 进行了探讨。1 9 9 0 年f u j i n a w a 等人【2 4 , 2 9 】对美国市场上随机抽取的5 9 种美国佐餐葡萄酒和8 种餐后甜葡萄酒进行了酸 性脲酶有效性的研究，结果表明：其中的5 3 种佐餐葡萄酒和3 种餐后甜葡萄酒在添加 酸性脲酶后，尿素去除率超过5 0 ，而在各种葡萄酒中e c 含量均有不同程度的减少。 1 9 8 7 年r 本国税厅也已经批准酸性脲酶作为酒质防腐剂添加于清酒中，并在清酒酿 造行业中广泛应用起来。1 9 9 8 年，欧盟对使用酸性脲酶作出了专门的评定，认为在葡萄 酒中使用酸性脲酶可以降低葡萄酒中的e c 含量，有利于公众对健康的要求。2 0 0 4 年， 澳大利亚和新西兰标准机构通过了酒中添加酸性脲酶的决议。2 0 0 5 年o i v ( 国际葡萄葡 萄酒组织) 也通过了允许添加酸性脲酶降低酒中尿素的决议。一般使用方法是向酒中加 入一定量的酸性脲酶，这种方法根据温度不同处理时间为7 d 3 0 d 。 1 2 2 国内研究概况 我国绍兴黄酒厂也从日本购买酸性脲酶，应用发现同本脲酶对黄酒也有一定效果。 国内所产的脲酶只限于实验室应用【3 们。1 9 8 8 年无锡轻工业学院与绍兴酿酒总厂联合率 先在我国展开此项科题研究。1 9 8 9 年列入部级项目，1 9 9 2 年完成，并取得部科技进步 奖。我院对黄酒中e c 的检测方法、形成机理、动力学性质和降低黄酒中e c 含量方面 4 第一章绪论 的研究取得了较好的成果。1 9 8 8 年，我院的刘吉泉等【3 】在国内发表了第一篇有关酒中 e c 的文章，1 9 9 1 年，我校的袁身淑等人【3 1 首先建立了酒中e c 的检测方法。1 9 9 4 年我 院在上述基础上，接受轻工总会的“酒用酸性脲酶的研发”课题立项的前期工作，展开了 菌种的选育等研究。吴伟祥等人【3 0 】筛选过产酸性脲酶的细菌，对其发酵特性及应用特性 进行了详细的研究，酶活达到2 u m l 左右，成功进行了小试。后因国家体制变动，该 课题立项暂缓。 2 0 0 0 年，嘉兴学院的刘颖【3 2 】从嘉兴乳品厂土壤中分离到一株产酸性脲酶的菌株， 酶活达0 2 8 u m l ，鉴定为肠杆菌科变形杆菌属，并对其发酵特性进行了研究。2 0 0 2 年， 刘颖3 3 1 又从嘉兴豆制品厂排水沟污泥中分离到一株产酸性脲酶的菌株，酶活达 0 2 6 8 u m l ，根据其生理生化特性，鉴定为肠杆菌科克雷伯氏菌属肺炎克雷伯氏菌，研 究了其诱变育种、产酶条件及粗酶提取，但未对该酸性脲酶在黄酒中的应用效果进行相 关报道。 2 0 0 5 年，我院在完成轻工部“酒中氨基甲酸乙酯的研究”课题后，又接受了中国酿酒 工业协会黄酒分会“酒用酸性脲酶的开发”的课题。2 0 0 6 年，本课题组成功筛选获得一 株酸性脲酶产生菌e n t e r o b a c t e rs p r s y b 0 8 2 ，通过诱变，粗酶的酶活达到了1 5 u m l 。 在粗酶的制备方面应用超声破碎及乙醇沉淀，酶的收率达到了6 5 左右。酶的最适反应 为7 5 c ，最适p h5 5 ，在实际应用中对黄酒中的尿素去除有较好的效果【3 4 1 。 1 3 本论文研究内容 ( 1 ) 适合于大规模生产细胞破碎方法的优化 对高压匀浆、超声破碎等适合大规模生产的细胞破碎方法进行考察，并确定最佳的 破碎方法。 ( 2 ) 酸性脲酶纯化 通过凝胶过滤、离子交换等方法对酸性脲酶进行纯化，并最终得到s d s p a g e 电泳 纯样品。 ( 3 ) 纯酶性质及应用研究 研究全酶分子量、n 端氨基酸序列、p h 稳定性、最适p h 、温度稳定性、最适温度、 金属离子、有机酸浓度对酶活影响、反应动力学等性质，并初步研究脲酶在黄酒中的应 用。 江南火学硕十学位论文 第二章酸性脲酶的制备 2 1 前言 为了提取和纯化微生物发酵生产的胞内产物，必须先将它们从胞内释放到周围环境 中去，然后进行分离、纯化，释放可以用分泌性宿主使细胞内产物分泌到胞外，也可以 用破碎细胞的方法使其释放出来。 细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。其中细胞 壁的破碎最为关键，因为细胞壁是具有一定刚性和韧性的物质，起到保护细胞的作用。 当细胞与周围环境交换营养物或代谢产物时，细胞壁起了调节和控制的作用。此外他还 具有抗机械撞击作用的功能，如帮助细胞抵抗来自发酵液混合的剪切应力、静压力或渗 透压力等，是难以破碎的。所以对于一定的目的细胞就需要选择合适的破碎方法。在各 类破碎方法中，有些适用于大规模生产，而有些则适用于实验室规模。后者通常着重于 所有得产品的纯度与操作方法的方便性，对于过程的效率和费用则不予过多的考虑。工 业过程则追求高收率、低成本且对上下游过程影响小，这就要求破碎过程的操作时间短 且易于自动化。在为大规模生产选择细胞破碎技术时，破碎设备本身也是一个需要考虑 的重要因素，该设备本身必须适合上下游过程【3 5 1 。 细胞破碎后，再对细胞裂解液进行初步的固液分离，一般接着进行的操作是沉淀、 萃取或者膜分离。沉淀是物理环境的变化引起溶质溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。 常用的沉淀方法有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀及热沉淀等沉淀方法。萃取是 根据物质在互补相容的两相之间分配系数的不同而使得溶质的达到纯化或浓缩的方法， 根据参与溶质分配的两相不同而分为多种，如液固萃取、液液有机溶剂萃取、双水相萃 取和超临界萃取等。与传统的液液分离方法相比，双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有 以下优势：体系含水量高，可达8 0 以上；蛋白质在其中不易变性；界面张力远远低于水 有机溶剂两相体系的界面张力，有助于强化相际间的质量传递；分相时间短，一般只需 5 1 5 m i n ，易于放大和进行连续性操作；萃取环境温和，生物相容性高；聚合物对蛋白质的结 构有稳定和保护作用等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势，现已被广泛用于蛋白质、 核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。由于在聚乙二醇具有较好的生物相 容性，而且在各种聚合物中最为廉价，同时p e g 无机盐体系也是最为廉价的双水相体 系，因此该体系在双水相中应用最为广泛。在p e g 无机盐双水相体系中常用的无机盐 有硫酸铵、磷酸盐及硫酸钠等1 3 6 j 。 在菌体破碎方面，王玉美【3 7 】进行了超声破碎和溶菌酶处理对破碎效果的研究，本章 在细胞破碎方法上选择了具有放大潜力的高压匀浆进行研究，在破碎后粗提取上选择了 磷酸氢二钾聚乙二醇双水相体系萃取法进行研究。 2 2 材料 2 2 1 菌种 e n t e r o b a c t e rs p r s y b 0 8 2 ( 本课题组筛选) 6 第二章酸性脲酶的制稀 2 2 2 试剂 溶菌酶购自上海蓝季科技发展有限公司，牛血白蛋白购自s i g m a 公司，其余试剂均 为国产分析纯。 2 2 3 仪器 详见表2 1 表2 1 主要仪器一览表 t a b 2 11 1 1 el i s to fi n s t r u m e n t 2 3 方法 2 3 1 溶液的配制 ( 1 ) 种子培养基( g l ) 葡萄糖2 0 ，蛋白胨1 0 ，牛肉膏1 0 ，酵母膏5 ，k h 2 p 0 4 2 ，n a c l5 ，n a a c 2 ，尿素5 ， p h 值7 0 ( 用n a o h 调节) 。 ( 2 ) 发酵培养基( l ) 葡萄糖2 0 ，蛋白胨1 0 ，牛肉膏5 ，酵母膏5 ，k h 2 p 0 42 ，n a c l5 ，n a a c2 ，尿素5 ， 四水硫酸锰0 0 5 ，六水硫酸镍0 0 5 ，p h 值5 5 ( 用3 0 h c l 调节p h ) 。 其中尿素单独灭菌。 ( 3 ) 柠檬缓冲液 分别用分析天平准确称取柠檬酸1 0 5 0 7 9 和柠檬酸三钠1 4 7 0 5 9 。分别定量于1 l ， 将上述两种溶液混合，用酸度计调配成p h 4 5 ，0 0 5 m o l l 的柠檬酸缓冲液。 ( 4 ) 显色剂 显色剂i ：15 9 苯酚加0 6 2 5 9 亚硝基铁氢化钠定容至2 5 0 m l 显色剂i i ：1 3 1 2 5 9 氢氧化钠加7 5 m l 次氯酸钠定容至2 5 0 m l ( 5 ) 反应终止剂 1 0 的三氯乙酸溶液( w v ) ( 6 ) 铵离子标准溶液 将5 3 5 9n h 4 c 1 溶于柠檬酸缓冲液( p h 4 5 ，0 0 5 m o l l ) ，并定容至l l ，配成0 1 m o l l 的n h 4 c 1 溶液，并以此为母液，用缓冲液配制0 1 、o 2 、o 3 、o 4 、0 5 m m o l l 的n h 4 + 标准溶液。 ( 7 ) 3 尿素溶液 江南火学硕士学位论文 将3 9 尿素溶于l o o m l 柠檬酸缓冲液( p h 4 5 ，0 0 5 m o v l ) 。 2 3 2 茵体制备 将菌种从斜面培养基接种到种子培养基，培养1 6 小时，然后接种到发酵培养基中， 3 4 c 下培养2 8 小时后，将发酵液在6 0 0 0 r m i n 下离心1 5 m i n ，收集菌体，经去离子水洗 涤一次，柠檬酸缓冲液( 5 0 m m o v l ，p h 4 5 ) 洗涤一次，离心收集菌体。 2 3 3 酶活测定及酶活定义 ( 1 ) 酶活的测定 采用b e r t h e l o tr e a c t i o n 法 3 8 。取两支2 5 m l 比色管各加入0 2 m l 酶液，其中一支 作为对照加热煮沸5 m i n ，使酶失活。然后在两管中分别加入o 8 m l 尿素溶液，在3 7 恒温水浴箱中反应1 5 m i n 后，在两管各加入l m l 终止剂，混匀后加入l m l 的显色剂i 和l m l 显色剂i i ，强烈震荡，继续在3 7 恒温水浴箱中保温2 0 m i n 后取出，用蒸馏水 稀释到2 5 m l ，6 2 5 n m 处比色，并记录o d 值。 ( 2 ) 酶活定义 在常压，3 7 ，p h 4 5 条件下，每分钟分解尿素产生1 l m o l 氨为一个酶活力单位。 2 3 4 蛋白浓度的测定 蛋白浓度根据b r a d f o r d 法【3 9 】测定，以牛血白蛋白为标准蛋白。 2 3 5 细胞破碎率d 的测定 采用菌落计数法测定细胞破碎率d 。 。= ( - 蔫 1 0 0 2 3 6 酶活回收率尺的测定 尺= 鬈圳。 2 3 7 高压匀浆法破碎细胞 以每克湿菌体加1 0 倍体积的柠檬酸缓冲液( 5 0 m m o l l ，p h 4 5 ) ，配成1 0 0 9 l 的菌 悬液。 ( 1 ) 匀浆压力对细胞破碎的影响 分别取2 0 0 m l 菌悬液在2 0 m p a 、4 0 m p a 、 6 0m p a 、8 0m p a 、10 0m p a 压力下各 匀浆一次，裂解液在1 0 0 0 0 r m i n 下离心2 0 m i n 后取上清液，然后测定不同匀浆压力下细 胞破碎率和上清液单位酶活。 ( 2 ) 匀浆次数对细胞破碎的影响 分别取2 0 0 m l 菌悬液在最佳破碎压力下处理1 、2 、3 、4 、5 次，裂解液在1 0 0 0 0 r m i n 下离心2 0 m i n 后取上清液，测定不同匀浆次数的细胞破碎率和上清液单位酶活。 ( 3 ) 菌体浓度对细胞破碎的影响 分别取2 0 0 m l 浓度为5 0 9 l ，1 0 0 9 l ，1 5 0 9 l 的菌悬液，在最佳压力和匀浆次数下匀 浆破碎，裂解液在1 0 0 0 0 f f m i n 下离心2 0 m i n 后取上清液，测定不同菌悬液浓度条件下的 细胞破碎率和上清液单位酶活。 第二章睃件脲酶的制备 2 3 8 超声法破碎细胞 以每克湿细胞加5 倍体积的柠檬酸缓冲液( 5 0 m m o l l ，p h 4 5 ) ，配成浓度为1 5 0 9 l 的菌悬液，在4 c 的下预冷，然后浸置在冰水中，超声波破碎，处理量4 0 4 5 m l ，破碎 功率3 0 0 w ，破碎时间为1 0 m i n ，将裂解液于1 0 0 0 0 r m i n 下离心2 0 r n i n ，收集上清液， 测定细胞破碎率及上清液酶活。 2 3 9 溶茵酶与超声法结合破碎细胞 以每克湿细胞加5 倍体积的柠檬酸缓冲液( 5 0 m m o l l ，p h 4 5 ) ，配成l5 0 l 的菌 悬液，按o 6 m g m l 的加量加入溶菌酶，在3 5 c 下，处理1 小时，然后在4 c 的下预冷， 浸置在冰水中进行超声波破碎，破碎功率3 0 0 w ，破碎时间为6 m i n ，将裂解液于4 c 下 1 0 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n ，收集上清液，测定细胞破碎率及上清液酶活。 2 3 1o 双水相萃取酸性脲酶 ( 1 ) 双水相相图的绘制 根据a l b e r t s s o n 的方法【4 0 】绘制相图：将已知浓度的磷酸氢二钾逐滴加入到已知量的 聚乙二醇溶液中，直到出现浑浊。记下此时的体系组成，并向体系中加入1 9 水，摇匀 使溶液再次变澄清后重复上述操作。以所记录的一系列磷酸氢二钟的浓度为横坐标，相 应的聚乙二醇浓度作为纵坐标作图即得双水相相图。 聚乙二醇和磷酸氢二钾的浓度根据如下公式计算： x ： 里 1 0 0 p + q + w 】，：一! 1 0 0 p + q + w 其中： p - 在某成相点时聚7 , - - 醇在系统中的总量( g ) g - 在某成相点时磷酸氢二钾在系统中的总量( g ) w 在某成相点时水在系统中的总量( g ) 再在某成相点时磷酸氢二钾的质量分数 y - 在某成相点是聚乙二醇的质量分数 ( 2 ) 双水相体系的制备 配制5 0 ( w w ) 聚乙二醇储备液和5 0 ( w w ) 磷酸氢二钾，利用其配制不同浓度、p h 及离子强度的体系，每个体系改变一个参数。计算好聚乙二醇和磷酸氢二钾的配比。用 盐酸调节体系的p h 。由于储备液黏度比较大，为减少误差，备用液的加入量不用体积， 而以质量计算。用干燥的带刻度5 0 m l 离心管准确称取计算好的聚乙二醇储液和磷酸氢 二钾储液，在混合器上混匀，再j 3 1 l n 1 0 9 粗酶液，体系总量定为3 0 9 ，不足部分用去离子 水补齐至定值，在混合器上混匀。然后2 0 0 0 r m i n 离一l 二, 3 m i n 使系统完全分相，根据离心管 刻度读出上下相的体积。用吸管将上下相分别吸出，上下相分离后分别在p h 4 5 的柠檬 酸缓冲液中，4 下充分透析2 4 h 后，测定上下相酶活力及蛋白浓度。 有关计算公式： 9 江南大学硕士学位论文 分配系数： k = 了c l 乙2 相比 r = 甍 如果目的蛋白分配在下相： 回收率】，：f 2 x f 2 1 0 0 纯化因子p = 糕 式中： g 、o 分别代表上下相单位体积脲酶活力，u m l 。 耽、分别代表上下相体积。 彳一总酶活 2 4 结果与分析 2 4 1 匀浆压力对细胞破碎过程的影响 匀浆压力 细胞破碎率0 上清液酶活 图2 - 1 匀浆压力对细胞破碎过程的影响 f i g 2 - 1e f f e c to fh o m o g e n i z a t i o np r e s s u r eo i lc e l ld i s r u p t i o np r o c e s s 图2 1 是在不同压力下匀浆一次细胞破碎率和上清液相对酶活的变化曲线，由图可 以看出在细胞破碎率和上清单位酶活随着匀浆压力的增大而增大，在3 0 7 0 m p a 之间上 清液酶活增加比较快，而过了8 0 m p a 后上清液单位酶活增加趋势减弱。考虑到过高的 匀浆压力一方面会产生大量的热，对酶的稳定性不利，另一方面过高的压力也会增加能 耗及设备的磨损。综合以上因素，匀浆压力选定在8 0 m p a 。 2 4 2 匀浆次数对细胞破碎过程的影响 图2 2 是在8 0 m p a 的压力下匀浆次数对细胞破碎过程的影响。 1 0 第二章酸性脲酶的制备 细胞破碎率。上清液酶活 图2 - 2 匀浆次数对细胞破碎过程的影响 f i g 2 2e f f e c to fh o m o g e n i z a t i o np a s s e so nc e l ld i s r u p t i o np r o c e s s 由图可以看出随着匀浆次数的增加细胞破碎率逐渐增加，而相对酶活则在匀浆3 次 后趋于不变，此时再增加匀浆次数对酶的释放已没有太大的意义，而且过多的匀浆次数 同样会产生大量的热，并且会使细胞碎片变小而不利于后面的分离。综合以上分析，最 佳的匀浆次数为3 次。 2 4 3 茵体浓度对细胞破碎过程的影响 表2 2 是在8 0 m p a 压力下匀浆三次，菌体浓度分别为5 0 9 l ，1 0 0 9 l ，1 5 0 9 l 时对 细胞破碎过程的影响。可以看出，当菌体浓度为5 0 9 l ，l o o g l 和1 5 0 9 l 时细胞破碎率 变化不是太明显，为了提高效率节约时间所以菌体浓度以1 5 0 9 l 为宜。 表2 - 2 茵体浓度对细胞破碎过程的影响 t a b 2 - 2e f f e c to fc e l lc o n c e n t r a t i o no nc e l ld i s r u p t i o np r o c e s s 垩垂虿：二兰= 望s塑璺壁! 兰2圭望鳖兰竺竺望! ! 竺兰 5 09 13 0 1 0 08 85 3 15 0r 67 5 2 4 4 不同破碎方法的比较 表2 3 不同破碎方法的比较 t a b 2 3d i f f e r e n tm e t h o d so nc e l lr u p t u r e 谜旦 细胞破碎率( ) 酶活回收率( )操作简便性 高压匀浆法 9 0 1 1 2 简便 超声法 7 86 4 6 简便 溶菌酶+ 超声 9 6 8 0 较复杂 由表2 3 中数据可以看出高压匀浆法、超声法和溶菌酶处理加超声法破碎细胞的各