（分析化学专业论文）扫描激光诱导荧光显微镜的构建及其负反馈模式检测基底形貌.pdf

山东大学硕士学位论文 中文摘要 第一章中对几种扫描显微镜作了简要的综述。主要从原理、应用、特性以及 局限性等方面对扫描电子显微镜( s e m ) 、扫描隧道显微镜( s t m ) 、原子力显 微镜( a i m ) 、扫描近场光学显微镜( s n o m ) 、扫描电化学显微镜( s e c m ) 、 共聚焦激光扫描显微镜( c l s m ) 等几种扫描显微镜作了简要介绍。本章共引用 文献7 2 篇。 第二章中我们设计了一种新的扫描探针显微镜扫描激光诱导荧光显微 镜( s l i f m ) ，并自己组装了一套新仪器。本仪器分为三部分：激光诱导荧光扫 描系统，高灵敏的荧光检测系统，用于控制激光诱导荧光扫描系统、收集荧光信 号、处理数据的软件系统。我们将光纤的一端固定在显微镜物镜的聚焦点上，另 一端作为光探头固定在由三维马达和压电驱动器构成的三维操纵器上。通过计算 机中软件控制三维操纵器使光纤探头在研究对象上方沿x 、y 、z 轴方向以微米 尺度移动，通过检测器( p m r ) 收集信号，利用c h l 9 1 0 b 软件对研究对象进行 分析检测。利用该仪器我们得到了光纤向盛有荧光物质的检测池基底移动时的逼 近曲线，表征了微池中液面的形貌及微池的大小，测得的结果与实际大小一致， 另外还对固定在基底上的h r p 酶点的形貌进行了表征。 第三章中我们制作了一种在光纤检测端固定有酶分子的酶探头，并以这种酶 探头对溶液中底物的催化反应为基础构建了扫描激光诱导荧光显微术的负反馈 扫描模式。这种对光纤进行修饰并可以对基底进行检测的光学探头，在其他的扫 描探针显微镜中还未曾报道过。我们在光纤的端面上通过硅烷化的方法修饰了 h r p 分子制成可以导光的酶探头，h r p 可以催化溶液中a d h p 和h 2 0 2 反应生 成荧光物质试卤灵( r e s o m f m ) ，利用此催化反应得到了酶探头向盛有a d h p 和 h 2 0 2 溶液的检测池底部移动时的负反馈模式逼近曲线，并利用负反馈模式对在 玻璃基底上刻蚀的凸起的直线、倒“u ”形线，及“s ”形线进行了表征，得到 了图形的形貌图，并通过逼近曲线及对刻蚀的基底作的线扫描曲线可以测量出基 山东大学硕士学位论文 底上凸起线形的高度和宽度，测量得到的数据与实际大小相一致。 关键词：扫描激光诱导荧光显微镜酶探头逼近曲线表征基底形貌 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nc h a p t e ro n eo ft h i st h e s i s , s e v e r a ls c a n n i n gm i c r o s c o p ew a sr e v i e w e db r i e f l y w em o s t l ym t r o d u c e dt h ep 血c i p l e s , a p p l i c a t i o n , s p e c i a l i t ya n dd i s a d v a n t a g eo f s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s n m ) ，s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p e ( s t m ) ，a t o m i c f o r c em i c r o s c o p e ( ，s c a n n i n gn e a r - f i e l do p t i c a lm i c r o s c o p e ( s n o m ) ，s c a n n i n g e l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p e ( s e e s 0a n dc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e ( c l s d i nt h ec h a p t e r7 2 咖n e a s w e r ec i t e d i nc h a p t e rt w o ，w ed e v i s e dan o v e ls c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p e ：s c a n n i n gl a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ( s u f m ) ，a n da s s e m b l e dt h en e wa p p a r a t u sb y o u r s e l v e s t h ea p p a r a t u sc o m p r i s e ds c a n n i n gl a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c es y s t e m , h i g h s e n s i t i v e l yd e t e c t i n gf l u o r e s c e n c es y s t e m , s o f t w a r es y s t e mt oc o n t r o ls c a n n i n gs y s t e m , c o l l e c tf l u o r e s c e n c es i g n a la n da n a l y s ed a t a w ei m m o b i l i z e do n ee n do fao p t i c a l f i b e ro nt h ef o c u so ft h eo b j e c tl e n so fam i c r o s c o p e ，t h eo t h e re n du s e da so p t i c a l p r o b ew a s 丘x c d i nat h r e e - d i m e n s i o n a l m a n i p u l a t o r w h i c hc o m p i s e da t h r e e - d i m e n s i o n a lm o t o ra n dap i e z o e l e c t r i c i t yd r i v e r s t h et h r e e - d i m e n s i o n a l m a n i p u l a t o rc o n t r o l l i n gb ys o f t w a r ec o u l dm a k et h eo p t i c a lp r o b em o v eo v e rt h e o b j e c tw ei n v e s t i g a t e d i nx - y - zd i r e c t i o n s b ym i c r o ny a r d s t r i c k w eu s e d p h o t o m u l t i p f i e rt u b e 0 m 3a st h ed e t e c t i n ga p p a r a t u sa n du t i l i z 。dc h l 9 1 0 b s o f t w a r e t oa n a l y s es i g n a l s u s i n gt h i sa p p a r a t u sw eo b t a i n e dt h ea p p r o a c hc 1 1 r v ew h e nt h e f i b e rm o v et ot h eb o t t o mo fad e t e c t i o np o o lf i l l e dw i t hf l u o r e s c e n c em a t t e r , c h a r a c t e r e dt h ep a t t e r n so ft h es o l u t i o ns u r f a c e sa n dt h eh r ps p o t si n n n o b i l i z e do n t h eg l a s ss u b s t r a t e w ea l s oc o u l dg o tt h es i z eo ft h em i c r o p o o lb yt h es o l u t i o n $ u i f a c e s p a t t e r n ，w h i c hw a st h es a m ea st h em i c r o p o o l st r i ms i z e i nc h a p t e rt h r e ew ef a b r i c a t e dak i n do f “e n z y m ep r o b e w h i c hw a st h eo p t i c a l f i b e rm o d i f i e dw i t hh r pa n dc r e a t e dt h en e g a t i v ef e e d b a c km o d eo ft h es c a n n i n g l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p eb a s e do nt h ee n z y m ec a t a l y z i n gr e a c t a n t si n 进 山东大学硕士学位论文 t h es o l u t i o n t h i so p t i c a lp r o b e ，w h i c hw a sm o d i f i e do p t i c a lf i b e ra n dc o u l dd e t e c t s u b s t r a t e ，w a sn e v e rr e p o r t e da b o u to t h e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e w em o d i f i e dh r po n t h e o p t i c a l f i b e r se n ds u r f a c ev i as i l a n i z a t i o nt of a b r i c a t et h e e n z y m ep r o b e c o n d u c t i n gl i g h t h r pm o d i f i e do nt h ef i b e rc o u l dc o n v e r tt h es u b s t r a t e s ：a d i - i pa n d h 2 0 bt op r o d u c t ：r e s o r o f i n b yt h ec a t a l y z i n gr e a c t i o nw eo b t a i n e dt h ea p p r o a c hc m - v c o ft h en e g a t i v ef e e d b a c km o d ew h e nt h ee n z y m ep r o b em o v et ot h eb o t t o mo fa d e t e c t i o np o o lf i l l e dw i t hh r p ss u b s t r a t e s ，a n dc h a x a c t e r e dt h ee t c h e df i g u r e so nt h e g l a s s ，w ea l s oc o u l dm e a s u r et h eh e i g h ta n dw i d t ho ft h ef i g u r e so nt h eg l a s sv i a t h e a p p r o a c hc u r v ea n dl i n es c a n n i n gc u r v ea n dt h ed a t aw a s s a m et ot h eo b j e c t s f u l ls i z e k e y w o r d s ：s c a n n i n gl a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ( s e m i ) ；e n z y m ep r o b e ； t h ea p p r o a c hc u r v e ；i m a g es u b s t r a t e 山东大学硕士学位论文 s e m s t m a f m s n o m c l s m s e c m s l 咂m p m r h r p k 哑 p b s p d m s g o p s b s a 符号与缩写 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜 原子力显微镜 扫描近场光学显微镜 共聚焦激光扫描显微镜 电化学扫描显微镜 扫描电化学显微镜 光电倍增管 辣根过氧化物酶 1 0 - 乙酰基- 3 。7 - - - 羟基吩嗪 生理盐水 聚二甲基硅氧烷 3 - 环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷 小牛血清白蛋白 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责 任由本人承担。 论文作者签名：聋益趣日期：建珥坐堑 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者盘名：诬鳘葱导师签名 山东大学硕士学位论文 第一章扫描显微镜综述 1 1 引言 传统光学显微镜曾经是观测微观结构的唯一手段，但是随着科学研究的深入 和发展，它已不能满足人们对微观世界更小物体的观测以及对样品多种微观信息 的了解。传统的光学显微镜由于光的衍射效应使其分辨率只能达到光波半波长的 数量级( o 3 岬) ，即传统光学显微镜的放大倍数不能任意增大，这就是瑞利分 辨率极限。因此，为了提高分辨率，人们又发明了一系列的扫描显微镜，使得显 微技术在物理、材料、化学、生物、医学等多个领域得到了更广泛的应用。本章 对几种常用的扫描显微镜作一简要介绍。 1 2 几种扫描显微镜的简介 1 2 1 扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e 。s e m ) 在1 9 2 4 年德布罗意提出了微观粒子具有波粒二象性的概念后，科学家们在 物质领域找到了一种波长更短的媒质一电子，并利用电子在磁场中的运动与光线 在介质中的传播相似的原理，研制出以电子为光源的电子显微镜。s e m 的设计思 想早在上世纪3 0 年代就被提了出来，上世纪6 0 年代中期问世，因其分辨率高、 景深大、放大倍数调节范围广，被广泛应用于科学研究和工程实践中。 常规s e m 由以下基本部分组成( 见图1 1 ) ：产生电子束的柱形镜筒，电子 束与样品发生相互作用的样品室，检测样品室所产生信号的探头，以及将信号变 成图像的数据处理与显示系统。镜筒顶端电子枪发射出的电子由静电场引导，沿 镜筒向下加速。在镜筒中，将电子束作为照明源，电子束通过一系列电磁透镜聚 集变成极细( 直径5n l n 以下) 的电子探针并射向样品。靠近镜简底部，在样品 表面上方，扫描线圈使电子束以光栅扫描方式偏转。最后一级电磁透镜把电子束 聚焦成一个尽可能小的斑点射入样品，从而激发出各种成像信号，其高能量电子 与所分析试样物质相互作用，从而产生各种信息( 主要有二次电子、背反射电子、 俄歇电子、x 一射线、阴极发光、吸收电子和透射电子等) ，而各种信息的强度和 分布同试样的表面形貌、成分、晶体取向以及表面状态等因素有关。仪器( 具有 数字成像能力) 接受( 采集) 和处理探头送来的信号，并利用计算机技术进行处 山东大学硕士学位论文 理，便可以获得表述试样形貌的扫描电子象或者进行成分分析与结晶学分析。为 了保证初始电子束在达到样品表面前其所含电子不被气体分子散射，电子束行进 的整个路径需处于高真空状态，即不但要求电子枪、镜筒内各处是高真空，而且 样品室也必须维持高真空状态，通常达1 0 。3 p a 【1 】。 图l - ls e m 的结构不意图 扫描电镜的特性主要有：能直接观察大尺寸试样的原始表面；试样在样品室 中可移动的自由度大，可在三维空间平移、旋转、倾斜，可以方便的观察不规则 形状试样的各个区域的细节；景深长，图像富有立体感；图像的放大倍率可在较 大范围内调节，能在几倍至几十万倍范围内连续调节；分辨率远远优于普通光学 显微镜；试样损伤和污染程度较小( 相对于透射电镜) 。 正因为扫描电镜的诸多优点，使其在当今的材料分析、生物学分析及半导体 等多个领域得到广泛应用。利用扫描电镜可以在高达几千倍甚至几万倍放大倍率 下观察分析材料、矿物、微生物及微小元件的显微组织或微观结构，尤其适合于 对各种失效及故障进行诊断分析，也可以在几倍的低倍情况下对样品的全貌进行 观察分析。在其它附件仪器的配合下还可以同时进行微区成分分析，即对试样的 某一微观区域或某一点的化学成分分布情况进行分析，例如：目前，x - 射线能谱 分析仪( e d s ) 已成为s e m 的一个基本附件，如图1 2 ，它捕获高能电子束与被观 察样品相互作用产生x 射线、并进行处理及分析，从而能获得样品成分的定性、 半定量，甚至定量结果。如图1 3 所示的s e m 成分分析的结果，可以获得直观的 成分分布特征，这些特点是其他成分分析手段无法替代的【2 】。此外，背散射电子 山东大学硕士学位论文 像是由样品反射出来的初次电子所成，背散射电子发射系数与样品表面倾角和样 品的原子序数二者有关，背散射电子信号中包含了样品表面形貌和原子序数信息， 像的衬度既有形貌衬度，也有原子序数衬度，因此可利用背散射电子像来研究样 品表面形貌和成分分布，初步判断样品表面不同原子序数成分的分布状况。采用 背散射电子信号分离观察的方法，可分别得到只反映表面形貌的形貌图像和只反 映成分分布状况的成分图像。 图1 2 s e m 的e d s 成像系统 但是由于工作原理和结构上的一些限制，常规的s e m 使用性能和适用范围 都受到了很大影响。常规s e m 主要靠二次电子信号成像，为了保证有足够的二 次电子信号强度，必须保证在打到样品表面以前，初始电子在加速过程中不被气 体分子散射，因此整个路径需处于高真空状态( p 1 0 3p a ) ，以减少气体分子， 但高真空环境的引入使得s e m 的使用范围受到极大限制。首先不能在自然状态 下观察潮湿的、表面受污染的或微生物样品；其次观察绝缘样品时，必须对样品 进行金属化涂层处理，这不但使准备工作十分复杂、繁琐，而且经涂层处理后 s e m 观察到的图像已不再是样品表面图像而是涂层表面图像，二者不能肯定完 全相同。另外，s e m 信号探头使用光电倍增管放大原始成像信号，它对光、热 非常敏感，因此不能观察发光或高温样品，成像过程中观察窗、照明器都不能开， 给观察过程带来极大不便。 针对常规s e m 在使用过程中所暴露出来的缺陷，各种改进措旋应运而生， 其中最成功的是环境扫描电子显微镜( e s e m ) 的开发和实现。它所采用的关键 技术主要是在镜筒与样品室之间加装狭缝以使两者之间出现压力差，从而在保证 电子枪、镜筒内部高真空度的同时，大幅度降低样品室内的真空度，并且设计了 3 山东大学硕士学位论文 一个在气体压强较高的环境中仍能正常工作的二次电子探头。e s e m 最大的优点 在于允许改变显微镜样品室的压力、温度及气体成分。它不但保留了常规s e m 的全部优点，而且消除了对样品室环境必须是高真空的限制。潮湿、油腻、无导 电性的样品在自然状态下都可检测，无需任何处理。在气体压力高达5 0 0 0p a ， 温度高达1 5 0 0 ，含有任何气体种类的多气环境中，e s e m 都可提供高分辨率 的二次电子成像，使得常规s e m 的使用性能及适用范围大幅度改善【3 】。 1 2 2 扫描隧道显微镜( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p e , s t m ) 1 9 8 2 年，m m 公司苏黎世实验室的b i n n i n g 博士和r o h r e r 博士及其同事们发明 了扫描隧道显微镜( s t m ) ，使人类第一次进入原子世界，直接观察到了物质表面 上的单个原子。在两层金属之间夹一绝缘层制成一个隧道结，电子穿过隧道结就 会产生隧道电流，这就是量子力学中的电子隧道效应。扫描隧道显微镜就是利用 一根金属探针在被观测的金属表面上方相距1 0a 的地方进行扫描，于是探针空 气隙金属表面就构成了一个电子隧道体系。加一个微小电压后就会产生隧道电 流，在金属表面凹凸情况不同处就会产生不同厚度的空气隙，从而引起隧道电流 的急剧变化，通过隧道电流的变化可以使人们“看到”金属表面一个个原子，甚 至还可以分辨出百分之一个原子的面积，从而可以分辨金属表面原子结构的细微 特征，横向分辨率达1a ，纵向分辨率达0 0 1a 【4 】。 一般说来扫描隧道显微镜由三个大部分组成( 如图1 3 所示) ：隧道显微镜 的主体、控制电路、计算机控制( 测量软件及数据处理软件) 。主体主要包括针尖 平面扫描机构、样品与针尖间距控制调节机构、系统与外界振动的隔离装置。这 是s t m 的关键技术，s t m 是十分精密的仪器，任何微小的扰动都会引起电流的剧 烈变化，因此需要严格的隔离防震措施来保证原子级的分辨能力和稳定的图像。 针尖结构也十分关键，理想的针尖其最尖端只有一个稳定的原子，通常用钨或铂 铱合金为针尖材料，经过场蒸发等特殊工艺制备成探针针尖【5 】。 扫描隧道显微镜有广泛的用途。因为它具有原子级的分辨率，并能实时地观 测表面的三维图像，最适宜研究表面现象。固体表面有许多与众不同的性质，弄清 它们将能开发许多新技术、新产品和新材料，例如超晶格材料是用每层只有几个 晶格厚的两种不同材料交替叠合而成的，利用交界面处两表面上原子相互作用可 以产生许多新奇的性能。这样我们可以有目的地设计具有各种奇特性能的新材料， 4 山东大学硕士学位论文 如性能优异的半导体材料、高温超导材料等【6 】。 图1 - 3s t m 的结构示意图 s t m 不用高能电子束，样品不会因电子轰击而受伤s t m 可以在空气中使用， 还允许样品表面覆盖一层水，这样使生物样品始终处于活的状态，这使得s t m 在 生命科学中有广阔的应用前景目前人们可以通过s t m 直接观察d n a 分予的变 异结构，对d n a 直接进行研究，从而使生命科学进入一个全新时代。 自从s t m 发明后，世界上便诞生了一门以0 0 1 1 0 0n m 的尺度为研究对象的 前沿科学纳米科技纳米科技就是利用s t m 对表面进行纳米级加工，现在已 经有纳米生物学、纳米电子学、纳米材料学、纳米机械学和纳米化学等学科纳 米科技已经悄然进入我们的生活，在化纤制品和纺织品中添加纳米微粒可以消除 静电、除味、杀菌；食品采用纳米技术可以提高胃肠的吸收能力；玻璃和瓷砖表 面涂上纳米薄层，可以使粘污在其表面上的油污、细菌在光的照射下，由于纳米的 催化作用变成气体而成为自洁玻璃和自洁瓷砖；化妆品因为加入了纳米微粒而具 有了防紫外线的功能；灯泡、彩电、轮胎、陶瓷等产品都可利用纳米技术改变其 性能；利用纳米粉末可以使废水变成清水，实现环境保护【刀。 s t m 在纳米技术中最引人注目的成就之一是实旋单个原子的操作和控制。它 是通过调节针尖位置和所加偏压来改变针尖和表面原子之间力的大小和方向，从 而诱导表面单原子或分子完全脱离表面，或者使表面吸附原子发生横向移动而不 脱离表面，移动操纵的最终结果是表面吸附原子按照一定的规律进行排列。1 9 9 0 年美国i b ma l m a d e n 研究中心e i 西e r 研究小组【8 】使用工作在超高真空和液氮温 度( 4 2k ) 条件下的s t m ，成功的移动了吸附在n i ( 1 1 0 ) 表面上的惰性气体x e 5 山东大学硕士学位论文 原子，并用3 5 个x e 原子排列成“m m ”三个字样，开创了用s t m 进行单原子操 纵的先例。1 9 9 3 年e i g l e r 等【9 】用同样的方法进一步将吸附在c u ( 1 1 1 ) 表面上4 8 个f c 原予逐个移动并排列成一圆形量子栅栏，其直径只有1 4 2 6n m ，而且由于金 属表面的自由电子被局域在栅栏内，从而形成了电子云密度分布的驻波形态。这 是人类首次用原子组成具有特定功能的人工结构，其科学意义无疑十分重大。目 前s t m 不仅可以在样品表面上进行直接刻写、诱导沉积和刻蚀，还可以对表面上 的吸附质，如金属颗粒、原子团及单个原子进行操作，使它们从表面某一处移向另 一处，或改变它们的性质，以及填补表面的缺陷等等。 s t m 的出现为人类认识和改造微观世界又提供了一个十分重要的新型工具， 但是由于s t m 要求所观察的样品必须具有一定程度的导电性，对于绝缘体则无法 直接观察以及s t m 有时对样品表面微粒之间的沟槽不能够准确探测，分辨率较 差，再加上一般生物样品不是刚性结构，具有不同程度的柔软性等原因使得s t m 在生物医学上的应用也受到一定限制。 1 2 3 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e , a f m ) 扫描隧道显微镜问世以后，由于其可在多种环境下工作且制样简单，很快就 得到了广泛的应用，然而随着s t m 在表面科学和生命科学领域的广泛应用，它的 一些不足之处如样品必须导电等逐渐暴露出来，因此s t m 的发明者b i n n i g 等又 在1 9 8 6 年发明了基于样品一针尖相互作用力的高分辨原子力显微镜【1 0 】。a f m 是 通过探测探针与被测样品之间微弱的相互作用力( 原子力) 来获得物质表面形貌 的信息，分辨率可达原子级水平。a f m 的成像原理如图1 4 所示，采用一显微制作 的探针扫描待测样品表面，探针被固定在一根有弹性的悬臂的末端，悬臂通常由 金和硅的材料制成。探针在样品表面扫描时，测量探针与样品之间的相互作用力， 随着针尖与样品表面之间距离的不同，相应产生微小的作用力，就会引起悬臂的 偏转。反馈电路通过控制扫描头在垂直方向上的移动，使扫描过程中每一点上探 针和样品之间的作用力保持恒定；当激光束照射在悬臂的末端，经反射进入光电 检测器。针尖与样品表面的距离不同使得激光束的方向发生了改变，这就使光电 检测器接收到的信号变化，送入计算机的电脉冲也产生相应的变化，检测器将反 射的激光束转化成电脉冲，电脉冲信号经过计算机处理，然后计算机将这些信息 转换成或明或暗的区域，这样扫描头在每一点上的垂直位置被记录，作为样品表 6 山东大学硬士学位论文 面形貌成像的原始数据，从而产生了有明暗对比度的样品的表面形貌图像，可得 到样品表面的三维形貌图像【1 1 】。 光电二极管 c 图1 4 原子力显微镜的成像原理示意图 原子力显微镜主要功能是进行表面形貌的表征、表面物化属性的表征 【1 2 , 1 3 1 。目前通过控制并检测针尖一样品作用力，a f m 已经发展成为扫描探针显 微镜家族( s p mf a m i l y ) 中的一员，不仅可以高分辨率表征样品表面形貌，还可分 析与作用力相应的表面性质，以及对分子和原子进行操纵、修饰和加工，并设计 和创造出新的结构和物质。因此在材料科学、冶金，尤其是在生物及生命科学中 得到了广泛的应用。 在材料科学中的研究中，a f m 可以使研究者从分子或原子水平直接观察晶 体或非晶体的形貌、缺陷、空位能、聚集能、及各种力的相互作用【1 4 】 在冶金科学中，对矿物组成、冶炼过程中熔体及溶液中各种分子、原子、离 子配合物的变化认识，尤其是生物冶金过程的微观变化认识a f m 起着重要的作 用 1 5 1 。 在生物学的研究中a f m r - 泛的应用于各个研究领域。自从第一次用a f m 获 得d n a 的图像以来，a f m 已成为研究核酸分子结构的重要工具a f m 可以清晰 地观察在体外生理状态下的各种d n a 分子的三维结构，由此可估算出分子的宽 度和高度，尤其在高度上可以精确地测算 1 6 1 。通过对针尖的修饰 1 7 , 1 8 可以研 究生物分子之间相互作用力，进行反应位点识别成像。 由于膜蛋白结构的复杂性和研究条件的限制，以前对膜蛋白结构的认识较 少a f m 的出现对膜蛋白结构的认识提供了更广的空间。a f m 可以直接对膜蛋 白在纳米级分辨率清晰成像。高信噪比的a f m 可以使胰蛋白在接近生理状态下 7 山东大学硕士学位论文 成像，水平面的分辨率达到0 5 啪1n l n ，垂直于水平面的分辨率达到0 1 衄 0 2 n m 【1 9 。 自从2 0 世纪9 0 年代初期b u t t 等人【2 0 】首次将原子力显微镜应用到细胞成像方 面以来，陆续有很多研究者进行了此方面的研究。l i s t e r 等人 2 h 采用自然干燥固 定样品的方法对耐辐射球菌( d e m o e o c e u sr a d i o d u r a n s ) 进行了m a l c 漠式原子力显 微镜成像研究( 如图1 - 5 ) ，得到了高分辨的细菌表面形貌图，观察到了细菌表面 压缩的六边形中间层( h e x a g o n a l l yp a c k e di n t e r m e d i a t e ，h p i ) a m l o 等人【2 2 】用原 子力显微镜对大肠杆菌细胞外膜进行了高分辨成像，并探讨了经生物化学处理 后外膜结构及外膜渗透性的变化。o h s h i r o d 、组【2 3 】则利用原子力显微镜对体外神 经原与肥大细胞的通讯进行了研究。 图1 5 细菌h p i 层的两个高分辨的原子力显微镜图像 另外，随着原子力显微镜在细胞研究中的深入，研究者们逐渐把可分析超微 结构的原予力显微镜和其他分析技术结合起来，对细胞的一些生物学过程进行 了研究。在1 9 9 6 年，有研究者使用原子力显微镜成功地对核孔复合物o 盱c s ) 进行 了成像研究【2 4 】。后来o b e f l e i t l m e r j x 组 2 5 2 7 应用原子力显微镜和荧光显微镜等 技术对n p c s 结构与功能的关系进行了较全面的讨论，他们研究了三磷酸腺苷、钙 离子、p h 等对n p c s 构型的影响，并探讨了n p c s 在调节矿物类皮质激素醛甾酮从 细胞外进入细胞内的过程中的作用。o u i s t 等人【2 8 】则应用原子力显微镜、激光共 聚焦免疫荧光成像等研究了间隙连接半通道的生理作用依赖于胞外c a 2 + 的 等渗体积调控，他们发现非间隙连接半通道可以随着胞外c a 2 + 浓度的变化而调节 细胞体积。i k a i 研究小组【2 9 】将全内反射显微镜和原子力显微镜组装在一起，利 用原子力显微镜针尖将荧光探针注射入单个活细胞中，再通过荧光检测系统高灵 8 山东大学硕士学位论文 敏的对荧光探针进行定位与追踪，通过使用这种联用技术，将原子力显微镜的精 确定位机制与荧光显微镜的高灵敏分析结合起来，使得它将在细胞生物学研究中 发挥更重要的作用。 原子力显微镜具有高空间分辨率、广泛的试验对象、简单易行的制样过程、 多样的试验环境等优点。但是a f m 对工作区域的选择非常盲目，而且工作范围 小，景深小，只能在微米尺度范围内进行扫描，对较大样品表面进行扫描非常困 难。另外a f m 也不能提供对样品的元素分析，这些都在一定程度上限制了原子 力显微镜的应用。 1 2 4 扫描近场光学显微镜( s c a n n i n gn e a r - f i e l do p t i c a lm i c r o s c o p e , s n o m ) 近场光学是随着科学技术向小尺寸和低维空间推进所出现的光学领域中的 一个新型交叉学科。物体表面场的分布可以划分为两个区域：一个是距物体表面 仅仅几个波长的区域称为近场区域；另一部分从近场区域起至无穷远处称为远场 区域。近场光学的研究对象就是近场区域以内的光学现象。当扫描隧道显微镜 ( s t m ) 在1 9 8 1 年出现时，就有人几乎同时提出近场光学显微镜的设想( 1 9 8 3 ) 1 3 0 1 。扫描近场光学显微镜的出现使光学分辨本领由入射光波长的一半拓展到波 长的几十分之一，即纳米尺度。在近场光学显微镜中，传统的光学仪器中的镜头 被细小的光学探针所代替，其尖端的孔径远小于光的波长，当把这样的亚波长光 孔放置在距离物体表面一个波长以内即近场区域时，就可以探测到丰富的亚微米 光学信息。 近场光学显微镜是由探针在样品表面逐点扫描和逐点记录后数字成像的。图 1 - 6 是一种近场光学显微镜的成像原理图，图中x - y - z 粗逼近方式可以用几十纳米 的精度调节探针至样品的间距；而x y 扫描及z 控制可用1l i r a 精度控制探针扫描及 z 方向的反馈随动。图中的入射激光，通过光纤引入探针，并可根据要求改变入射 光的偏振态。当入射激光照射样品时，探测器可分别采集被样品调制的透射信号 和反射信号，并由光电倍增管放大，然后直接由模一数转换后经计算机采集或通过 分光系统进入光谱仅，以得到光谱信息。系统控制、数据采集、图像显示和数据 处理均由计算机完成。由以上成像过程可以看出，近场光学显微镜可同时采集3 类信息，即样品的表面形貌、近场光学信号及光谱信号【3 1 】。 9 山东大学硕士学位论文 x y z 粗逼近 图1 石近场光学显微镜成像原理 s n o m 主要由计算机系统、高分辨图像显示处理系统、电子控制系统和数据 信息探测系统等几大部分组成，其关键技术之一就是针尖一样品( t i p s a m p l e ， t - s ) 间距控制。目前，t - s 间距控制方式主要有三种：1 ) 等高模式，适用于表面 比较平整的样品；2 ) 等光强模式；3 ) 剪切力模式( s h e a rf o r c e ) ，该模式为目前发 展得较为成熟的一种控制模式。 s n o m 的成像原理决定了它的诸多优势：单分子水平观测灵敏度；对样品无 侵入性和破坏性；可在自然状态下研究生物样品的光学性质；能和高时间分辨结 合成为高空间同时高时间分辨等。目前，s n o m 主要在高密度光学信息存储、光 学材料、物理学等方面有较为广泛的研究应用，并且在生命科学的研究中也取得 了相当大的进展。 s n o m 在纳米尺度光学观察上起到趴m 、a f m 所不能取代的作用，例如近 场光刻技术可以使信息存储密度达到1 0 1 0 0g b i n c h 2 的超高密度【3 2 】，有可能成 为下一代的信息存储方式；与近场光谱结合尤其是低温条件下已经观察到量子限 阈条件下半导体量子点、量子线的不同本征发光光谱。在近场条件下还观察到新 的物理现象如激光诱导的近场区域介电探针与样品之间的吸引力相互作用。 在生命科学中的应用更是引人注目，如单个染色体的观察与荧光谱，d n a 的排序以及一些生物体系的原位、动态观察等。1 9 9 2 年，a t & t 贝尔实验室的 b e t z i g 等 3 3 1 利用自制镀膜光纤探针扫描近场光学显微镜得到了4p m x 4p m 区域 1 0 山东大学硕士学位论文 内吸附在3 0n m 厚的聚甲基丙烯酸甲酯膜上的燃料分子探针的d i i c 的分布，并在 1 9 9 3 年，与c h i c h e s t e r 合作首次达到了单分子探测灵敏度。 结合s n o m 技术与基于量子点标记技术的量子荧光探针，在生物大分子探测 及“生物纳米光学”的研究中大有作为，取得了一系列有意义的成果。例如量子 荧光探针结合s n o m 与量子点标记可以从单细胞水平研究其癌变，这将为细胞癌 变的机理研究以及临床诊断提供许多有价值的实验数据，极有可能取得许多创新 性的贡献 3 4 , 3 5 1 k i m d 等 3 6 1 n 生物素化的探针和连接着荧光染料的抗生物素蛋白共杂交来 标记碱基对，得到了分辨率达1 2 0r i m 的s n o m 荧光图像c a o 等 3 7 1 运用a f m 和 s n o m i t 正明了端粒t - 环结构中的t r f 2 蛋白在细胞中起着重要作用，并且可以通 过与细胞中的t _ 环连接点结合直接给p 5 3 蛋白发出信号。 k o o p m a n 等【3 8 】直接观察到了树突状细胞膜上的d c 特异性c 型凝集素在干 燥或液体环境中的s n o m 荧光图像，分辨率达到9 0n m 。在实验中研究者得到了 树突状细胞的共聚焦模式和s n o m 模式两种图像，经对比发现由于分辨率较低共 聚焦模式下观察到的树突状细胞表面似乎布满了蛋白分子，并且只有对抗体进行 荧光标记，才能够观察到细胞表面的个别分子与其相比，由于确定的极化散射 代表确定的偶极散射，因此s n o m 可以清楚地分辨单个分子。此外由于s n o m 的 激发量比较小，因此细胞溶质的荧光背景分布影响比共焦光源小的多。目前在液 体环境中成像的光学分辨率已经达到5 0n m 。 x i e 等 3 9 1 用s n o m 对比研究了正常的用s 一亚硝基谷胱甘肽( o s n o ) 处理的 及用氟美松诱导( d x m ) 处理的鼠胸腺细胞的s n o m 荧光图像和同步得到的形貌 图，发现所得图像荧光分布及荧光强度都有所不同，证明了在诱导鼠胸腺细胞的 过程中，g s n o 的n o 基团和d x m 的目标分子不同，信号传递途经不同，控制细 胞死亡的表达基因不同。 g u n n i n g 等 4 0 l 结合s n o m 与直接计数浅荧光显微镜，研究了i c s a 蛋白片断与 在大肠杆菌上表达的绿色荧光蛋f l ( g f p ) 的融合和细胞定位，这种将近场与远场 相结合的办法可以区分表面融合蛋白与细胞质内的融合蛋白，并利用s n o m 实现 了对细菌表面g f p 融合蛋白的定位。g a r c i a - p a r a j o 等【4 1 】使用近场扫描光学显微镜 检测了细胞中表达的单个绿荧光蛋白( 图1 - 7 ) ，通过获取的图像进行分析，可以 计算出这项技术在细胞检测中的分辨率大约在4 0n m 1 1 山东大学硕士学位论文 12 图1 - 7 近场扫描光学显微镜扫描单个细胞内绿荧光蛋白表达 1 ，近场扫描光学显微镜的结构示意图；2 ，使用近场扫描光学显微镜检测单个绿荧光蛋白 在细胞内成像。 虽然s n o m 的分辨率比起其它的光学显微镜已有革命性的突破，但在近场区 域，收集与探测是完全不同的概念。首先针尖不能将样品成像，它只收集特定位 置的近场光强；其次近场中的非辐射分量不能传播，它们通过光学隧道效应被转 换成辐射，所以探测是对被探测场的微扰。远场探测并不改变入射场，近场探测 则破坏了被分析的场，因此近场图像是样品与针尖信息的混合物，即针尖成像样 品，样品成像针尖。如果针尖大于被分析物体的细微结构，所得到的图像则更多 地与针尖的线型特征有关而不是与样品的拓扑结构相关。虽然在理论上近场显微 镜的分辨率是无限大的，但由于技术上探针尖不能做得无限小，探针亦不能无 限接近样品，所以在实际应用中分辨率还是有限的。 1 2 5 扫描电化学显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p e , s e c m ) 扫描电化学显微镜是8 0 年代末由著名的电分析化学家b a r d 为首的研究小组 在超微电极( u m e ) 和扫描隧道显微镜的基础上发展而来的一种新型电化学检 测新技术。它是扫描探针显微镜( s p m ) 家族的重要成员，弥补了s t m 和a f m 不能直接提供电化学活性信息的不足，其分辨率介于普通光学显微镜与s t m 之 间。它是把一支能够做三维移动的超微电极作为探头插入电解质溶液中，在离固 1 2 山东大学硕士学位论文 相基底表面很近的位置扫描，来进行研究 常规的s e c m 实验装置如图1 8 ，主要由电化学部分( 电解池、探头、基 底、参比电极、辅助电极和双恒电位仪) ，用来精确控制探头位置的压电驱动 器以及用来控制操作、获取和分析数据的计算机( 包括接口) 三部分组成。 用作探头的有l i m e 和微、纳米管等，把探头固定在由三维马达控制的爬行器 上，使探头在基底上方沿x 、y 、z 轴各方向精确移动。基底固定在电解池的 底部，可以是各种材料的电极，也可以是固定有生物物质或细胞的绝缘基底 爬行器及固定电解池的载物台放置于一个稳固的平台上，以减小震动所引起 的噪音和误差。通过双恒电位仪可控制探头和基底的电位计算机通过位置 控制器来控制x y z 三维爬行器在基底上方移动与此同时，由电化学分析仪 测定探头上的信号变化而得到基底的三维图像【4 2 】。 s e c m 的分辨率主要取决于探针的尺寸、形状及探针基底间距( d ) 。其探 针主要为被绝缘层包围的超微圆盘电极，常为贵金属或碳纤维，半径在微米或亚 微米级。1 9 9 5 年，b a r d 等1 4 3 1 人又研制出一种玻璃微管探针，利用电子在两种 互不相容的电解质溶液界面的迁移进行检测。近年来，又研究出纳米级探针和亚 纳升级体积的s e c m 微电解池1 4 2 ，4 4 ，并且对于超微电极的研究也从平板电极 和半球体电极发展到了超微圆环电极及环盘电极【4 5 棚1 目前s