（食品科学专业论文）牛乳蛋白质酶改性的研究与液态婴儿乳的研制.pdf

刘芳摘要 2 0 0 2 年5 月 摘要 件乳困其来源广泛、营养丰富、且与人乳成分较为接近而被长期用作母乳代用品。 然而函于牛乳与人乳在蛋白质成分上具有较大差异，使得牛乳蛋白质不易被婴儿消化吸 收，部分婴儿对牛乳会产生过敏反应。这种蛋白质的差异主要表现在：酪蛋白与乳清蛋 白含量比例的差异；牛乳中含有大量的qs 酪蛋白，而母乳中几乎没有：牛乳清蛋白中 含有b - 乳球蛋白，而母乳中不含有，本实验通过对牛乳蛋白的水解，调整酪蛋白与乳清 蛋白含量的比例，去除或减少as 酪蛋白和b 乳球蛋白，从而制各出利于婴儿消化的母 乳代用品的乳基原料。 本实验通过对安全、来源丰富的几种酶的比较筛选，最终确定以胰蛋白酶为水解用 酶，对牛乳蛋白质进行改性实验。 采用单因素的实验设计方法，以体外消化率为指标选择胰蛋白酶水解牛乳蛋白的 最佳温度、最佳口h 值。然后以苦味的产生为标准，确定最佳水解时间。( 可以得出：在 温度4 5 、酶浓度0 5 时具有最佳的体外消化率，当水解时间为2 0 分钟时水解液不 产生苦味。 体外消化率的测定方法是采用体外模拟婴儿胃内的消化过程，以体外三小时模拟体 内六小时发生的变化。f 以凝乳酶和胃蛋白酶对牛乳进行连续的体外消化，分别在消化至 1 5 分钟、4 5 分钟和两小时分别增加酶用量，以三氯乙酸作用，可溶性蛋白与总蛋白含量 的比值即为蛋白质的体外消化率。”p 一 对水解液、母乳及牛乳进行体外实验，以模拟婴儿胃内的絮凝状态，调节牛乳温度 4 0 、p h 40 。观察样品的絮凝状态，并进行拍照。，可以观察到，母乳呈微凝状态，而牛 乳的凝块粗大、坚硬，水解液的絮凝状态介于二者之间，接近于母乳。，。 对三种母乳样品进行氨基酸含量的测定。( 其结果与牛乳蛋白水解液的氪基酸含量进 行比较分析可作为调节水解液氨基酸含量接近母乳的依据。广。一 测定了以胰蛋白酶水解牛乳蛋白在最适条件下的水解度及体外消化率。当反应初期 的3 0 分钟二者的增加较快，随着时间的延长，反应速度的增加趋于平缓：y 、一一 采用凝胶柱层析，测定水解液分子量的分布范围。f 对水解液的稳定性进行测定，结 果表明水解液的初始稳定性较好，放置2 4 小时后，水解液稳定性下降。对水解液的感官 质量进行评定，水解液基本无苦味，但稍有杂味。 为解决水解液的稳定性及味觉的变化，将牛乳与水解液进行适当比例的混合，结果 表明，当牛乳：水解液为5 ：5 时，无不良风味感，且稳定性好，可作为易于婴儿消化的 母乳代用品的乳基原料。卜一一 关键词：牛乳蛋白质胰蛋白酶婴儿代乳品水解 硕士学位论文牛乳蛋白质酶改性的研究与液态婴儿乳的研究东北农业大学 s t u d i e so ne n z y m a t i cm o d i f i c a t i o no fc o wm i l k p r o t e i na n di n f a n tm i l k a b s t r a c t c o wm i l kh a sb e e nu s e da si n f a n tf o r m u l af o ri t st m i v e r s a l i t yo fs o o r c e 、 a b u n d a n c eo f n u t r i t i o na n d 山ec o m p a r a b i l i t yb e t w e e nc o wm i l ka n dh u m a nm i l kh o w e v e r , t h e r ea l es i l l l s o m ei m p o r t a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nt h e m ，w h i c hm a k et h ec o wm i l kp r o t e i nn o tb ee a s i l y d i g e s t e da n da b s o r b e d , p a r to f i n f a n t sw i l lb ec a u s e da l l e r g i cp h e n o m e n o nb y c o wm i l kp r o t e i n t h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nh u m a nm i l ka n dc o wm i l km c l u d e ：t h ed i f f e 瑚c eo ft h ep r o t e i n c o n t e n tp r o p o r t i o nb e t w e e nt h et w ok i n do f m i l k ；t h e r eml a r g ea n l o u n to f p r o t e i nc o n t e n to f qs - c a s e i ni nc o wm i l k ，w h i l ea l m o s tn o s - c a s e i nmh u m a nm i l k ；口l a e t o g l o b u l i ne x i s t si n c o wm i l kb u tn o ti nh u m a n m i ( 1 1 l ：r o u g hh y d r o l y z m gt h ec o w m i l kp r o t e i n , t h ep r o p e r u o no f c a s e mt ow h e yp r o t e i nw a sa d j u s t e da n d , a tt h es a m et i m e ，口s - c a s e i na n d1 3 - l a c t o g l o b u l i n w e r em o d i f i e dn l i sp r o d u c tc a l lb eu s e da sm i l kr a wm a t e r i a lf o ri n f a n tf o r m u l aa n db e f a v o r a b l et oi n f a n td i g e s t a f t e rc o m p a r i n ga n dc h o o s i n gf i v ek i n d so fs a f ea n da b u n d a n te n z y m e s ，t h ee x p e r i m e n t d e t e r m i n e dp a n c r e a f i na sh y d r o l y z i n ge n z y m ec om o d i f ym i l kp r o t e i n u s i n gs i n g l ef a c t e re x p e m e n ta n dt a k i n gt h ev i t r od i g e s tr a t i oa st h ei n d e x t h ee x p e r i m e n t d e t e r m i n e dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp ht h e nt a k e nt h eb i t t e r n e s se x t e n ta ss t a n d a r d t h e o p t i m u mh y d r o l y z i n gt i m ew a sd e t e r a u n e d t h er e s u l ti s ：u n d e rt h ec o n d i t i o no ft e m p e r a t u r e 4 5 c n g y n l ec o n c e n t r a t i o n05 t h eo p t i m u mv i t r od i g e s t r a t i o nw a s a c q u i r e d w h e n h y d r o l y z i n gt i m ew a s2 0m i n u t e s ，t h eh y d r o l y s a t ew a s n o tb i t t e r t h e w a y t od e t e r n l l n ed i g e s tr a t i oi ni n f a n tr i v ei st os i m u l a t ei n f a n ts t o m a c hd i g e s tp r o c s mv i t r ot l l r e eh e a r si nv i u - oc o u l db eu s e dt os t i m l l l a t e6h o u r si nv i v oc o n t i n u o u s l ya p p e n d r e n n e ta n dp e p s i na f t e rh y d r o i y z m g1 5m i n u t e s 4 5m i n u t e sa n d2h o u r st c aw u su s e dt o d e p o s i tp r o t e hm r a t i oo fs o n a b l ep r o t e i nt ot h et o t a lp r o t e i nw a st h ev i t r od i g e s tr a t i o ， u s i n g v i t r o e x p e r i m e n t t os m m t a t et h es t a t eo fc u r di i li n f a mg t o m s x ：h a d j u s t e d t e m p e r a t u r e4 0 ，p h 40 ，o b s e r v c d a n d p h o n e d t h e f l o c c u l a d o nt h e s t a t eo f h u m a n m i l k w a s m i l d b a tt h ec u r do fc o wm i l kw a sb u l k ya n ds 皿t h es t a t eo fh y d r o l y s a t ew a se v a l u a t e d ，i t w i g sm o r el i k eh u m a nm i l k a z n i l l oa c i df a a lc o n t e n tw a sd e t e r m i n e db yt h r e ek i n d so fh u m a nm i l kc o m p a r a t i v e r e s e a r c hh a db e o nd o n eb e t w e e nh u m a nm i l ka n dh y d r o l y s a t en ”d i f f e r e n c e sc a nb eu s e dt o d e t e r m ：a t eh o wt oa d j u s ta ac o n t e n ti nh y d r o l v s a t em o r el i k eh u m a nm i i k 刘芳 英文摘要2 0 0 2 年5 月 n l ed ha n dv i t r od i g e s tr a t i ow e r ed e t e r m i n e du n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o ni nt h ef i r s t3 0 m i n u t e s ，b o t h i n c r e a s ea ta h i g hs p e b d ，w i t h t h ep r o c e e d i n go f h y d r o l y z i n g ，t h e i n c r e a s eo f t h e r e a c t i o ns d e e dw a si m p e r c 宅p f i b l e 1 ks e m q o ri n d e xw a sa s s e s s c d m o l o c u l em a s so fh y d r o l y s a t ew a sm e a s m e da n ds t a b i h t y w a s m e n s u r o d t o oa l lo f w h i c h w c 怫c l o s e t o h u m a n m i l k i l io r d e rt ow e e k e nt h eb a dt a s t ea n de n h a n c es t a b i f i t yo f h y d r o l y s a t o t h ee x p e r i m e n tm i x c o wm i l ka n dh y d r o l y s 疵缸a l lk i n d so f p r o p o r t i o n t h er e s u l ts h o w e d t h a tw h e nt h er a t i oo f c o wm i l k ：h y d r o l y s a t ei s 5 ：5 ，t h eh y d r o l y s a t eh a sn oi l l f l a v o ra n dh a sg o o ds t a b i f i t y t h e m i x t u r ec a l l b eu s c d 邪m a m i a lo f i n f a n t m i l k p o s t g r a d u a t e ：l i uf a n g m a j o r ：f o o ds c i e n c e s u t m v i s o r ：p r o f h u eg u i c h e n g k e yw o r d s ：c o wm i l kp r o t e i n p a n c r e a f i n i n f a n tm i l k h y d r o l y s a t e 硕士学位论文 牛乳蛋白质酶改性的研究与液态婴儿乳的研制东北农业大学 婴儿阶段是人生中具有重要意义的时期，母乳无疑是婴儿最理想的天然食品。然而 由于工作状况、职业、疾病等原因，母乳的喂养现状并不尽人意。我国每年有2 0 0 0 万婴 儿出生，其母乳的喂养率为8 0 ，即约有4 0 0 万婴儿需要人工喂养，这些婴儿共需1 1 万吨婴儿配方奶粉，市场缺口达5 万吨之多。因此生产出合理的、适合婴儿生长发育的 婴儿代乳品破在眉睫( 陈慈，1 9 9 7 ) 。 母乳是新生儿的天然食品，具有其它任何婴儿代乳品不可比拟的优点，但是由于职 业、身体状况、疾病等原因，母乳喂养的现状并不尽人意。当母乳缺乏时，牛乳因其来 源广泛、与母乳成分较为接近而常被用来作为母乳的替代品。但以牛乳喂养初生婴儿常 会引起许多不适应症，如消化不良、过敏反应等。对牛乳进行适当的水解可以改善牛乳 的不易消化性，减少婴儿对牛乳过敏反应的发生。经适度水解后的牛乳，经调节其不饱 和脂肪酸含量，降低矿物质含量，添加适量的维生素，补充微量营养成分，即可生产出 既适合于婴儿消化又满足婴儿营养需要的母乳代用品( 孙志勇，1 9 9 1 ；王芸，1 9 9 8 ) 。 1 1 婴儿食品的国内外发展状况 在1 8 和1 9 世纪时并没有婴儿配方食品，没有母乳的孩子是用米糊、麦糊和牛乳来 喂养的婴儿的死亡率极高。到1 9 世纪末，生物学和医学的进步为母乳代用品的发展提 供了基础。1 8 6 7 年德国人j u s t r s v o n l i e b i n g 发明了第一个婴儿配方，并获得专利。它 由小麦粉、麦芽粉和少许碳酸钾加入到牛乳中煮沸而成。18 5 6 年发明了牛乳的真空浓缩 的方法，生产出了炼乳，这种产品的酪蛋白凝块少，易于保存，广泛应用于婴儿的人工 喂养( 艾长余，1 9 9 2 ) 。 1 9 世纪末，h e r b e r 和r u b n e r 创立了婴儿喂养的能量测定法，即根据婴儿的能量需 要来进行喂养，它奠定了研究婴儿新陈代谢的基础。1 9 1 5 年，美国人g e r s t e a b e r g e r 和 c o l l e a g u e s 发明了第一个以乳为基础的婴儿配方。该配方把植物油、动物脂肪添加到脱 脂乳中使其脂肪及其它成分含量均接近于母乳。此配方法被专家称之为s m a ，即 s y n t h e t i cm i l ka d o p t e d 。目前世界上的婴儿配方食品大多由此演变而来，而且主要以牛 乳为基础。 随着对牛乳成分、母乳成分和婴儿营养的认识的提高，欧洲和美国对婴儿配方的研 究在不断扩大。1 9 6 1 年美国惠氏公司研究出了第一个以乳清蛋白为主的婴儿配方。由此 至7 0 年代末，世界上采用婴儿配方食品喂养婴儿是很普遍的( 肖家婕，1 9 9 7 ) 。基于婴 儿的体质状况，以及具有某些疾病的特殊婴儿的特殊需要，对婴儿食品的研究不断深入、 不断改进，产生了各类不同的婴儿配方食品。这些婴儿配方食品主要包括：( 1 ) 以乳为 基础的配方：在脱脂乳中添加脱盐乳清，使酪蛋白与乳清蛋白的比例达到8 ：2 ，与母乳 比例接近，同时添加维生素和矿物质。( 2 ) 以大豆为基础的配方：以大豆为基础，以植 物油提供不饱和脂肪酸，以葡萄糖和蔗糖提供碳水化合物，同时添加维生素和矿物质。 4 刘芳前言2 0 0 2 年5 月 ( 3 ) 以牛乳和大豆为蛋白质的主要来源，其它调整同前两类配方。( 4 ) 特殊配方：针对 低体重婴儿、患有乳糖不耐症的特殊婴儿所设计的配方( 张勇飞，1 9 9 4 ：张芝芬，2 0 0 0 ) 。 6 0 年代以后，随着蛋白质的研究和分离技术的提高，婴儿配方乳得以不断地进步和完 善，如表1 1 。 表1 1 婴儿配方乳产品随蛋白质技术的进步而进步的简要历程 t h b i e l 1 1 1 m b r i c f p r o c e s so f i n f a n t f o r m u l a d e v e l o p m e n t w i t h l l ”p r o g r e s s o f s t u d yo f p r o t e i na n ds e p a r a t i o nt e c h n o l o g y 序号主要新技术操作主要依赖技术大致年代 在牛乳中添加脱盐乳滴粉，将乳清蛋白与母乳和牛乳大成6 0 年代开始 酪蛋白的比例由2 0 ：8 0 调为6 0 ：4 0 ，相应地分的分析，乳清脱盐 1提高了乳糖含量：调整的成分还有：矿物盐，技术的成功。 痕量元煮和维生素。调整后，配方乳与母乳在 蛋白质方面的吻合程度能达耕近7 0 。 精细调整配方乳中酶蛋白和乳清蛋白的蛋白质研究技近l o 年取得很 组分，主要为除去口p 酪蛋白，提高 酪蛋白，术，蛋白质分离技术，多实质性结果，近5 2 添加乳铁蛋白。配方乳与母乳在蛋白质方面的乳铁蛋白性质和生理年出现产品。 吻台程度被提高到8 5 9 0 。研究，乳铁蛋白的分 离提纯。 添加溶菌酶，调整免疫球蛋白( 改i g g 为溶菌酶的研究和近5 年，目前为 主为i g a 为主) ，溶菌酶使配方乳与母乳的免 分离，免疫球蛋白的理论性产品。 3 疫作用更强。配方乳与母乳在蛋白质方面的吻研究和分离 台程度能达到近9 0 。 使用乳清蛋白水解物。乳清水解和肽分近1 0 年出现的 离技术蛋白质过敏产品，供蛋白过敏性 4 症的研究婴儿使用：近5 年品 种不断增多，成为特 殊膳食产品。 调整必需氮基酸，主要是提高对生理系统婴儿生理系统和处于理论性研 5 及其重要的半胱氨酸和色氨酸，及为保证血浆血液系统的研究，蛋究阶段。 中氨基酸处于平衡而调低苏氨酸白质的研究。 调整有重要生理作用的具有激素类活性激素类生理作用处于初级理论 6 的肽( 母乳中有3 0 种，牛乳中只有6 种) 。研究。性研究阶段。 1 2 影响牛乳不易于婴儿消化的主要因素 据统计，全世界约有8 5 的婴儿患有牛乳过敏症状，我国的情况更为严重。牛乳过 敏症状有轻重之分，有些婴儿在喝奶过程中或喝奶后突然出现大声哭闹有的婴儿还会 5 硕士学位论文牛乳蛋白质酶改性的研究与液态婴儿乳的研制东北农业大学 出现周身寻麻疹、哮喘等( 文周嵘，2 0 0 1 ) 。牛乳过敏症状引起了越来越多的食品学家的 关注。牛乳引起婴儿过敏症状的原因要从牛乳与人乳成分的差异加以分析( a n d r e ，1 9 9 3 ) 。 1 2 1 牛乳与人乳含量成分的差异 牛乳与人乳含量成分的差异是婴儿对牛乳产生各种不适应症的主要原因。目前，母 乳代用品配方的基本原则是调节牛乳成分，使其最大程度上与母乳相似。母乳与牛乳含 量成分的差异如表1 2 所示( 王福成，1 9 9 7 ) 。 表1 - 2 母乳与牛乳成分比较表 t a b l e l - 2t h e c o m p a r a t i v et a b l eo f h u m a n m i l ka n dc o wm i l k 目前的婴儿配方食品己基本能够满足婴儿对营养物质和微量元素的需求。如：添加 乳清粉调节酪蛋白与乳清蛋白的比例；乳清粉采用脱盐乳清粉以降低牛乳的矿物质含量： 6 刘芳前言2 0 0 2 年5 月 添加植物油提高不饱和脂肪酸的比例：添加麦芽糖补充碳水化舍物；提高维生素和矿物 质含量；添加低聚糖，增加双歧因子含量；添加牛磺酸和d h a ，促进喂养婴儿神经系统 发育等。 1 2 2 人乳与牛乳成分中蛋白质含量的差异 现有的婴儿配方食品能够在营养成分和微量成分上较全面的与母乳达到相同。在各 种营养素日趋完善的同时，酪蛋白的消化问题成为婴儿配方食品的主要问题。牛乳蛋白 质与母乳蛋白质成分的差异是造成乳基婴儿配方食品不易消化的主要原因。母乳与牛乳 蛋白质成分的差异如表1 - 2 所示( 顾瑞霞，1 9 9 9 ；朱发增，1 9 9 7 ) 。 表l - 2 母乳与牛乳蛋白质成分的差异 t a b l e1 - 2t h ed i f f e r e n c eb e t w e e nh u m a nm i l k p r o t e i na n d c o wm i l kp r o t e i n 1 2 2 1 酪蛋白与乳清蛋白含量比例的差异 人乳中酪蛋白与乳清蛋白的比例为4 ：6 ，而牛乳中酪蛋白与乳清蛋白的比例为 8 ：2 。婴儿胃内的p h 值保持在4 - - - 5 之间，接近于酪蛋白的等电点，易在胃内形成凝块， 不易于婴儿消化吸收；而成人胃内p h 值小于2 ，远离酪蛋白的等电点，不会造成消化障 碍。由于母乳中的酪蛋白含量低，在胃内与胃液相混舍，形成了酪蛋白、钙和乳清蛋白 共存的细小而柔软的凝块或絮团，易被婴儿消化吸收。牛乳中的酪蛋白含量相对较高， 在婴儿胃内形成的蛋白质凝块坚韧、有弹性，不易于婴儿消化。因此调节酪蛋白与乳清 蛋白的比例是现有婴儿配方奶粉的基础( m a r f i n e z ，1 9 9 3 ) 。 1 2 2 2 酪蛋白种类与结构的差异 母乳与牛乳蛋白质的差异除表现在酪蛋白与乳清蛋白含量的差异外，酪蛋白的种类 及结构也存在着明显的差异。 酪蛋白是乳在2 0 、口h 值为46 的条件下沉淀下来的蛋白质，呈酸性，是一种含磷 7 硕士学位论文牛乳蛋白质酶改性的研究与液态婴儿乳的研制东北农业大学 的蛋白质，其酪蛋白成分的宏观差异如表1 - 2 。乳酪蛋白的结构包括一级结构和空间结 构，其一级结构包括qs 1 - 酪蛋白、s 2 - 酪蛋白、qs 3 酩蛋白、s 4 - 酪蛋白、a $ 5 - 酪蛋白、 s 6 酪蛋白、隆酪蛋白、t 酪蛋白、b 酪蛋白。其中，s - - 酪蛋白是牛乳中的主要酪蛋白， 占总酪蛋白的3 8 ，而其在人乳中含量甚少，b 一酪蛋白既存在于牛乳中，也存在于人乳 中，在牛乳中的含量仅次于口s 酪蛋白，占总酪蛋白含量的3 5 ，而在人乳中d 酪蛋白 含量最高。k - 酪蛋白是酪蛋白中唯一含有糖成分、对钙不敏感的酪蛋白，在牛乳中占总 酪蛋白的1 3 ，而在人乳中占总量的8 。b 酪蛋白对凝乳酶敏感，凝乳酶作用于k 酪 蛋白p h e ( 1 0 5 ) 、m e t ( 1 0 6 ) 残基之间。s 1 酪蛋白、b - 酪蛋白和”酪蛋白等通过口s 螺旋、 b 折叠和阻转角等结构构成了酪蛋白的空间结构( 朱发增，1 9 9 7 ) 。酪蛋白胶粒( 其组成见 表1 - 2 ) 1 扫亚胶粒组成，亚胶粒的外壳有k _ 酪蛋白分子和磷酸丝氨酸残基。在亚胶粒的外 壳有磷酸根，各亚胶粒通过其连接为酪蛋白的徽团( e u n i c e ，1 9 8 9 ) 。母乳中的这种胶粒类 似球状，表面粗糙多孔，粒度范围为2 0 , - - 6 0 0 r i m ，牛乳为1 3 0 - - 1 6 0n n l 。牛乳中含有大量 的as 酪蛋白，而母乳中几乎不含有，这种口s 酪蛋白是导致牛乳中酪蛋白消化性比母乳 差的主要原因。母乳中的酪蛋白在胃内形成较小的胶束粒子，呈分散状态，而牛乳中的 酪蛋白在胃内形成较大的凝块，且坚硬，不易被婴儿消化吸收( f i l e r , 1 9 9 3 ) 。 1 2 2 3 乳清蛋白种类与结构的差异 乳清蛋白是指乳中2 0 ( 2 、p h 值为4 6 时酸化沉淀后，分离出来的乳清中所含的蛋白 质包括b 乳球蛋白、* 乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和乳铁蛋白等。其中，1 3 - 乳球蛋白含量的差异是造成婴儿过敏的主要原因。母乳中没有 乳球蛋白，而这种b 一 乳球蛋白不易被蛋白酶所消化，在婴儿胃内不被分解，造成婴儿过敏 w d i ，1 9 9 1 1 。 1 3 蛋白质的消化与吸收机制 1 3 1 蛋白质在体内的消化吸收过程 1 3 1 1 蛋白质的消化过程 膳食中的蛋白质降解为游离的氨基酸可分三个阶段，最初在肠腔、接着在肠上皮细 胞的刷状缘、最后在肠上皮细胞的细胞液q a ( s a w a t z k i ，1 9 9 2 ) 。蛋白质起初在胃中由胃蛋 白酶水解羰基端连接芳香环的亮氨酸的肽键，然后受小肠中由胰腺分泌的肽链内切酶一 胰蛋白酶，腆凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶的共同作用，胰蛋白酶水解碳端连接赖氨酸和精 氨酸残基的肽键，而胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶作用于碳端含有芳香环和疏水氨基酸残 基如亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸的肽键。生成的肽再由胰腺分泌的内切酶a 和b 水解 成其它物质，羧肽酶a 由碳端水解成中性氨基酸，羧肽酶b 由碳端水解成碱性氨基酸。 蛋白质水解后，肠腔内含有少量游离氮基酸和大部分肽，这些肽由2 6 个氨基酸残基组 成( a n d r e ，1 9 9 4 ) 。 1 3 1 2 肽和氨基酸的吸收过程 刘芳 蒋言2 0 0 2 年5 旁 尽管消化的蛋自履在吸收之前已被水解，但大分子物质可以通过肠上皮细胞内吞作 用而被摄取。而这种设牧作糟并不萤簧，值它帮提供了摄取其有潜在生理意义丈分子物 质的机制( s c h 矗鹊彬，1 9 8 7 ) 。太分子包括免疫球蛋自、细菌毒紊秘珂能存在始变态反应 原。缀多被内吞蚋分孑进入溶酶体丽降解。那些不被消化的大分子通过吞吐作用而留在 细胞基底侧。= 肽和三戢的吸收速度比等量游离费e 基酸的侠，此梳理可用融和氨基酸鲍 转运来解释。肽有两种转运形式：是瓤的膜木解，氨纂羧因此两吸收( “单体”转运) ； = 怒细胞内水解( “寡壤体”转运) 。肽的吸收也可遵过简单扩靛来完威，它对体外转运 高浓度肽育作用。 1 3 + 2 驮镶长度对牛毳可消化牲及致敏性的影响 膳食中的蛋白质水解成游离氨基酸分三个阶段：在扬道内阶段、在肠上皮缎胞利状 缘上阶段和在肠上皮细胞的细戴液阶段。由予= 驮和三驮的消化皲吸收速度比等羹的游 离氪摹酸快，因此，在婴儿抗过敏性代乳品申，控制水解产物中的肽链长度对选择最佳 生理性的水解产物其有重要意义。 磁食蛋白质在体内转变为营养物质或代谢产物之翦，必器先水解成备种氨基酸。传 统观点认为，蛋自质进入肠黏媵细胞之前能够完全水解成游离的氨鏊藏，然而，在十九 世纪六十年代发现，短默程消亿的最后阶段融特殊的载体转运劐肠细胞，然后在肠上皮 细胞的细胞渡中由歉酶承解。 蛋白质水解物对于消化遭水解功能受损秘吸收能力低下的营养不良病人来说是扳 为有益的，由于肤眈游离氟基酸的混食物其育更小的渗透班，肽可以 馨为膳食中的氮深 可以有效提高吸收能力和降低渗透压。两且在肠遭的成分中，= 肽和游离的氨基敬楣比， 转运所需的碳水忧合物更少。蛋自水解物的另一个优点是其昧感比游离的氨萋羧之濑食 物更易被接受( a l b m s ，1 9 s 9 ) 。蛋白质永瓣物也其有减少或排除抗原的潜在能力。利用蛋 白质水解物能降低抗原性这特性，珂以开发婴儿抗过敏性代乳品，因此避免婴儿蜀喝 牛奶产生的过敏反应。代乳品中呈现抗原性的是8 l o 个氨基酸残基。器管嚣方人中对 牛乳蛋白质育过敏反应人只占约2 ，但是水解产物正在不断地用以预防过敏反应 ( s a w a t z k i ，1 9 9 2 ) 。 1 , 4 牛乳蛋白质永解物的功能性质 1 4 i 牛警l 水解物的营养 入乳和动物飘被认为基舞接近完善的食晶，所含有的维生素、徽量嚣索等各种营养 素种类齐全，配拢合理。飘中含有大量的生物活性因子，如：阿片样脓( o p i o i dp 础d e s ) 降血压肽( a n f i h 忡i v ep e p t i d c s ) ，抗血栓欣( a n t i d u o m b o l i cp e p f l e s ) ，免疫促进散 ( i m m l m o s f l i m u l a t i n gp c p t i d e s ) ，键钙吸收的黪蛋囟磷酸胶( c a s 曲l p h o s p h a p c p f i d 嚣, c p p ) 等。在水解屠蛋自质被分解成短肽，更易于潸化和吸收( 吴建平，t 9 9 9 ) 。此外，水解对 予蛋自质产品的风睬、质构、色泽稳定性、以及蛋自质理化性质和功骀蛙质都其毒较大 的影响( 杨文鸽，2 0 0 t ：m a r g i t ，1 9 9 7 ) 。 9 硕士学位论文 牛乳蛋白质酶改性的研究与液态婴儿乳的研制东托农娃大学 1 4 2 蛋岛水解物在婴儿抗过敏性代乳品串豹应用与特性 加热可引起蛋自质变往和空间构象的改变，同时酶健降解和浓酸处理都能破坏其结 构。从营养角度来髫，酸水解产物不如核酸外切酶和核酸内切酶之平衡混含物的水解产 物。后者酷似小肠申产生的水解物质。在一定的温度、p h 值、时间条件下完成水解质， 通道加热中止酶水解反应。其采水解的蛋白质和聚集肫强自质用离心箴过滤的方法除 去，毒鳟也用活性炭处理。这种酶水解、热处理和分离技术的综合运用哥明显降低蛋自 赝的致敏性。热处毽的抗过敏性代乳品在预防过敏和因牛奶蛋自引超过敏反应的婴，l 营 养上得到应用( b u r k e。,1987) 市场上先屠出现三代婴儿抗避敏食晶。第一代为在市场上已销售幸。多年的第一代 婴儿抗过镦性代乳品是基于不易满纯的酪蛋自。第= 代是基于小麦蛋自质的水解产菇在 市场上销售近1 0 2 0 年。第三代代乳最发展是由于超滤蔽零的应用把蛋白质抑繁4 物从水 解物除去霭得以实现的。第三代代乳品是肽酶酶促水解和超过滤技术应用的结巢，此产 品含少鼍游离氨萋酸和少量缀肚，防止了苦嚏肽的形成( a n d r e 。1 9 9 3 ) 。 1 5 荔消化母乳代蘑晶的研究思路 近年来，国内外科学家对于这些影响婺幼几消优的不剩蠢豢进行了大囊研究，并提 出了相应的解决携施。其中最基本鲍解决方法就是传统的调节璐蛋自和乳清蛋自比例的 方法。酪蛋白与乳清蛋白的比例熊够初步解决牛乳进入娶儿胃内形成的凝块犬且蟹硬的 问题这是现行婺儿配方乳耪的基础，但其有待予进步的开发研究。这一方甄悬由于 进口的乳清耪造成外汇的丈繁瀛出；男一方藕，仅仅调整酪蛋白与乳清蛋白的比为4 ：6 不能根本解决婴儿的消化闻鼹。t k u w a t a , a mp h a m ( 1 9 8 5 ) 提出扶乳清蛩自中分离除 去乳球蛋自以模拟人乳，f r e d e r i c s a n n e i e r , s t e p h a n i e b o r d e n a v e 等建立了用趣滤膜酶反 应嚣的方法从乳渍骚自中纯他山苹的b 巍球蛋囟。s h e r w o o d ，g e o f f r e y 等人采用水解豹 方法以改善牛乳对于婴儿的致镀性和不舄消化性。 1 5 1 酪蛋白的分蕊 常见的酪蛋自分离和改性的方法主要是除去其中的ds 酪蟹自或对其改性以使孛乳 酷爱臼组成毒母乳稳儆。醮蛋自在其等毫点( p h 46 ) 时会凝固析出两呈不溶性状态。最 常用的方法就是舟脱脂乳中翱酸，即酸沉性，以使牛乳酪蛋自组成与母乳相似。主要的 手段有：( 1 ) 等龟点分离。酪蛋白在其等电点时，其溶解虔降低到最低点。将盐酸加于 戚膳乳中，调节其西 使之达到薛蛋白里最小溶解度之点。在2 时壁最，j 、 骞解度的p h 为43 ：在2 0 3 0 时p h 为4 ，5 4 ，6 ，离心分离出沉淀物，荐用n a o h 调p h 达7o 7 2 ，再用盐酸沉淀。( 2 ) 加钙分离。过量的钙会使懿蛋自发生沉淀。如在脱胎乳中加 c a c l 2 这o0 7 m o l l ，维持p h 6 、6 6 8 。i r 月亮遵离心分离出黪蛋自沉淀物。( 3 ) 酶水解 作用樽到酪蛋白。用凝巍酶藕酸性蛋白酶对酶鬣自袭蔼的静酪蛋自进行水解，通过添加 钙离子可佬被酶改变的酪蛋自胶柬；l 起凝嗣，这是酪蛋自常用的凝圈方法。此外。还 可采用添加( n i ) ：s 0 t 的簸辑方法+ 1 0 刘芳 前言2 0 0 2 举5 月 1 , 5 。28 s 酪蛋蛊和酪蛋自的分离 尿素分级分离的方法是将酪蛋白悬浮分教于p h 7 5 的3 ，s m o l l 的尿素中，调节 p h 4 ，6 ，则大部分# s 酪蛋自和k 酪骚自沉淀，上清液调p h 49 ，稀释尿素浓度列l m o i l 萍加温至3 0 ，剐阻酪蛋白沉淀析出。 簿法分离的方法是基于n 酪蛋自对于酪蛋自胶束的稳定作用，利用酶水解”酪蛋臼 使其失去傈护作用，再根据qp 酪蛋白和m 酪蛋白对钙离予敏感性的不凰，控青l 钙离子 麴浓度，哥以使两者得戬分离。将酶法分离酪蛋白用p a g e 凝腔电泳检测，发现酪蛋白 中大童的s 。- 酪蛋白被去除，聪大部分的弘醚摄囊得以保罄( m 籼，1 9 8 6 ) 。 酪蛋白改性的方法是先采用蛋自酶对牛乳中的蛋自酶进彳亍预消化，使之转化为易消 化吸收的多肽。这部分多歇通过强化一定量的氨基酸如半胱氨酸等，有可能起到代替乳 清蛋白的作用，酪蛋白的展开结构比乳清蛋白更易被蛋白酶水解。但是，由于酪蛋白具 有高度疏水性，会使相应的酶解产物带有大量苦昧的巯水性肽，丽影响乳制品的口惑和 风昧，采用真菌蛋白酶则可使苦睬降低到一定的瑕度( l o s i f , 1 9 9 1 ) 。 i 5 3 瑰潦蛋自的分离与改性 对乳清蛋白进行分离与改性就是要除去口。乳球蛋白这一变应原或消除其致敏性，使 牛乳乳清蟹自更加接近母乳乳漕蛋白。 盐析法分离乳清蛋白主要包括( n h 4 ) 2 s 0 4 法，n a c l 法，f e c l 3 法( f r 6 d e n c ，2 0 0 0 ) 。 膜分离法分离乳媾蛋白就是利用超滤或电渗析的方法，将乳清蛋白先用超滤进行分离浓 缩，浓缩液用酸调节p h ，接着进行电渗析，以除去离子。脱盐后的蛋白厦浓续波；经调 节 至46 5 ，朝产生部分沉淀析出，分出沉淀和上清液，鞠得剜较缝的乳白蛋白和 8 ，乳球蛋i 刍( s h e r w o o d , 1 9 9 4 ) 。此外，如果选用藏魍相对分子质量约2 5 0 0 0 的膜也霹蠢接 馊乳球蛋自得要日浓缩，而舡乳自蛋自刘樗刭过滤分离( f r e d e r i c ，2 0 0 0 ) 。 柱层析分离乳瀵蛋白的方法是根据* 鼹是蛋自靼& 孥0 球蛋自在槿对分子质量和结构 上的差异，改变p h 值，调节溶液离子强度和蛋白质浓度，利用羧甲基纤维索离子交换 树聪可选择地吸附除去黏孥l 球蛋白，或雕s e p h a d * x 凝胶层柝也可将这两种蛋自质分离开 柬。 采用酶本解蛋白矮变瘟原，使之分解戒小分子绒多款( e u n i c e ，1 9 8 9 ) 。对于b _ 乳球 蛋白，当被分解成相对分子蠹小于3 4 0 0 的多败时，其致敏性即丧失。熊解法的关键是酶 的选择既要考虑酶的作掰与锋乳球殛自的选择性和有效性，又要减少苦味欣的产生。可 从动植物和微生物来源的蛋自酶中选择含适的瓣类，利用弘$ l 球蛋鑫羊e * 乳自蛋舀戬及 其它蛋岛矮之阔的性璜差异，或在一定p h 、离子强度等条件下使这掰种蛋白质的结构发 生改变，从而使b 乳球虽囱易被水织，褥* 乳自餐自及其它蛋自质少受影响鬣不求解。 1 6 牛乳鬃臼质水解物苦昧的控制 m u r n a y 和b a k e r ( 1 9 5 2 ) 认为苦味的产生是姬肽g j 起豹，这些若妹肽中禽存一个凌 多个璃水蛙复c 基酸。掇攒苦味默与菲苦殊敬的氨綦酸成分，n e y 总结出在肷的疏水性与 l l 顼士学位论文牛乳虽白质酶改搜的研究与滚态婺，k 募螅研剃东l b 农娃套孝 蔫壕之间尝在翘互美系。链提出q 规律，营昧默q 镶大予1 4 0 0 k c a l m o l ，蔼所有j # 蔷睬 款q 僖枣予t 3 0 0 k c a l m o l ，妇鬃q 值夜1 3 0 0 k c a l m o l 和1 4 0 0 k c ；a l m o l 之间，受4 不憨说骥芜 否商蕾妹存在，这个原则对于分子量小于6 0 0 0 d a 的分子蠢效，分子量太予6 0 0 0 d a 的分 子也没有酱竦( 赵营毕，1 9 9 9 ：赵乖j ，1 9 9 s ) 。 影响摄自矮水解甥若骧的熬耀素骞报多。原料静选择：在众多的骚自质中，照赞自、 乳蛋白、玉米鬻臼、士豆滠自、大压强自期小麦蟹基等麴窳解滚麴营嗦较重，遮霹能与 这些簧照震中蒇水牲氮萋酸含囊满骞关。承解程度? 逶常，骚藿求觯度的增加，东解滚 的蔷睬也壤加，但在水解度较小时，水解度的增女q 对茬味的影响较小。酶的选择：同一 种酶处理不褥的簧囱瘊会产生不简强度的苦睐，葡间一种磊自质用不同的酶处理，也会 产生不趱强度鲍蔷昧( 张延雄，t 9 9 7 。碱性蛋鑫酶主要断裂疏水惶羲篓酸c 端，而疏 承镫氨豢酸在终端耽在获率闯釜较小的苦昧，因诧虢性蛋白瓣茸炎戗专一性驰蛋白酶永 解拳味较小。p 壬毽；实验证明p h8 先大豆凝瞧水瓣豹最佳p 僮，若其上下变纯个 蕈位，对苦昧的影响均较大。因此，严格控制p h 值可减少蛋白质水解液的苦嗦疰( 诲 永经，1 9 9 7 i 糖兰，1 9 9 9 ) 。 i 7 研究的西的和意义 婴儿阶段悬人生中其骞重要意义的时期，母乳茏疑是婴j k 最理想抟天然食鼎。然焉 出子种种原茵，母乳缺乏璃象非常普遍( 张美芳，1 9 9 7 ) 。9 0 年代初期，仅裁成都市4 6 嚣龄婴l 的母乳喂葬率为5 4 4 ( 陈慈，高远铺，1 9 9 7 ) 。据统计，在我嗣箩阻下鬓 l 蹲乳疆莽翠在城市为5 8 ，农树为9 1 ，5 。樽不刭母乳曦募的婴蛸s 要露已方食器作隽 代襞晶。婺，联方巍粉黪帝瑶缺瓣达5 万戆之多。 现有的婴儿奶耪能够森营莠成分和微量成分上较垒匾鲍在鐾鲤方委譬母巍达4 攘 褥，僵在震鹩方瑟仍有攘太麓剐，主要憨虽白葳不荔漓仡，效价低，易引起婴儿过敏如 搜泻、呕吐等。鲤此，舞要对瑗考鹘要j k 配方食晶针对其潜能撬进行改良，戳利于餮l 辫生长发育。 1 , 8 研究内容 本课题驰研究疼窑包括； ( 1 ) 胰蛋自酶永解牛乳以生产婴j l 代嚣瑟最佳用簿躲选择。 ( 2 ) 研究胰蛋酝酶求解牛乳静最适瀣发、p h 煎及最适酶浓度。 ( 3 ) 研究水解产物的分予羹分毒。 f 4 ) 判定承解产物感富矮煮。 ( 5 ) 确定牛乳与串乳承解滚攫台鞋：铡，璺，b 代巍晶豹乳基原料。 型萋 塑壁兰查茎一翌婴! ! ! ! 旦 2 1 材料 2 1 1 原瓣与主要试刹 脱脂乳粉 乳溥耪 母乳 胰置鑫簿 簧蟹白酶 术题蛋白酶 中瞧蛋白酶 碱缝蛋癌酶 熙辕潦 溶蘸酶 凝巍瓣 水合茚三鬻 d 巢糖 2 1 2 仪器设备 2 材料与方法 邀热僚滋农漆锅 w p d 型微生物多蔫培养箱 l k b 自动柱屡辑授 懿本8 ：3 5 - - 5 0 氨基簸自动分辑仪 u v - 2 4 0 l p c 分光光度计 高鸷切混合乳诧机 多功能侠速瀵他器 c s 2 0 2 型电热保温苄燎禧 j j 1 电动揽拌器 p h s - 3 c 型p h 计 离心枧 电芋霹调电炉 电予天平 龙丹巍业集团提供 龙丹乳鼗集弱提供 撬供东载农鼗大学校藩院撼供 联星公司代理 上海华舜生物制剂有限公司 广西酶制剩公司 广毯酶裁帮公司 托索诺和诺德生物制眷j 有黢公霹 广透酶铡荆公司 s a n g o n 进口分装 广西簿制井对公司 北京兹潮耩细纯学燕霄缀公霹 乾塞益剥精细仡学器宥限公司 天津帝泰斯特仪器有璜公嗣 上海菇蹋仪表厂 臻典 网济大学枫电厂 舀本岛津 强苏寤东索长江枫蘸有黻公司 疆苏省寰菇市科教仪器磷究所翻造 重庆实验设备厂胄l 造 鬻州国牮电器考隈公司 上海嚣磁仪器厂 j b 寨医熙蕊心瓤厂 天津枣泰瓶特仪器有限公弱 a b 5 4 型m g 弭 l e r l 嚣d o 硕士学位论文牛乳蚕岛震酶教性盼研究与液态婴儿乳扮研制 东北农业大学 2 2 实验方