（食品科学专业论文）壳聚糖对淡水鱼糜凝胶特性的影响.pdf

摘要 摘要 壳聚糖对淡水鱼糜凝胶特性的影响 学科、专业：食品科学 硕士研究生姓名：张茜 指导教师：夏文水教授 壳聚糖安全、无毒、易降解，作为一种食品添加剂，在欧美、日韩已被批准应用。 我国也已批准壳聚糖作为食品添加剂在肉类灌肠制品、大米等食品中使用 ( g b 2 7 6 0 2 0 0 7 ) ，但目前在食品中的应用很少，范围不够广泛。本课题研究壳聚糖对 淡水鱼糜凝胶特性的影响，对于开发大宗淡水鱼，促进壳聚糖在食品中的开发应用具有 指导意义。 研究了壳聚糖溶液的流变学性质，测定壳聚糖黏均分子量、剪切速率、浓度、温度、 p h 、盐离子浓度对黏度的影响。结果表明，壳聚糖溶液( 0 6 ( w v ) ) 的黏度随剪切 速率的增加而降低，属假塑性剪切变稀溶液，流动指数n 为0 7 9 9 1 ，稠度指数k 为0 1 3 3 8 ； 壳聚糖溶液的黏度随黏均分子量的下降、浓度的降低、温度的升高、外加盐量的增加而 降低，当壳聚糖溶液的浓度大于o 4 ( w v ) 时，浓度对黏度的影响变得十分强烈；溶 液黏度随p n 值升高的变化趋势为先升高后下降，在p h 4 2 时黏度最大。 以淡水鱼糜为原料，测定添加壳聚糖后鱼糜制品的凝胶强度、全质构( t p a ) 、失 水率和色泽，研究不同脱乙酰度、分子量和添加量的壳聚糖对鱼糜制品质构和品质的影 响。结果表明，脱乙酰度为6 4 时，凝胶强度提高了约3 4 ，失水率减少了2 9 1 ；壳 聚糖分子量对鱼糜制品的凝胶强度影响小；随着壳聚糖添加量的增加，鱼糜制品凝胶强 度、t p a 都有明显的增加，失水率显著降低( p 0 0 5 ) ，添加量大于1 o 后，增加幅度 减小；添加1 低脱乙酰度壳聚糖的鱼糜制品紧密，弹性高；与添加常用的配料淀粉相 比，1 0 的壳聚糖即能达到添加4 0 淀粉的效果；在草鱼鱼糜中添加1 ，d d 为6 4 的壳聚糖同样能改善产品的质构。 探讨了壳聚糖与c a c l 2 复配添加和采取不同的漂洗次数对鱼糜凝胶强度的影响，并 用扫描电镜观察鱼糜的微观结构，进行壳聚糖对盐溶性蛋白的吸附实验和s d s 一聚丙烯 酰胺凝胶电泳实验，研究壳聚糖与鱼糜蛋白质之间的相互作用。结果表明，添加c a c l 2 与壳聚糖无法起到协同效果；漂洗一次的鱼糜添加1 o 的壳聚糖凝胶强度与漂洗三次 的凝胶强度相当，达到4 7 0 7 9 l 姗，可以减少营养损失，提高得率；添加1 0 壳聚糖的 淡水鱼糜凝胶形成了明显的网状结构，表明壳聚糖与蛋白质之间存在相互作用；3 0 温 度下，壳聚糖在前1 0 r a i n 内对盐溶性蛋白的吸附较快，吸光度o d 值从0 1 2 5 迅速降低 到0 0 7 5 ，当吸附时间达到1 0 m i n 后达到平衡；壳聚糖和蛋白质之间以弱键结合。 以上研究表明，壳聚糖改善了淡水鱼糜制品的质构和品质，扩大壳聚糖在食品中的 应用具有非常广阔的前景。 关键词：壳聚糖，淡水鱼糜，凝胶，流变学，质构，品质，蛋白质 i a b s t r a c t a b s t r a c t c h i t o s a ni sas a f e ，n o n - t o x i ca n de a s i l yd e g r a d a b l ef o o da d d i t i v e ，w h i c hh a sb e e nw i d e l y u s e di no c c i d e n t ，j a p a n ，s o u t hk o r e aa n do t h e ri n t e r n a t i o n a lm a r k e t sa sf o o da d d i t i v e ， n u t r i t i o n a ls u p p l e m e n t s c h i t o s a nh a sa l s ob e e na p p r o v e di nc h i n af o rf o o da d d i t i v e ，b u ti t s a p p l i c a t i o ni nf o o di ss t i l li nt h ei n i t i a ls t a g e e f f e c t so fc h i t o s a no nt h eg e l l i n gp r o p e r t i e so f f l e s hw a t e rf i s hs u r i m iw a ss t u d i e di nt h i ss t u d y 1 1 1 ea b o v er e s e a r c hc o u l dp r o v i d et h e o r e t i c a l g u i d a n c ef o r t h ea p p l i c a t i o no fc h i t o s a ni nf o o d r h e o l o g i c a lp r o p e r t i e so fc h i t o s a ns o l u t i o nw a ss t u d i e da n dt h ee f f e c t so fv i s c o s i t y a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t ，s h e a rr a t e ，c h i t o s a nc o n c e n t r a t i o n , t e m p e r a t u r e ，p ha n ds a l ti o n c o n c e n t r a t i o no nc h i t o s a ns o l u t i o nw e r em e a s u r e d c h i t o s a ns o l u t i o nw a sp s e u d o p l a s t i cf l u i d a n di t sv i s c o s i t yd e c r e s e dw i t hi n c r e a s i n gs h e a rr a t e s a l ti o nc o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r e m l e nt h ec h i t o s a ns o l u t i o nc o n c e n t r a t i o nw a sh i g h e rt h a n0 4 ( w v ) t h ee f f e c to fc h i t o s a n c o n c e n t r a t i o no nv i s c o s i t yb e c o m ev e r ys i g n i f i c a n t c h i t o s a ns o l u t o ns h o w e dt h em a x i m u m v i s c o s i t yw h e nt h ep hv a l u eo fc h i t o s a ns o l u t i o nw a s4 2 c h i t o s a nw a sa p p l i e dt of r e s hw a t e rf i s hs u r i m i ，t h ee f f e c t so fc h i t o s a nw i t hd i f f e r e n t d e g r e e so fd e a c e t y l a t i o n ( d d ) ，m o l e c u l a rw e i g h t s ( m w ) a n da d d i n ga m o u n to nt h et e x t u r ea n d q u a l i t i e so fs u r i m i b a s e dp r o d u c t sw e r ei n v e s t i g a t e da n dg e ls t r e n g t h ，t p a ，w a t e rl o s sr a t e a n dc o l o rw e r em e a s u r e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta d d i t i o no fc h i t o s a nw i t h6 4 d dr e s u l t e d i ns i g n i f i c a n ti n c r e a s e si nb o t ht e x t u r ep r o p e r t i e sa n dw a t e r - b i n d i n gc a p a c i t y 1 1 1 eg e ls t r e n g t h i n c r e a s e da p p r o x i m a t e l yb y3 4 a n dw a t e rl o s sr a t ed e c r e a s e db y2 9 1 d i f f e r e n tm o l e c u l a r o fc h i t o s a nh a dn om a r k e dd i f f e r e n c eo ns u r i m i - b a s e dp r o d u c t sg e l l i n gp r o p e r t i e s t h eg e l l i n g p r o p e r t i e so fs u r i m i - b a s e dp r o d u c t si n c r e a s e dp r o p o r t i o n a l l yt ot h ea m o u n to fc h i t o s a na d d e d u pt o1 饵 0 0 5 ) s e n s ee v a l u a t i o ni n d i c a t e dt h a ts i l v e rc a r ps u r i m i 、) r i t l l1 o c h i t o s a nh a d h i g h e rs p r i n g i n e s s t h es a l n er e s u l t sc o u l da l s ob ef o u n di ng r a s sc a r ps u r i m i s u r i m ia d d i n g 1 o c h i t o s a nh a ds i m i l a rs e n s o r yl e v e lw i t ht h a ta d d i n g4 o s t a r c h e s e f f e c t so fc h i t o s a nm i x e dw i t hc a c l 2a n dr i n s i n gt i m e so ns u r i m i - b a s e dp r o d u c t sg e l l i n g p r o p e r t i e sa n di n t e r a c t i o nb e t w e e nc h i t o s a na n dp r o t e i nw e r ed i s c u s s e d s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p yw a su s e dt oo b s e r v et h em i c r o s t r u c t u r eo f t h eg e l s a l s o ，s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( s d s p a g e ) w a su s e dt oa n a l y z et h er e l e v a n tm e c h a n i s m s t l l ee x p e r i m e n t o fa d s o r p t i o no fc h i t o s a no ns a l t s o l u b l ep r o t e i nw a sa l s oc o n d u c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t s y n e r g i s t i ce f f e c to fc a c l 2a n dc h i t o s a nc o u l d n o tb ef o u n d 1 1 1 eg e ls t r e n g t ho ft h r e et i m e s r i n s i n gs u r i m i 谢t l l1 0 c h i t o s a ne q u a l e do n et i m er i s i n gs u r i m i i tw a sf e a s i b l et oa d d1 0 c h i t o s a nt os g r i m iw h i c hw a sr i n s e do n et i m e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p yi n d i c a t e dt h a t c h i t o s a nc o u l df a c i l i t a t es u r i m if o r m i n gg e ln e t w o r k i ts h o w e dt h a ta d s o r p t i o no fc h i t o s a no n s a l t - s o l u b l ep r o t e i na t3 0 w a sv e r yr a p i di nt h ef i r s t10m i n u t e s t h ea b s o r b e n c y ( o dv a l u e ) r e d u c e df r o m0 12 5t oo 0 7 5 ，a f t e r10m i n u t e s ，a d s o r p t i o no fc h i t o s a no ns a l t - s o l u b l ep r o t e i n r e a c h e de q u i l i b r i u m ，n l ec o m b i n a t i o nb e t w e e nc h i t o s a na n dp r o t e i nw a sv e r yw e a k t h ea b o v es t u d ys u g g e s t e dt h a tc h i t o s a ni se f f e c t i v ei ni m p r o v i n gs u r i m it e x t u r ea n d q u a l i t i e s i ti sp r o m i s i n gt oa p p l yc h i t o s a nt of o o d k e yw o r d s ：c h i t o s a n , 舶s hw a t e r f i s hs u r i n l i ，g e l ，r h e o l o g y , t e x t u r e ，q u a l i t y ，p r o t e i n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：纽 日期：纠年7 肜。日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：丛蕴导师签名：趸些三 日期：m 年7 月妒e l 引言 1 引言 1 1 立题依据及意义 1 1 1 立题依据 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是由大部分d 氨基葡萄糖和少量的n 乙酰d 一氨基葡萄糖组成， 以b 1 ，4 糖苷键连接起来的二元聚直链多糖。由于葡萄糖胺单体上有游离的氨基，壳聚糖 除具有一般膳食纤维的生理功能外，还由于结构不同，即脱乙酰度和分子量大小的不同， 在体内产生多方面的生理活性，如降胆固醇、降血脂；促进钙离子、铁离子的吸收；增 强免疫、抗肿瘤等【l 】。此外，壳聚糖还具有良好的生物降解性和生物相容性，且无毒副 作用【2 1 ，在食品中还能起到抗氧化【3 1 ，抗菌【4 】，提高持水力【5 1 的作用。因此，比起其他高 分子化合物来，壳聚糖更适合在食品工业使用。美国食品与医药卫生管理局( f d a ) 已 批准其为食品添加剂，近年来，欧、美、日等发达国家越来越倾向于将壳聚糖作为食品 添加剂或营养补充剂使用，如日本在饼干、面条、饮料、酱油、大米等中添加。 我国也已批准壳聚糖作为食品添加剂在肉类灌肠制品、大米等食品中使用 ( g b 2 7 6 0 2 0 0 7 ) ，但目前国内的应用主要集中在保健品【6 】、纺织及农作物生长调节、 污水处理絮凝【1 7 】等方面，在食品中的应用尚处在起步阶段。 国外有研究表明，壳聚糖可以提高海水鱼长嘴硬鳞鱼鱼糜凝胶的强度【引。k 织1 0 l 【a f 9 】 研究发现，在鳕鱼鱼糜中添加1 5 的壳聚糖在2 0 下放置一段时间可使凝胶强度加倍。 我国是世界上水产品产量最大的国家，而且是世界上唯一的养殖量超过捕捞量的国家， 淡水鱼资源极其丰富，产量雄居世界首位，其中尤以鲢鳙为主。由于淡水鱼的栖息水域 温度高于海水鱼，肌原纤维的热稳定性好，因此相对于海水鱼而言更难凝胶化【1 0 。1 2 1 ，所 以鱼糜制品的原料多限于海水鱼类。淡水鱼长期以来以鲜销为主，加工品产量还不到2 0 。淡水鱼加工的薄弱环节已严重制约着我国养殖业的进一步发展【1 3 1 。目前通常采用 在鱼肉中添加淀粉来提高鱼糜制品凝胶特性。从国内外研究的结果来看，淀粉对不同鱼 糜凝胶性能的影响有较大差异【1 4 d 倒。此外，淀粉的冻融稳定性受淀粉种类韵影响很大 1 7 - 1 9 ，而且淀粉的添加量较大，影响产品的口感。添加其他亲水胶体如黄原胶和卡拉胶 也会因种类不同而影响肌肉蛋白凝胶的硬度和弹性【2 0 】。壳聚糖在淡水鱼糜中的应用还鲜 有研究，需要进行深入探讨研究。 本研究课题来源于国家高技术研究发展计划( 8 6 3 ) 重点项目( 编号2 0 0 7 a a l 0 0 4 0 1 ) 和食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目( s k l f m b 2 0 0 8 0 5 1 ) ，并得到了现代 农业产业技术体系建设专项资金资助。 1 1 2 立题意义 壳聚糖作为一种食品添加剂在食品中的应用还不够广泛，本论文将壳聚糖应用在淡 水鱼糜中，对于壳聚糖在食品中的推广应用具有指导意义。 我国淡水鱼资源极其丰富，但相对于海水鱼而言更难凝胶化，国外有学者研究了壳 江南大学硕士学位论文 聚糖对海水鱼糜凝胶强度的影响，但目前对于壳聚糖在淡水鱼糜中的应用都鲜有研究。 本论文将壳聚糖应用在淡水鱼糜中，以期改善鱼糜的凝胶强度，对于开发大宗淡水鱼， 促进水产行业的发展具有积极的现实意义。 壳聚糖安全、无毒、易降解，将壳聚糖应用到淡水鱼糜中，在改善凝胶强度的同时， 还能为消费者带来额外的健康益处，满足消费者对饮食健康、安全、美味的多重需求， 社会效益非常显著。 壳聚糖来源于甲壳素，我国甲壳素资源非常丰富，存在广泛，目前我国对壳聚糖的 开发研究不是很深，对其在食品中的应用也较少，如能拓宽壳聚糖的应用范围，将可以 促进甲壳素的深加工，提高附加价值，增加经济效益。 1 2 国内外壳聚糖在食品中应用的研究进展与存在的问题 1 2 1 壳聚糖在食品中应用的研究进展 许多学者将壳聚糖应用在果蔬汁饮料中，果蔬、肉制品和保健品中，起澄清脱酸， 防腐保鲜和保健的效果，还有一些学者研究了壳聚糖对食品的质构和品质的影响。 有科研工作者对壳聚糖澄清果汁的效果做了研究【2 l 仍】，结果显示，利用壳聚糖澄清 苹果汁、山梨汁和猕猴桃汁，澄清后果汁透光率达到9 0 9 5 以上。唐峰等【2 4 j 将壳聚 糖用于罗汉果汁的脱酸，采用静态法，每1 4g 壳聚糖可使1 0 0 m l 可溶性固形物含量为 1 4 的罗汉果汁由p h4 1 升至p h6 0 以上，获得接近中性的果汁，有效去除了果汁中 令人不愉快的酸味，同时不影响罗汉果汁的甜味与香味均衡，口感明显改善。 孟令丽等【2 5 l 采用壳聚糖及几种比较常见的防腐剂配制成复合保鲜剂，发现单一的壳 聚糖保鲜剂的保鲜效果相对较差，壳聚糖与氢氧化钙的复合保鲜剂保鲜效果最为明显。 陈晓冈l j t 2 6 1 采用羧甲基壳聚糖溶液和蔗糖溶液配制成保鲜液保鲜非洲菊切花，研究表明， 1 0 o 羧甲基壳聚糖溶液与2 0 蔗糖溶液复配的保鲜液处理后的鲜切花平均瓶插寿命比 对照延长3 d 。兰凤英等【2 7 】主要研究了壳聚糖对中式香肠的感官品质和抗脂肪氧化性能 的影响，试验结果表明，在中式香肠中添加o 4 的壳聚糖即可明显的抑制贮存过程中 脂肪的氧化( p o 4 5 ，可以满足操作要求。c j o 等【3 2 】通过比较猪肉肠质量特性 在添加壳寡糖前后的变化后，得出，添加壳寡糖的猪肉肠，其色泽、风味、质构和整体 的可接受程度与空白对照接近，在猪肉肠中添加o 2 的壳寡糖是可行的。t e t s u y a 等人 3 3 】用壳聚糖和c a c 0 3 作为面条的增稠剂，其用量为0 4 1 8 。t o m o h i h o 等人【3 4 】用 壳聚糖粉末加入用鸡蛋清制得的食品凝胶中提高其硬度和弹性。在面剧3 5 】中加入2 7 的1 0 0 目壳聚糖，它能与蛋白质形成稳定的乳化液，再经发酵、整型、焙烤，此种面包 体积增加、内部蜂窝状结构均匀，柔软可口、保湿性能良好。在蛋糕中加入4 7 的1 0 0 目壳聚糖，也能对产品起到较好的乳化和稳定作用。目前在日本市场上已有添加壳聚糖 的烤甜饼出售【3 6 】。在国内一些综述性文献【3 7 】报道中称壳聚糖还可作增稠剂可应用于蛋 黄酱，果酱、花生酱、奶油替代品等食品中，但无法查找到相关的应用研究数据。 1 2 2 鱼糜凝胶强度及壳聚糖在鱼糜中应用的研究进展 鱼糜制品在我国有悠久的历史，与其他制品相比，具有原料丰富，不同鱼种可以相 互搭配的特点，同时在鱼糜生产中对不可食部分集中回收，有利于综合利用和环境卫生， 是一类营养丰富、口味多样、食用方便的低胆固醇食品1 3 8 】。我国近几年的鱼糜及其制品 加工发展很快，由于淡水鱼的栖息水域温度高于海水鱼，肌原纤维的热稳定性好，因此 相对于海水鱼而言更难凝胶化，所以鱼糜制品的原料多限于海水鱼类。但近年来，由于 海洋捕捞强度的加大，主要经济鱼类严重枯萎，生产鱼糜及其制品的优质水产品的数量 不断下降，因此各国都在寻找鱼糜加工的新原料。我国是世界上水产品产量最大的国家， 而且是世界上唯一的养殖量超过捕捞量的国家，淡水鱼资源极其丰富，产量雄居世界首 位，其中尤以鲢鳙为主。但我国的淡水鱼长期以来以鲜销为主，加工品产量还不到2 0 ， 淡水鱼加工的薄弱环节已严重制约着我国养殖业的进一步发展。因此，对淡水鱼进行深 加工，提高淡水鱼糜的凝胶强度，已迫在眉睫。 鱼肉蛋白弹性凝胶体凝胶强度的高低，是决定鱼肉制品质量优劣的关键因素，直接 影响着鱼糜制品的组织特性、保水性、黏结性及产品得率等。虽然不同鱼种的凝胶强度 有高低之分，但可以采用一些提高凝胶强度的措施来提高鱼糜制品的弹性。漂洗是鱼糜 制品加工过程中常用的方法，通过漂洗可除去影响鱼肉的诸多因子，如血污、色素、水 溶性蛋白质( 含酶) 、部分无机盐和脂肪等，从而去腥、增白、提高肌原纤维蛋白的质 量分数，增强凝胶强度与鱼糜制品的稳定性。此外，还可以通过在鱼肉蛋白凝胶化之前 添加凝胶强度增强剂的方法提高凝胶强度【3 9 1 。 有学者通过添加抗坏血酸、半胱氨酸等还原剂及乳酸钙、葡萄糖酸钙等钙盐来改善 某些鱼糜的凝胶特性 4 0 训】，而目前通常采用在鱼肉中添加淀粉来提高鱼糜制品凝胶特 性。淀粉作用的机理是：在加热糊化时，游离水分被添加的淀粉吸收成为钝化水，由于 膨润的糊化粒子机械强度大于鱼肉，起到鱼肉弹性增强作用，提高了凝胶强度。周蕊等 3 江南大学硕士学位论文 【1 4 】通过探讨四种不同种类的淀粉对罗非鱼糜制品凝胶性能、弹性、持水力、色泽以及感 官的影响，发现：在添加量5 时，四种淀粉均可改善罗非鱼鱼糜凝胶性能。刘鑫【l5 】等 研究了不同淀粉对鱿鱼鱼糜制品的影响，发现添加玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、 小麦淀粉和马铃薯变性淀粉能有效提高鱿鱼鱼糜的凝胶强度、持水性，但对色泽有一定 降低。c r i s t i n aa l v a r e z 1 6 】研究了糯玉米淀粉对沙丁鱼鱼糜制品的影响，发现添加糯玉米 淀粉会降低沙丁鱼鱼糜制品的凝胶强度。从国内外研究的结果发现，淀粉对不同鱼糜凝 胶性能的影响有较大差异。此外，淀粉的冻融稳定性受淀粉种类的影响很大【1 7 1 9 1 ，而且 淀粉的添加量较大，影响其口感。添加其他亲水胶体如黄原胶和卡拉胶也会因种类不同 而影响肌肉蛋白凝胶的硬度和弹性【2 0 】。 k a t a o k a 9 】研究发现，在鳕鱼鱼糜中添加1 5 的壳聚糖在2 0 下放置一段时间可使 凝胶强度加倍。s o o t t a w a tb e n j a k u l 8 】等通过研究脱乙酰度分别为7 8 ( 6 5 6 4 - 1 3 l ) 、 8 b ( 8 3 4 4 - 0 1 6 ) 、9 b ( 8 8 0 4 - 0 1 6 ) 和1 0 b ( 9 9 6 4 - 0 0 7 ) 的壳聚糖对海水鱼长嘴硬鳞鱼鱼糜 凝胶破断强度、凹陷深度和凝胶强度的影响，表明添加1 0 m g g7 b 壳聚糖的样品，热凝 胶的凝胶强度最高。国外对于壳聚糖在鱼糜中的应用主要局限于海水鱼，对于淡水鱼还 鲜有研究，国内对于壳聚糖在鱼糜中的应用还是空白，应用主要集中在壳聚糖对鱼体成 分和免疫功能的影响方面。陆清儿等【4 2 】研究了壳聚糖及其复合物对钱塘江三角鲂生长及 鱼体成分的影响，试验为期6 0 d ，发现添加壳聚糖、壳聚糖复合物a 和壳聚糖复合物b 均有较好的促长效果；与对照组相比，三角鲂平均体增重分别提高1 5 9 1 ( p o 0 1 ) 、 1 9 1 9 ( p o 0 1 ) 和2 1 6 5 ( p o 0 1 ) 。华雪铭等【4 3 】以初始体质量为( 1 0 4 4 - 0 0 1 ) g 的草鱼为对象，研究壳聚糖对草鱼免疫功能的内分泌调控。研究发现，壳聚糖可以通过 内分泌途径甲状腺激素水平的变化实现对草鱼非特异性免疫功能的调控，壳聚糖在草鱼 饲料中的适宜添加量为0 5 0 。 1 2 3 存在的问题 就目前国内外壳聚糖在食品中的应用来看，其主要是用于絮凝澄清、防腐保鲜和保 健，应用范围还不够广泛。国外有学者将壳聚糖应用在海水鱼糜中改善凝胶特性，在淡 水鱼糜中的应用还不够，国内更是鲜有研究。淀粉、卡拉加胶、黄原胶等常添加进鱼糜 中改善质构的添加剂受其种类的影响很大，壳聚糖对淡水鱼糜凝胶特性的影响需要进行 深入研究。 1 3 研究目的与主要研究内容 1 3 1 研究目的 本文的研究目的在于通过研究壳聚糖对淡水鱼糜凝胶特性的影响，为壳聚糖在淡水 鱼糜中的应用提供理论指导，扩大壳聚糖的应用范围。 1 3 2 主要研究内容 ( 1 ) 对壳聚糖溶液进行流变学性质研究，分析壳聚糖黏均分子量、剪切速率、浓 度、温度、p h 值和盐浓度对壳聚糖溶液黏度的影响。 4 引言 ( 2 ) 研究壳聚糖在淡水鱼糜中的应用。以淡水鱼糜为原料，测定添加壳聚糖后鱼 糜制品的凝胶强度、全质构( t p a ) 、失水率和色泽的变化，研究不同脱乙酰度、分子 量和添加量的壳聚糖对鱼糜制品质构和品质的影响。 ( 3 ) 探讨在淡水鱼糜中将壳聚糖与c a c l 2 复配添加和采取不同的漂洗次数对鱼糜 凝胶强度的影响，并用扫描电镜观察鱼糜的微观结构，进行壳聚糖对盐溶性蛋白的吸附 实验和s d s p a g e 实验，研究壳聚糖与鱼糜蛋白质之间的相互作用。 5 江南大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 原料与试剂 白鲢鱼( 约1 5 k e d 条) ，草鱼( 约1 3 5 k g 条) ，购自无锡市雪浪镇菜市场；精制马铃薯 淀粉，黑龙江北大荒马铃薯产业有限公司； 壳聚糖，实验室自制，脱乙酰度分别为6 4 、7 2 和8 3 ，分别记为低脱乙酰度壳 聚糖( l d d ) 、中脱乙酰度壳聚糖( m d d ) 和高脱乙酰度壳聚糖( h d d ) ；黏均分子量 分别为1 8 1 x 1 0 5 、4 5 0 1 0 5 和1 2 0 2 x 1 0 5 ，分别记为低分子量壳聚糖( l c ) 、中分子量壳 聚糖( m c ) 和高分子量壳聚糖( h c ) ，以上壳聚糖的灰分含量平均约为1 5 9 1 0 0 9 ，水 分含量平均约为1 2 ； 醋酸、尿素、三( 羟甲基) 氨基甲烷，分析纯，医药集团化学试剂有限公司。 2 2 方法 2 2 1 壳聚糖脱乙酰度的测定 按酸碱滴定法测定壳聚糖的脱乙酰度1 4 4 。具体测定步骤是：准确称取o 3 0 5 9 壳聚 糖样品，置于2 5 0 m l 三角瓶中，加入0 i m o l l 标准盐酸溶液3 0 m l ，在2 0 2 5 c 搅拌至 完全溶解( 可加入适量蒸馏水稀释) ，加入2 3 滴甲基橙一苯胺蓝( 1 ：2 ，v v ) 指示剂， 用o 1 m o l l 标准n a o h 溶液滴定游离的盐酸。另取一份样品，置于1 0 5 c 烘干至恒重， 测定水分。按下列公式计算氨基含量，壳聚糖的脱乙酰度就是壳聚糖样品中的氨基 ( - n h 2 ) 含量占理论氨基含量的百分数。 ( - 埘：膨= 盟群1 0 蝴 ( 1 ) 式中：( - n h 2 ) 氨基含量；c l 一盐酸标准溶液的浓度( m o l l ) ； c 商氧化钠标准溶液的浓度( m o l l ) , v l 一加入的盐酸标准溶液的体积( m l ) ； v 广滴定所耗用的氢氧化钠标准溶液的体积( n l l ) ：w 一样品的水分含量( ) ； g - 样品重( g ) ；o 0 1 仁与l m l 浓度为l m o l l 的盐酸溶液相当的氨基量( g ) 。 d d ：( - n h 2 ) l o o ( 2 ) 9 9 4 d d 一脱乙酰度；9 9 4 一理论氨基含量。 2 2 2 壳聚糖特性黏度和黏均分子量的测定 将壳聚糖样品置于1 0 5 干燥至恒重。精确称取一定量的壳聚糖，用0 1 m o l l 乙酸 钠0 2 m o l l 乙酸溶剂配成5 0 m l 样品溶液，用移液管移取1 5 m l 壳聚糖溶液移入鸟氏黏 度计侧管粗管，将黏度计垂直固定于3 0 c 恒温水浴中保温1 0 m i n 以上，使管内溶液的 温度与水浴温度达到平衡。用比浓黏度对浓度作图得一条直线，将此直线外推至与纵坐 标相交得a 点，此截距( a o ) 即为特性黏度切】。将防】、k 和口代入下式即可求出黏均相 对分子质量【4 5 1 ： 材料与方法 切】_ k m 。 ( 3 ) 式中：k = 1 6 4 x 1 0 - 3 0 d d l 4 ；口= 一1 0 2 1 0 - 2 d d + 1 8 2 ；m 一黏均分子量； i 刁i 特性黏度。 2 2 3 壳聚糖溶液黏度的测定 采用a r l 0 0 0 型流变仪测定壳聚糖溶液的黏度。选用直径为6 0 m m ，2 0 不锈钢锥板 系统。测定条件：温度2 5 1 2 ，剪切速率变化范围0 1 1 0 01 s 。 不同浓度的壳聚糖溶液由壳聚糖溶解在0 2 m o l l 醋酸醋酸钠缓冲溶液中得到。 不同p h 条件下壳聚糖溶液的配制由壳聚糖溶解在离子强度相同，p h 不同的醋酸 醋酸钠缓冲溶液中制得。 采用乌氏黏度计测定壳聚糖溶液的特性黏度【4 3 】。 2 2 4 鱼糜制品的制备 将去除头、尾、内脏和鱼鳞的鲢鱼冲洗干净后进行手工采肉，漂洗时控制鱼肉与水 的比例为l ：8 ，水温为8 1 0 * c ，先慢速搅拌6 8 m i n ，再静置1 0 m i n ，倾去漂洗液，如此重 复漂洗2 次，最后一次在漂洗液中加入o 3 的食盐【铜，然后用滤布进行预脱水，再置 于离心机中，3 0 0 0 r m i n ，离一l , 1 0 m i n ，离心后倒出水分，将鱼肉置于切陷机中斩成糜状， 按比例在鱼糜中添加一定量的壳聚糖或淀粉，并以不添加壳聚糖的鱼糜制品做空白对 照，所有样品用少量碱液调节p h 至7 左右【4 7 4 引。搅拌使之充分混匀后灌入肠衣，放进9 0 水中加热2 0m i n ，立即置于冰水中冷却，于4 冷藏过夜，待测。 2 2 5 壳聚糖的添加 将壳聚糖预先溶解在1 ( v v ) 的乙酸溶液中，在鱼糜中乙酸溶液的添加量为鱼糜 制品总重量的1 0 ( v m ) ，为保证产品水分含量一致，在空白对照及加淀粉的样品中 均加等量乙酸溶液补足做对照实验。 2 2 6 凝胶强度的测定 将鱼肠切成长2 5 m m ，直径2 5 m m 的圆柱体，用质构仪来测定样品的破断强度和凹 陷深度，两者乘积即为样品的凝胶强度。质构仪测试的参数：p 0 2 5 s 探头，测试前速度 1 0 m m s ，测试中速度1 0 m m s ，测试后速度1 0 m m s ，压缩比8 0 。 2 2 7t p a 分析 将鱼肠切成长2 5 m m ，直径2 5 m m 的圆柱体，用t a x t 2 i 质构仪测定样品的硬度、 弹性、黏结性、胶黏性、咀嚼性、回复性等指标。质构仪测试的参数：p 5 0 探头，模式 t p a ，测试前速度1 0 m m s ，测试中速度1 0 m m s ，测试后速度1 0 m m s ，压缩比2 5 。 2 2 8 失水率的测定 称取3 + 0 2 9 样品( m l ，g ) ，用一层滤纸包裹，置于5 0 m l 离心管中，衡重。于离心 机中离心1 5 m i n ，3 0 0 0 r r a i n 。离心后取出样品称其质量( m 2 ，g ) ，按下式计算失水率1 4 9 ： 7 江南大学硕士学位论文 失水率( ) = 如- 一研，l o o ( 4 ) 2 2 9 色泽的测定 将鱼肠切成长2 5 n u n ，直径2 5 m m 的圆柱体，用色彩色差仪测定样品的l ，a ，b 值( 重 复5 次，取平均值) ，测定在室温下进行，最重要的色泽参数是白度( w ) ，白度可用 下式进行计算【4 9 】： w = l 一3 b( 5 ) 式中：l 值表示颜色的明度，a 值表示颜色的绿红值，b 值表示颜色的蓝黄值。 2 2 1 0 折叠试验 将鱼肠样品切成5 m m 的薄片，进行折叠弯曲，按表2 1 进行等级评价【5 0 l ： 表2 - 1 折叠试验等级评价 t a b l e 2 - 1f o l d i n gt e s tg r a d ee v a l u a t i o n 等级 性状 a a a b c d 4 层折叠不产生龟裂 2 层折叠不产生龟裂 层折叠产生一半龟裂 2 层折叠全部龟裂 糊状，不能折叠 2 2 1 l 感官评定 将鱼肠在4 冷藏1 2 h 后，室温放置1 h ，每样切成长2 5 n u n ，直径2 5 n u n 的圆柱体，置 于玻璃盘中。由l o 位有过感官评定经验的食品专业人士( 男女各5 名) ，采用观、闻、 后吃的方式，根据表2 2 感官评分标准的指标描述给出评分，通过模糊综合评价方法对 样品质量进行评定。 鱼肠样品的质量指标集为： u = 外观，色泽，组织状态，风味，口感 ，相应的权重向量为： a = ( 0 2 5 ，0 1 5 ，0 2 0 ，0 0 5 ，0 3 5 ) ，评语集为v = 优，良，中，差 表2 - 2 感官评分标准 t a b l e 2 2s e n s o r ys c o r ec r i t e r i a 8 材料与方法 2 2 1 2 壳聚糖与c a c l 2 复配 取2 0m m o l k g 、4 0m m o l k g 、6 0m m o l k g 、8 0m m o l k g 和10 0m m o l k g 的c a c l 2 分别 与l 低脱乙酰度壳聚糖进行复配，按2 2 5 、2 2 6 、2 2 7 的方法研究壳聚糖与c a c l 2 复 配后对鱼糜制品t p a 、失水率和色泽的影响。 2 2 1 3 鱼糜漂洗 漂洗时控制鱼肉与水的比例为1 ：8 ，水温在1 0 以下，以防止蛋白质变性，搅拌漂 洗每次5 m i n ，然后静置并倾去上层血水混杂物，用干净纱布过滤。第一次用清水漂洗， 第二次也用清水漂洗，第三次在漂洗液中添加0 3 的食盐【5 1 1 。 2 2 1 4 水溶性蛋白质的提取和测定 取2 9 不同漂洗次数的鱼糜样品用低盐磷酸缓冲液( o 0 5 m o l lk c l 0 0 1 m o l l n 棚2 p 0 4 0 0 3 m o l ln a 2 h p 0 4 ) 于4 c 浸提4 h ，4 0 0 0 r m i n ，离一1 二, 2 0 m i n ，然后取上清液用凯 氏定氮法测定蛋白质含量【5 2 】。 2 2 1 5 盐溶性蛋白质的提取和测定 取2 9 不同漂洗次数的鱼糜样品用高盐磷酸缓冲液( o 5 m o l lk c i 0 0 1 m o l l n a h 2 p 0 4 0 0 3 m o l ln a 2 h p 0 4 ) 于4 c 浸提2 0 h ，4 0 0 0 r m i n ，离, l , 2 0 m i n ，然后取上清液用 凯氏定氮法测定蛋白质含量【5 2 】。 2 2 1 6 壳聚糖对盐溶性蛋白质吸附能力测定 取适量提取的盐溶性蛋白质，稀释l o 倍，在试样中加入1 ( w v ) 的壳聚糖乙酸溶 液( 壳聚糖事先溶在浓度为l ( v v ) 的乙酸溶液中，壳聚糖的浓度也为1 ( m v ) ) 。 混匀后，调节p h 至中性，各力1 1 1 0 m l 至试管中，将试管依次放在3 0 c 水浴锅中，每隔一 段时间取出，置于离心机中，8 0 0 0 r m i n ，离, t 1 , 1 0 m i n ，取上清液，2 8 0 n m 处测定吸光度 值o d ，o d 为纵坐标，绘制吸附曲线【5 3 - 5 4 1 。 2 2 1 7s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( 简称s d s p a g e ) 称取2 9 鱼肠，加入1 5 m l2 0 m m o l l 的t r i s h c l 缓冲溶液( p h 8 0 ，含有2 s d s ，8 m o l l 尿素和2 1 3 巯基乙醇) ，均质后在1 0 0 c 沸水浴2 m i n ，然后在室温磁力搅拌2 4 h ，使蛋白 质充分溶解出来，1 2 0 0 0 r m i n 离, 凸, 2 0 m i n 后取一定量的上清液进行电泳【5 5 铘】。根据 l a e m m l i 法【57 1 ，用d y y - i i i - 4 稳压稳流电泳仪进行电泳。将样品提取液与电泳缓冲液按l ： 1 混合后，加样量为1 0 皿，在1 0 的分离胶上进行电泳分离，以考马斯亮蓝r - 2 5 0 染色， 醋酸甲醇溶液进行脱色。分子量标准物包括肌球蛋白重链( 2 0 0 k d ) 、钙调素结合蛋白 ( 1 3 0 k d ) 、兔磷酸化酶b ( 9 7 4 k d ) 、牛血清白蛋白( 6 6 2 l ( d ) 和兔肌动蛋白( 4 3 k d ) 【5 引。 2 2 1 8 鱼糜凝胶微观结构观察 将鱼肠样品切成小块，于4 c 下用3 戊二醛固定，经0 1 m o f l 的磷酸缓冲液漂洗数 次后，用l 四氧化锇固定，再经0 1 m o l l 的磷酸缓冲液漂洗数次，依次用浓度梯度为3 0 、 9 江南大学硕士学位论文 5 0 、7 0 的乙醇脱水。在室温下先后用9 0 和1 0 0 的乙醇脱水，经醋酸异戊酯过渡后， 用c p d 0 3 0 1 临界点干燥仪进行干燥，再用s c d 0 0 5 离子溅射仪镀金后，最后用q u a n t a - 2 0 0 电子显微镜进行扫描观察。 2 2 1 9 壳聚糖的灰分含量 按g b t5 0 0 9 4 2 0 0 3 测定壳聚糖的灰分含量。 2 2 2 0 壳聚糖的水分含量 按g b t5 0 0 9 3 2 0 0 3 测定壳聚糖的水分含量。 2 3 数据分析 每个样品至少测三次，取平均值。应用s p s s ( 1 3 0 ) 软件和e x c e l 软件进行数据分析。 显著性检验方法为d u n c a n 检验，检测限为0 0 5