（食品科学专业论文）植物乳杆菌的分离鉴定及其作为食品级基因工程受体菌的特性研究.pdf

摘要由于乳酸菌的益生作用，乳酸菌分子生物学及作用机制成为近年来学术界的研究热点。乳酸菌中的乳杆菌属自身的免疫原性和优良的胃肠道定植能力使得其作为食品级基因工程受体菌的应用前景十分广阔鉴于乳杆菌属中的植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u a p l a n m r u m ) 在食品、饲料和医疗行业的巨大商业价值，本研究旨在从食品原料中分离鉴定获得植物乳杆菌，并从中筛选到一株有望成为食品级基因工程受体菌的菌株，同时鉴定该受体菌的抗突变活性，以期筛选出一株自身具有抗突变活性并且能够成为食品级基因工程受体菌的优良菌株。本研究从韩国泡菜中分离纯化出五株菌l a c t l 、l 丑c 1 2 、l a c t 3 、l a c t 4 和【丑c t 5 ，经形态学、生化、生理鉴定和1 0 sr d n a 全序列分析鉴定，将测序结果在g e n b a n k 上进行b l a s t 比对，构建系统发育树，鉴定出五株菌均与植物乳杆菌的亲缘关系最近选择没有天然质粒存在且是n i s i n 敏感的菌株作为食品级基因工程受体菌的候选菌株，使用带有n s l 基因作为n i s i n 免疫选择标记的食品级克隆载体p l e b 5 9 0 对其进行转化，优化电转化条件，得出使用含有终浓度为6 甘氨酸的m r s 制各感受态细胞，2 k v 电压下，最高可得到8 2 0 4 x 1 0 3 转化子肛喀质粒d n a 。携带载体p l e b 5 9 0 的菌株可以耐受最大为5 5 0i u m l 的n i s i n 浓度，并且在n i s i n选择压力下能够保持外源质粒的遗传稳定性。利用s o s 显色反应鉴定出1 a c t 2 对基因毒素4 - n q o 具有抗突变活性，且抗突变率约6 4 本课题初步筛选到一株自身具有抗突变活性并且有潜力成为基因工程受体菌的植物乳杆菌，为利用n i s i n 免疫作为筛选标记的食品级表达体系的构建奠定了基础关键词：植物乳杆菌，分离鉴定，食品级，受体菌，转化效率，抗突变活性a b s t r a c tb e c a u s eo ft h e kb e n e f i c i a le f f e c t s , t h e r eh a v eb e e nc o n s i d e r a b l ei n t e r e s t si nt h em o l e c u l a rb i o l o g ya n da c t i o nm e c h a n i s mo fl a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) c o m p a r e dw i t hl a c t n e o c c u s ，l a c t o b a c i l l u sf i r et h eb e t t e rc h o i c eo fh o s ts t r a i nf u rf u o d - g r a d eg e n ee n g i n e e r i n gd u et ot h e i ri m m u n o g e n i c i t ye n de x c e l l e n ta d h e r e n c et og a s t r o - i n t e s t i n a lt r e c li nv i e wo ft h eb i gc o m m e r c i a lp r o f i t so ft h es p e c i 锚l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mw h i c hh a v eb e e nw i d e l yu s e d 缸f o o d , f e e de n dm e d i c a li n d u s t r y , t h ea i mo ft h i sw o r kw a st os e p a r a t ee n di d e n t i f yt h el a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ms t r a i n s , s e l e c tah o p e f u lh o s ts t r a i nf u rf o o d - g r a d eg e n ee n g i n c e r i n g , e n dc h a r a c t e r i z et h ea n t i m u t a g e n i ca c t i v i t yo f t h es t r a i n f i v es 把a i n $ o f l a b w e 他i s o l a t e d f n a n k o l c a a p i c k l e s ，n a m e d l a c t l 、l a c t 2 、l a c l 3 、l a c t 4 e n dl a c t 5 o nt h eb a s i so fm o r p h o l o g y , p h y s i o l o g i c a le n db i o c h e m i c a lf e a t u r e sw i t h1 6 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i s , t o g e t h e rw i t ht h eb l a s to ft h e1 6 sr d n as e q u e n c eo b t a i n e db yd n as e q u e n c i n gi no e n b e n k 龃dt h ep h y l o g e n i cu e e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ef i v es t r a i n sw 0 1 1 l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m t h ef c o d - g r a d ev e c t o rp l e b 5 9 0w i t ht h en s g e n ea sn i s i ni m m u n i t ys e l e c t i o nm a r k e rw a se m p l o y e dt oe l e c 自r o t r e n s f u r mt h ec r y p t i cp l a s m i df r e ea n dn i s i ns e n s i t i v es w a i nl a c c z t h eo p t i m u me l e c t r o p o r a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h en 均墨i i 衄mt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yw e l t ei n c l u s i o no f6 g l y c i n ei nt h eg r o w t hm e d i u mm r s ，w i t ht h ee l e c t r i cp i l l s eo f2 k v u n d e rs u c hc o n d i t i o n st h ef f a n e f o r m a t i o ne f f i c i e n c yo fl a c t 2w a s8 2 0 4 x 1 0 c f up e r j go fp l a s m i dd n a l a c t 2c a r r y i n gp l e b 5 9 0w a ss h o w nt ob ea b l et og r o wi nm e d i u mc o n t a i n i n gam a x i m u mo f5 5 0i un i s i n m l , e n dt h eh o s ts t r a i nc o u l dm a i n t a i nt h es e g r e g a t i o n a ls t a b i l i t yo fp l e b 5 9 0u n d e rs e l e c t i v ec o n d i t i o n s l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ml a c t 2e x h i b i t e da n t i m u t a g e n i ca c t i v i t ya g a i n s tg e n o t o x i n4 - n q ou s i n gt h es o s - c h r o n m t e s t , a n dt h ea n t i m u t a g e n i ci n 砷o i f i o na p p r o a c h e d6 4 w eh a v es e l e c t e das u l i nw i t hp o t e n t i a la sh o s tf u rf u o d - g r a d eg e n ee n g i n e e r i n ga sw e l la sp o s s e s s i n gt h ee n t i m u t a g e n i ca c t i v i t y , a l lap r e p a r a t i o nf o rt h ec o n s i m c t i o no ff u o d - g r a d ce x p r e s s i n gs y s t e mw i t hn i s i ni m m u n i t ys e l e c t i o nm a r k e r k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m , s e p a r a t i o ne n di d e n t i f i c a t i o n , f u o d - g r a d e , h o s ta r a m ,b a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y , e n t i m u t a g e n i ca c t i v i t y缩略词表a b b r e v i a t i o n4 - n i t r o q u i n o l i n e - 1 - o x i d ea m p i c i l l i nc o l o n yf o r m i n eu n i tc o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i dd i m e t h y ls u l f o x i d ee i h i d i u mb r o m i d ee t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e f i ca c i dg e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f el s o p r o p y l - b - d - t h i o g a l a c t o s i d ei a n o l e i c a c i dl a c t i c a c i db a c t e r i an t s i nc o n t r o le x t o l ls y s t e mo p t l c a id e n s i t yo - n i t r o p h e n y l - b - d - g a l a c t o p y r a n o s i d eo p e n i n gr e a d i n gf r a l l l ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np - n l t r o p h e n y l p h o s p h a t es o d i u md o d e c y ls u l f a t eh y d r o x y - m e t h y l - a m i n om e t h a n e5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - n d o l y l - b , - d - g a l a c t o s i d e4 - 硝基喹哼卜1 氧化物氨苄青霉素菌落形成单位共轭亚油酸二甲基亚砜溴化乙锭乙二氨四乙酸公认为安全级异丙基硫代如半乳糖苷亚油酸乳酸苗n i c e 系统光密度邻硝基苯- a - d 砒哺半乳糖营开发阅读框聚合酶链式反应对硝基苯磷酸二钠十二烷基磺酸钠三羟甲基氨基甲烷5 溴- 4 氯3 四i 哚- b - d 半乳糖一娜唧姒一髓一一|堇队m一沁腿一誊|置剐独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：乞乃受时间：圳年钼i 歹日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：t 乞彳良时间：出一7 年石月，泊导师签名：7 引肚时间：年月日第一章绪论益生菌( p r o b i o t i c s ) 可以通过定植作用改变宿主某一部位菌群组成，发挥许多健康功效，是一种对宿主的生命健康有益的天然生物活性制剂在所有益生菌当中，乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ，l a b ) 是目前最受重视，研究得最深入的一类乳酸菌被公认为安全级( g e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ，g r a s ) 微生物，并且已经广泛应用于食品工业、饲料工业、医疗和保健等行业在过去的= 十多年里，国内外的科研工作者开始致力于对乳酸菌分子生物学及作用机制的研究，以乳酸球菌，乳酸杆菌和双歧杆菌作为基因工程的受体菌，在生物反应器内发酵食品或赢接在人和动物消化道内分泌蛋白等，使之表达一些有用的外源基因( 酶基因，抗性基因、某种营养因子的基因等) ，扩大其生物学特殊功能，构建出粘附定植能力强、菌株稳定、耐氧、耐酸、耐抗生素的优良菌株，通过分子生物学技术的不断进步为人类探索其新的应用潜力四1 1乳酸菌食品级基因工程菌的研究进展1 1 1 乳酸菌的定义和分类乳酸蘑是一大类发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性球菌和杆菌的统称。乳酸菌的一些基本特征为：兼性厌氧或严格厌氧；细胞为革兰氏阳性；细胞形态呈球状或杆状；过氧化氢酶为阳性；消耗的葡萄塘5 0 以上产生乳酸；不运动或极少运动；分解蛋白质，但不产生腐败物质；脂肪分解能力较弱。乳酸菌为化能异养型微生物，代谢活动需要单糖，尤其是以葡萄糖为碳源和能源，经发酵作用将单糖转变为低分子的乳酸和其他有机酸，获取生命代谢需要的能量目前在自然界已发现的乳酸细菌在细菌分类学上划分为2 3 个属。这些属包括：乳杆菌( l a a o b a c i u ) 、肉食杆菌属( c 4 m d k 瞳帕m ) ，双歧杆菌属( b i f m o b a c t e r i u m ) , 链球菌属( s t e p t o c o c c u s ) 、肠球菌属( e n t e r o c o c 淄) 、乳球菌属( l a c t o c o e ) 、明串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 、片球菌( r 耐6 口口a 笞) 、气球菌属似d 删、奇异菌属( a t a p o b u m ) ，漫游球菌属( 坛g o c c 淞) 李利斯特氏菌属伍括蛔妇) 、芽抱乳杆菌属( s p o r o l a c t o b a c i l l u s ) 、环丝菌属( b ，= d c 黼妨，丹毒丝菌( e r y s i p e l o l h r i x ) , 孪生菌属( c e m e l t a ) , w 球菌属鼬c c 妇m 岫，四联球菌属( t e t r a g e n o c o c c u s ) ，酒球菌属( o e n o c o c c u s ) ，乳球形菌属( l a c t o s # a e r a ) , 营养缺陷菌属( a b i o t r o p h i a ) , 魏斯氏菌属( 舷姗) 和芽抱杆菌属伽础泌) 中的少数种翻1 1 2 食品级基因工程菌食品级基因工程菌( f o o d g r a d eg e n e t i c a l l ye n g i n e e r i n gm i c r o o r g a n i s m s ) 是指被导入源于中再农业 学硕士论文第一章绪论同种或公认的安全的食品级微生物的基因，并因此而具有某种优良性状的用于发酵食品生产的微生物。其基因修饰过程应满足下列要求：( 1 ) 功能性基因必须源于同种菌或公认的安全的食品级微生物；( 2 ) 载体必须是食品级的，不得含有非食品级的功能性d n a 片段；( 3 )选择性标记不得选用各种抗生素抗性标记，防止抗生素抗性基因随菌体进入人体，应选用食品级的标记基因，如糖类利用标记，营养缺陷型标记等；( 4 ) 宿主菌的遗传特性清楚且稳定，具有足够的安全性，应选用适当的分子生物学方法如d n a 序列分析、杂交等确定宿主菌的遗传组成嘲。目前所研究的作为食品级基因工程受体菌的g r a s 细菌主要是乳酸菌，种类主要包括乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌。在食品级基因工程乳酸菌的研究方面，乳酸细菌的2 3 个属之间的差异很大，即使同一属的不同种之间也有很大差异如l a c t o b a c i l l u s 属包含5 0 多个种，在生化、生态、分子生物和免疫方面各有不同的特征。l 出砌删和向1 ，l “幻”的d n a 中g 制c 含量约为5 0 ，而l a c i d o p h i l u s 和l h e l u e t i c m 的d n a 中g + c 含量约为3 6 ，d n a 中o + c 乍r 量的差异反映出各个种之间有很大的不同；在转录和翻译的控制水平上，种与种之间也有很大的差别，这暗示着从一个生物体中获得的知识不能简单的套用在另一生物体上例如，在某一乳杆菌种高效表达的基因并不一定在所有其它乳杆菌中表达，可能是具有不同的表达程度或不同的基因表达调控机制因此在乳酸菌基因工程研究中，受体系统和载体系统都受到了一定程度的重视。1 1 3 乳酸菌食品级基因表达系统研究进展1 1 3 1 食品级基因表达系统食品级基因表达系统一直是微生物遣传学研究乳酸乳球菌分子生物学及载体系统的重要目标乳酸菌食品级基因表达系统必须具备如下基本条件：( 1 ) 载体必须是食品级的，不得畲有非食品级功能t d n a 片段最有效的办法是用对人体安全的食品级标记替代抗生素抗性标记以建立食品级选择性标记的载体( 萄表达宿主必须是安全的、特性清楚而稳定的食品级微生物，如乳酸球菌、乳酸杆菌及其它已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株( 3 )诱导物必须是食品级的。如乳糖、蔗糖、嘌岭、嘧啶、乳链菌肽等可被人食用的物质。l 1 3 2 乳酸菌食品级表达载体目前对于乳酸菌基因克隆、表达载体研究比较透彻的是乳酸乳球菌。对于乳球菌克隆载体主要有复制型质粒载体系统和染色体整合型载体系统两类；对于乳球菌表达载体主要有组成型表达载体、诱导型表达载体、和分泌载体。由于乳球菌的研究早于乳杆菌，目前对于乳球菌的基因表达系统已经完善，并克隆了一些外源基因。而乳杆菌的遗传背景并不透彻了解。在以乳杆菌复制子构建的载体未能利用的时候，乳球菌质粒载体( 如p g k l 2 的一些广宿主载体) 一直作为乳杆菌基因转化系统发展的工具。然而带有乳球菌复制子的载体很少能在乳杆菌中稳定存在，而用乳杆菌复制子构建的载体，在无选择压力下，传代1 0 0 次以上，仍能稳定存在随着基因工程技术的发展，已分离出了乳酸杆菌的各种表达调控元件，对乳酸杆菌2中f 农业上硕士论文第一章绪论基因转录和翻译调控及蛋白质分泌机制有了进一步的了解，并通过对部分质粒d n a , 宇列的测定，然后同已知序列质粒的基因进行比较来推测未知质粒基因功能的途径，相继开发出了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体、整合载体嘲1 9 7 6 年a n s s y 等人首次发现乳酸杆菌中存在天然质粒婀，接下来在乳杆菌的许多种类中均发现天然质粒的存在。虽然质粒普遍存在乳酸杆菌中。但大多数质粒，尤其是小质粒均属隐蔽型的，对其的功能了解甚少但有些质粒编码功能已经明确，并被应用于乳酸杆菌的鉴定、定型、载体构建及修饰。乳酸杆菌质粒具有如下特点：( 1 ) 大多数为隐蔽型质粒；( 2 )乳酸杆菌质粒具有遗传稳定性；( 3 ) 乳酸杆菌中小型质粒拷贝数高；( 4 ) 部分乳酸杆菌质粒复制子宿主范围广泛，可在其他种类的革兰阳性菡及大肠埃希菌中发挥作用；( 5 ) 乳酸菌属的某些菌株的质粒也可作为乳酸杆菌的质粒，如由宿主范围广的乳酸球菌质粒p g l 0 2 构建出的乳酸杆菌基因转化系统；( 6 ) 某些乳酸杆菌质粒没有宿主特异性，如p l p 5 0 1 、p l p e 3 2 3适用于广泛宿主范围，可在不同种类乳酸杆菌中增殖。研究发现乳酸杆菌质粒基因中普遍存在两种调控序列，一种是与基因复制起始相关的序列，主要包括两大类：一类是编码蛋白的开放阅读框架o r f ，在乳酸杆菌中与质粒复制相关的o r f - y _ 间存在同源性。另一类是与调控有关的非编码序列，主要包括复制相关蛋白作用的靶序列、芷负向复制起始点、缺失位点，启动子等复制调控元件i 另一种是控制质粒拷贝数和不相容性的肼q a 序列。1 1 3 , 3 乳酸菌食品级选择标记( 1 )乳酸菌抗性筛选标记( i ) n i s i n 抗性筛选标记m s i n 是乳酸乳球菌产生的由3 4 个氨基酸组成的抗菌肽，是一种高效无毒的食品添加剂，菌株的产n c q i n 和抗n i s 缸特性通常是共存的。利用n i s i n 抗性基圈凼r f f 为筛选标记筛选乳酸乳球菌转化子是研究最早的乳酸菌食品级抗性筛选标记系统m c k a y 等人于1 9 8 4 年获得了一个带有质粒复制起始区、多克隆位点和n i s i n 抗性决定子的独立复制子面m 0 1 1 构建了乳酸乳球菌的克隆载催8 ，并且消除n i s i n 敏感性菌株乳球菌l m 0 2 3 0 中的质粒便其成为没有质粒的菌株，利用构建的克隆载体成功的在该苗中表达了6 3 k b 的外源片段，使得乳球菌l m 0 2 3 0 可作为以栅r 为筛选标记载体的受体菌株罔。w d 窖h t 等人于1 9 9 0 # 构建了以n s t 为筛选标记的食品级受体，载体系统载体为7 8 k b 大小，带有乳酸乳球菌双乙酰亚种5 s d 2 0 7 一个2 8 k b 的隐蔽型质粒的复制子、乳酸乳球菌乳酸亚种1 0 0 8 4 的一个4 0 k b 臼 j 质粒p s f 0 1 上的n i s i n 抗性基因 及链球菌质粒载p g b 3 0 1的克隆位点受体菌株为n i s i n 敏感菌株m g l 6 1 4 唧( ) 免疫性标记免疫性标记基因大都只有几百个碱基，而且免疫性菌株和敏感菌株界限分明，这为它的应用带来了很多方便，最为著名的是美国卡罗莱纳州立大学a l l i s o n 等人利用约氏乳杆菌v p i3中田农竹k 学硕士论文第一章绪论1 1 0 船的堋作为标记基因，l a f l 是l a c t a c i nf 系统的免疫因子，使用克隆有“1 基因的重组质粒转化l a c 组c i nf 敏感菌株，转化子表现为对l a c t a c i nf 的免疫性。瑞士乳秆菌、德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、格氏乳杆菌、鸡乳杆菌、约氏乳杆菌及罗伊氏乳杆菌等敏感菌株均可作为受体菌株，这意味着以卵作为筛选标记基因在乳杆菌中将有广泛应用性。芬兰赫尔辛基大学1 m a 在2 0 0 2 年构建了食品级克隆载体p l e b 5 9 0 ，此应用于乳酸菌的食品级载体使用n i s i n 免疫的n i s ，基因作为选择标记。整个载体全部由乳酸乳球菌的d 1 峨片断构成：p s h 7 1 复制子、n i 虹基因、组成型启动子p 4 5 表达施瑾因将此载体电转化n i s i i l 敏感的乳酸乳球菌m g l 6 1 4 ，采用6 0i un i s i r d m l 的选择浓度，可以得到1 0 ，转化子肛惶d n a 。携带载体p l e 】弱9 0 的m g l 6 1 4 可以忍受最大为2 5 0i un i s i n m l 的n i s i n 浓度已经成功的将p l e b 5 9 0 电转化入带有多个隐蔽型质粒的发酵千酪用工业菌株，而且应用此载体已经成功的在植物乳杆菌中表达了来自瑞士乳杆菌的脯氨酸亚氨基肽酶的p e 硅因这些研究表明，载体口l e b 5 婀以较稳定的应用于食品级表达系统来表达外源基因以应用于食品工业m 】n i s i n 免疫基因是个相对较小的有效的抗性筛选标记，但很多工业菌株都具有n i s i n 抗性基因抗性限制了它的应用范围所以使用n i s i n 免疫基因构建食品级基因工程菌时，要选择n i s i n敏感菌株作为受体菌( ) 金属抗性w o n g 等人利用镉抗性为筛选标记，构建了食品级克隆载体p n d 9 1 9 ，并成功应用于嗜热链球菌s t 3 - 1 和s t 4 - 1 中【嘲l e e l a w a t c h a r a m a s 等) , 联合使用c u r 和n i s r 构建了双标记克隆载体p n d 9 6 8 ，插入外源片段后可失活其中的一个标记基因，减少假阳性转化子更便于实验操作，并己成功应用于乳球菌菌株 1 3 1 h u 等人利用n i s l 、c u 8 和g e x 标记单独使用或联合使用构建的全由乳酸乳球菌d n a 组成并且不含有任何抗生素抗性基因的食品级载体，都成功转化了乳酸乳球菌o q 。( i v ) 热应激蛋白4中国农业j 学硕士论文第一章绪论i i德国的h a s s 柚等人将编码小的热应激蛋白的s h s p 基因作为标记基因构建重组质粒，转化后的转化子获得了6 0 和p h 3 5 条件下的生长能力，并且具有高的筛选效率明。( 2 )乳酸菌互补型筛选标记目前已知的互补型筛选标记包括氨基酸营养缺陷型互补悯、胸苷酸营养缺陷型互补唧，糖类利用筛选标记嗍。互补型筛选标记需要有相应的基因缺陷型菌株作为受体，研究有一定的难度，使用中也有一定的局限性。而食品级抗性筛选标记不需要对受体菌株进行特别的处理，相对来说有一定的优势此外。作为载体带有一个筛选标记是必须的，如果同时具有一个插入失活筛选标记是比较理想的，因为这可以大大减少假阳性转化子，减少后期工作量。因此在国内开展食品级筛选标记系统的研究包括单标记和双标记是很有意义的。随着乳酸菌食品级载体，受体系统的逐步研究和完善也必将促进乳酸菌在更广泛领域的应用。( 3 )双组分系统筛选体系j 双组分系统筛选体系依靠两个成分而建立：第一个成分是一个携有完全由乳酸菌基因构成的功能性复制子但没有选择标记的克隆载体，第二个成分是伴生型质粒，它是一个以红霉素抗性基因为显性选择标记的复制缺失性质粒。构建的伴生质粒只能在乳酸菌中复制，由于只有含有克隆载体和伴生型质粒能用于筛选己获得克隆载体的细胞由于复制缺失性，伴生型质粒能很容易在筛选步骤中从无抗生素培养基中清楚。这种载体系统有很大的潜力。1 1 4 乳酸菌食品级基因工程受体菌的研究进展1 1 4 1 乳酸球菌作为食品级基因工程受体菌乳酸球菌是乳酸菌中的典型菌种，b o l o l m a 等人己将其全部基因组序列获得明乳酸球菌作为基因工程受体菌理想菌株的独特优势包括闭：( 1 ) 乳酸球菌是食品级g r a s 微生物；( 2 )乳酸球菌本身分泌蛋白较少。减少了对外源分泌蛋白的干扰；( 3 ) 乳酸球菌不产生任何细胞外蛋白酶，不会引起分泌蛋白在细胞外降解。同时乳酸球菌作为基因工程受体菌也存在缺点，就是乳酸球菌基本不在胃肠道内定植，使其因不能长期持续分泌外源蛋白而影响免疫效果删d er l 删人瞄1 研发出一种基于乳酸球菌础i i 哇启动子( 由施r 和n 捌- ( 组成) 的可调控表达系统( n i s i nc 灯0 le x p r e s s i o ns y s t e m ，n i c e s y s t e m ) n i s i n 是一种生物安全肽，在一些国家作为食品保鲜剂使用于食品工业中, n i s i n 调控表达系统可以根据需要严格控制外源蛋白的表达量，并且其诱导效率可达1 0 0 0 倍以上近年来由乳球菌表达的外源蛋白大多用此系统进行表达的。与此同时，也相继开发出一些根据环境条件如p h 值，温度或离子浓度等的调节乳球菌启动子的外源蛋白表达系统。由于外源蛋白在乳酸球菌中多数以分泌形式表达，科研工作者相继开发出多种适合于乳酸球菌的信号肽系列，为探索外源蛋自在乳酸菌中的大量表达奠定5中耳农业尺学硕士论文第一章绪论了基础。1 1 4 2 乳酸杆菌作为食品级基因工程受体菌乳酸杆菌中的绝大多数是公认安全级( o r a s ) 菌，其自身及其各种代谢产物对机体也有营养和免疫功能，再加上其携带的目的蛋白的专一性作用，集多种功能于一体，被广泛应用于食品及饲料加工业在功能食品、医疗保健、微生态制剂等领域的应用具有诱人的前景。乳酸杆菌作为基因工程受体菌，其优越性主要表现在：( 1 ) 乳酸杆菌能在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植。对维持微生态平衡具有重要作用；( 2 ) 身为食品级细菌，易构建成食品级的基因克隆及表达系统，可以有效提高基因工程产品的安全性，并可在一定程度上简化表达产物的后期处理工艺；( 3 ) 同肠胃外免疫途径相比，通过黏膜免疫，可以诱发i g a 产生i ( 4 ) 具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及对胆汁酸的抵抗力因此，乳酸杆菌作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔乳酸杆菌表达系统的研制成功可能会引起一场免疫学界的革命。用乳酸杆菌作为疫苗载体不仅可使口服的乳酸杆菌刺激产生粘膜及全身免疫反应，提高某些免疫活性因子分泌，而且可将特异性抗原分子携带并分泌到肠道，同时也可穿过肠壁进入粘膜下层，进而引起细胞免疫和体液免疫r e v e n e a un 与其同事嘲用破伤风毒素t i l ：c 作模型抗原，并将能利用t r f c以外的抗原开辟了乳酸杆菌作为活疫苗的真实前景。7用乳酸杆菌作为基因工程受体菌表达外源基因也是存在着缺陷的，如对乳酸杆菌表达调控的机制尚不太清楚，直接口服重组乳酸杆菌并不能在体内表达足量的抗原，长期低剂量的刺激可能导致机体免疫耐受，口服重组乳酸杆菌可能只对局部病变有较好的预防效果等但随着研究水平的提高通过对乳酸杆菌进一步改造、表达调控的认识不断深入和对免疫学特别是粘膜免疫机制的研究我们将会得到更为优良的益生乳酸杆菌基因工程菌l 1 4 3 双歧杆菌作为食品级基因工程受体菌国内外使用双歧杆菌作为基因工程受体菌的研究相对较少国外学者正努力寻找适用双歧杆菌基因工程载体，首选就是双歧杆菌质粒。国外学者m i s s i c h r 等人嘲成功地构建厦1 个大肠埃希菌长双歧杆菌的穿梭载体，该重组质粒分别转化大肠埃希菌和双歧杆菌，但转化双歧杆菌的效率远远低于转化大肠埃希菌，j c 寸双歧杆菌转化效率还有待于提高但随着基因工程技术的发展及研究水平的不断提高，双歧杆菌遗传分子机理的研究和基因工程菌的研制定会有更大的突破1 2植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 的研究进展植物乳杆菌( lp l a n t a r u m ) j 屠于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，最适生长温度为3 0 3 5 c ，能在1 0 生长，4 5 不生长，兼性厌氧，在p h 值4 5 9 5 f k ，最适p h 值6 5 左右。菌种呈短杆状，有时成对或成链状，不产芽胞；在l b s 琼脂培养基中呈灰白色、不透明、圆形、光6中国农业大学硕士论文第一章绪论滑、微小细密的菌落。属于同型发酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、l 山梨糖、乳糖、纤维二耱、木糖、蜜二穗、果糖、核塘、葡萄糖酸钠产酸，但发酵葡萄糖和葡萄糖酸钠均不产气屑于同型发酵类型中的兼性异型发酵群。接触酶阴性，明胶液化阴性，硫化氢试验阴性，淀粉水解阴性。产氨阴性、硝酸还原阴性、v p 反应阴性利用其发酵乳搪产酸处理乳清中乳糖转化时。具有其他菌无法比拟的优越性，它既可以高转化率地利用乳糖转化为乳酸，又可以利用乳清中残留蛋白质。植物乳杆菌是同型发酵乳酸菌，在发酵过程中只产生乳酸，是典型的兼性厌氧菌。有很强的发酵碳水化合物的能力，较耐盐，与其它乳酸菌有协同作用，在发酵香肠中的微生物中占绝对主导地位傅i 洁彬，1 9 9 9 ) 。1 2 1 植物乳杆菌的生理功能研究伫5 ll 工1 1 生物屏障作用植物乳杆菌通过与病原菌对限制性营养素的能力竞争，来抑制病原菌的生长，调节肠道微生态的组成，形成生物学屏障同时通过其代谢所产生的代谢产物乳酸、细菌素、以及双乙酰对其它细菌的作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生长及其毒素的粘附。l 工i 2 营养作用植物乳杆菌具有降低血清胆固醇水平，降低心血管疾病发病率的良好功效。自2 0 世纪7 0年代m 锄和s p r 敢现长期大量饮用当地野生乳杆菌发酵制品的非洲m 嘲i 部落人体内血清胆固醇含量普遍较低，迄今，已有大量实验证实，乳杆菌及其相关制品具有降低介质及血清胆固酵的能力其作用机理是乳杆菌产生的胆盐水解酶可以使结合胆酶分解为游离胆酸，在酸性条件下，游离胆酸与胆固酸发生共沉淀1 2 1 3 对于急性肝脏损伤的治疗作用急性肝脏损伤引起肠道向肠道外部位转移。而植物乳杆菌是肠道内的厌氧菌，能定殖防御和阻止肠道病原菌的过度生长，同时细菌素去除作用有利于肠道l g 分泌和巨噬细胞反应的提高1 2 1 4 对生氟糖苷的降解作用食品和饲料中的植物性原料常含有毒性和抗营养化合物，如生氰糖苷，植物乳杆菌的中b -葡萄糖苷酶具有较高的活性，能降解生氰糖苷酵母对生氰糖苷的降解有协同作用。植物乳杆菌分解苦杏仁苷分两步进行：苦杏仁苷变为苯乙醇氰葡萄苷，然后苯乙醇氰葡萄苷变为氰醇。用植物乳杆菌作为发酵菌能降解亚麻子中塘苷物质。7巾同生业大学硕士论文第一章绪论1 2 2 植物乳杆菌在食品中的应用1 2 工l 植物乳杆菌在发酵调味品中的应用植物乳杆菌在许多酸性发酵性植物食品中的应用广泛被认知，如对于泡菜、马兰西亚发酵榴莲o e m p o y a k ) 。t e m p o y a k 曾；有高水平的乳酸菌，一般范围为8 5 9 2 1 c f u g ，其中lp l a n t a r u m l i 为主要优势菌。在泡菜中起始发酵主要靠lm e s e n t e r o i d e s ，后被异性发酵l a c t o b c i l l i 代替，最主要的是耐酸性的异型发酵菌lp f 4 ，妇m 嘲。1 2 2 2 植物乳杆菌对泡菜中胺形成的影响泡菜中常有胺的存在，这些胺主要通过产胺微生物对氨基酸的脱羧作用形成。从食品中过量摄入胺会引起不良反应，故用科学方法生产泡菜，尽量降低产品中胺的含量，一直是人们所期望的k a l a e 等( 2 0 0 0 ) 以l p a n t a r u m 等为发酵菌生产泡菜，有效的降低了泡菜中胺的含量，取得的了令人满意的实验结果。胺在产品中下降的重要原因是泡菜生产过程中产胺微生物污染的防止，不产胺的接种菌也对污染菌有竞争性抑制作用嘲1 2 2 3 植物乳杆菌用于发酵干肠的影响干肠的风味形成是菌和碳水化合物、蛋白质、脂肪肌肉酶代谢的结果，对于北欧干肠而言，乳酸是主要的风味物质植物乳杆菌是同型发酵乳酸菌，在发酵过程中只产生乳酸，是典型的兼性厌氧菌，最佳生长温度为3 0 3 8 ，有很强的发酵碳水化合物的能力，较耐盐，与其它乳酸菌有协同作用，如：嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌以1 ：1 比例组合用于生物发酵香肠为最佳，其工艺条件为：3 0 c ，1 0 7d 1 1 g , 1 8 2 4 h ，在发酵香肠中的微生物中占绝对主导地位它的主要作用是按e h 舶p 途径发酵碳水化合物产生乳酸、降低香肠的p h 值产生有机酸、细菌素( b a c t c r i c i n ) ，过氧化氢、双乙酰等天然抑菌物质，从而控制大多数腐败菌及致病菌的生长，而且由于很低p h 降低了蛋白质的保水能力，有利干燥，其对产品的风味、质构及其稳定性起决定性作用嘲1 2 2 a 植物募杆菌在千酪成熟中的作用m 姗等在2 0 0 0 年以f i o r es a r d o 千酪成熟为例，研究了非发酵剂乳酸菌在干酪成熟中的作用，这些天然酸化产品的发酵和成熟过程中完全依赖于手工挤奶和千酪加工过程中存在或来自环境的天然微生物实验结果表明，l p 缸n 细删和l 胛，贼是f i o s a r d o 干酪中的优势菌，它们对h o r es a r d o 的成熟起至关重要的作用这些菌的准确作用尚不完全清楚，一般认为它们参与蛋白水解和形成氨基酸嘲s中用农业，：学硕士论文第一章绪论1 2 2 5 植物乳杆菌发酵生产共轭亚油酸共轭亚油酸( c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，c l a ) 是由必需脂肪酸亚油酸( l i n o i c i ca c i d ，t a )衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。共轭亚油酸具有很多营养和保健功能，特别是具有很强的抗癌、抗动脉粥样硬化和促进细胞分裂、阻止肌肉退化、延缓机体免疫力衰退等功能。将具有转化亚油酸能力的植物乳杆菌接入奶制品饮料中，该菌能将1 m 咖l 亚油酸n g n l 5 z0 5 昭御共轭亚油酸叨。1 2 3 植物乳杆菌作为基因工程受体菌的研究进展可作为基因工程受体菌的乳杆菌主要是植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热乳杆菌等几个种。鉴于植物乳杆菌在发酵蔬菜和青贮饲料等领域的应用，并可用来生产维生素和氨基酸等重要商业用途。近年来越来越多的研究热点集中于使用基因工程手段修饰改造植物乳杆菌，开发其在发酵工业中的巨大潜力：v a n d e r v o s s e n 等研究人员使用l p a n t a r u m8 0 作为受体菌，将载体p c v 4 6 1 转入菌株内表达了乳酸细菌素b ( a d d o e i nb ) ；1 9 9 9 年s h q g 等学者人将载体p e l $ 1 6 3 转化受体菌l 配p 蛔础期n c 8 高效表达了乳酸杀菌素s ( 1 a c t o c i ns ) ；s o n i a 等人于2 0 0 0 年在分离自人类肠道能j l b p a n t a r u mn c i m 8 8 2 6 使用质粒p m e c a 6 表到了抗原t t f c ，n c i m 8 8 2 5 已经成为研究口服疫苗载体的模式菌株；同年m a d e 等科研工作者以l b p l a n t a r u mn c i m 8 8 2 6i n t - 1 作为受体菌，同样利用载体p m e c 4 6 表达了报告基因g f p ；还有用植物乳杆菌表达a 淀粉酶和内切葡聚糖酶的报道虽然将植物乳杆菌作为基因工程的受体菌来表达外源蛋白具有巨大的商业价值，但是植物乳杆菌自身的限制修饰系统却使得外源基因的转入成为瓶颈所以开发一株具有潜力的植物乳杆菌食品级基因工程受体菌的关键是解决电转化问题。并且针对相应的食品级选择标记，受体菌应具有与其互补的形状，来实现基因工程操作中的转化子筛选问题，而且外源基因在菌株内的遗传稳定性也是需要考虑的因素1 3乳酸菌电转化的研究进展近年来，许多国家的科研工作者开始使用基因工程技术手段来开发乳酸菌的某种特定的为人类所需的功能特性。使用转换、结合、融合和转化等这些常用的技术可以把外源质粒载体转移至乳杆菌受体细胞内，d ev o s 和s i m o m 已于1 9 9 4 年成功的构建了岛印幻c c 姆和l a c t o c o c c u s 的基因工程菌株网。伴随着使用乳杆菌作为包括口服疫苗在内的外源蛋白的表达工具的开发，对于乳杆菌的转化也研究得越来越深入对于乳杆菌的基因转移系统，如果采用结合或者原生质细胞融合，则只能得到很低的转化效率电转化成为乳杆菌外源基因转入的最方便快捷的方法，自从h a r l a n d e r 和m c k a y 于1 9 8 4 年报道了电转化成功应用于链球菌的例子后，各国的研究学者开始广泛关注电转化应用于乳杆菌的研究干酪乳杆菌是第一个使用电转化方法转入外源基因并且能够得到高转化效率和质粒再生能力的菌株”从那9中w 农p 大学硕士论文第一章绪论以后，开始对乳球菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌等乳酸菌的电转化方法步骤进行了深入细致的研究。在当前的实验条件下电转化法并不十分完善，主要存在转化效率低、重复性差等缺点，原因主要包括：致密的革兰氏阳性菌细胞壁可以阻止d n a 进入细胞内，但用溶菌酶、甘氨酸或氨苄青霉素处理受体菌细胞，可以提高转化效率；乳酸细菌的不同培养时期对电击敏感程度存在着显著的差别，例如干酪乳杆菌培养到对数中期电转化频率最高，但乳链球菌则培养到稳定期或稳定前期得到最高转化效率；场强是影响电转化效率的一个非常重要参数，不同的乳酸菌株需要的适宜场强存在很大差异，例如保加利亚乳杆菌的最高转化效率只需要2 0 k v c m 的场强，同时干酪乳杆菌的最佳场强参数为1 2 5 k v c m ：转化缓冲液也是影响电转化效率的一个因素，一个原则就是当转化需要很高电压情形下，要尽量选用盐离子浓度低的缓冲液，防止细胞被高电压所击穿；影响电转化效率的其它因素还包括：受体菌的限制修饰系统爿e 特异性核酸酶、不表达的选择标记基因、载体的复制子、载体和受体菌本身固有质粒的不相容性。因此乳酸菌的转化效率具有菌株特异性，严格依赖于用于转化的载体和受体菌。1 4 乳酸菌的抗突变活性1 4 1 抗突变活性在细胞分裂时，由于遗传因素或非遗传因素的作用，