（食品科学专业论文）低糖适应性耐冻面包酵母的特性及应用的研究.pdf

中文摘要 本实验采用冷冻、低糖平板和反复冻融的低温诱导法筛选出2 株低糖适应性耐冻面包 酵母b y 一0 3 和f y 一0 3 ，对其生长特性和细胞构成成分进行了测定、分析和比较，并利用 该酵母进行了面包制作实验。 生长特性实验结果表明：一2 0 下冷冻四周后b y 一0 3 和f y 0 3 的发酵力保持在4 0 以上，存活率在6 0 以上，明显高于市售普通酵母( p 1 ) ：其麦芽糖酶活力分别为l o 1 2 和 1 5 1 0 u g ，高于p t ；且在蔗糖浓度0 - - 4 0 ( w w ) 的条件下生长良好。细胞构成成分分析 比较结果表明：f y 0 3 海藻糖含量是p t 含量的1 4 倍，b y 0 3 的海藻糖含量与p t 含量 基本持平。 从三种酵母中皆检出1 8 种氨基酸，其中有助于提高酵母耐冻性的三种带电荷氨基酸 即精氨酸、脯氨酸和谷氨酸的含量，b y 0 3 和f y 一0 3 均高于p t 。从三种酵母中检出了 饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸各4 种，其中b y 0 3 和f y 一0 3 的不饱和脂肪酸比例分别为 7 9 8 2 和7 8 6 2 ，明显高于p t6 4 9 6 。其中棕榈油酸c 1 6 ：i 和油酸c 1 8 ：l 的含量相差较大。 麦角固醇的含量b y 0 3 和f y 一0 3 显著高于p t ，而三者的磷脂含量没有明显差别。 应用实验表明：含b y 0 3 和f y 0 3 的低糖面团在冷冻四周后其面包制品的感官综 合评价结果均好于普通酵母( p t ) 制品。 关键词：低糖适应性；耐冻酵母：性能；细胞构成成分；应用 a b s t r a c t t h e l o ws u g a ra d a p t a t i o na n df r e e z e - t o l e r a n tb a k e r sy e a s ts t r a i n sw h i c hc a l l e db y 一0 3a n d f y - 0 3w e r es c r e e n e db yl o w - s u g a rp l a t ea n df r e e z e - t h a wt r e a t m e n t ，t h e nt h eg r o w t hp r o p e r t i e s a n dt h ec e l lc o m p o n e n t so ft h ey e a s t sw e r ed e t e r m i n e d ，c o m p a r e d e dw i t hc o m m e r c ey e a s t ( p t ) ， a n da p p l i e dt om a k i n gb r e a d 。 t h er e s u l t so fg r o w t hp r o p e r t i e ss h o w e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o na b i l i t ya n ds u r v i v a lr a t i oo f b y 0 3a n df y 一0 3 sk e p ta b o u t4 0 a n d6 0 ，w h i c hw e r eo b v i o u s l yh i g h e rt h a np ta f t e r f r e e z i n ga n dk e e p i n ga t 一2 0 f o r4w e e k s b y 一0 3a n df y 一0 3 sm a l t a s ea b i l i t yw e r e r e s p e c t i v e l y1 0 1 2a n d1 5 1 0 u g ，w h i c hw e r eh i g h e rt h a np t b y 0 3a n df y 一0 3 ss u g a r t o l e r a n tw e r eb e t t e rt h a np tu n d e r0 一4 0 ( w ，w ) s u g a r t h er e s u l to fc e l l u l a rc o m p o s i t i o ns h o w e dt h a tt h et r e h a l o s ec o n t e n to ff y 0 3w a s1 4 0t i m e s o fp t w h i l et h et r e h a l o s ec o n t e n to fb y 一0 3w a ss i m i l a rt op t t h el8a m i n oa c i d sw e r e d e t e c t e df r o ma l lo ft h r e ek i n d so fy e a s t s t h ec o n t e n t so f a r g i n i n ep r a l i n ea n dg l u t a m a t ew h i c h w e r eh e l p f u lf o re n h a n c i n gt h ea b i l i t yo ff r e e z e - - t o l e r a n c eo fb y 一0 3a n df y 0 3w e r eh i g h e r t h a nt h o s eo fp t f o u rk i n d so fs a t u r a t e df a t t ya c i d sa n df o u ru n s a t u r a t e df a t t ya c i d sw e r e d e t e c t e d t h ec o n t e n t so fu n s a t u r a t e df a t t ya c i d so fb y 0 3a n df y 0 3w e r e7 9 8 2 a n d 7 8 6 2 w h i c hw e r eh i g h e rt h a n6 4 9 6 o fp t , a n dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e np a l m i t o l e i ca c i d ( c t 6 ： 1 ) a n do l e i ca c i d ( cls ：1 ) w a sa p p a r e m t h ee r g o s t e r o lc o n t e n to fb y 一0 3a n df y 0 3w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a np t , w h i l et h el i p i dc o n t e n to ft h et h r e ek i n d so fy e a s tw a ss i m i l a r y e a s t sw e r ea p p l i e di nb a k i n gb r e a d ，a n dt h er e s u l t so fs e n s o r ye v a l u a t i o ns h o w e dt h a tt h e b r e a dw h i c hc o n t a i n e db y 0 3a n df y 0 3 sv a l u ew e r eb e t t e rt h a np t k e y w o r d s ：l o ws u g a ra d a p t a t i o n ；f r e e z e - - t o l e r a n tb a k e r sy e a s t ；p r o p e r t i e s ；c e l lc o m p o n e n t s ； a p p l i c a t i o n 论文、参加科研情况说明以及学位论文使心授权声明 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一发表论文 1 宋振玉，李楠，张姝等低糖适应性耐冻面包酵母菌种的性能及应用【j 】食品与发酵工 业，2 0 0 8 ，3 4 ( 1 2 ) ：4 0 4 3 2 低糖适应性耐冻酵母和非耐冻酵母细胞构成成分的比较已被核心期刊中国酿造 收录，2 0 0 9 年六月出刊，第一作者。 二学位论文使用授权声明 本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方面，编入 中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、天津商业大学博 硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 6 3 第一章前言 早在公元3 0 0 0 多年前，人类就开始利用酵母来制作发酵产品，只是当时人们还没有 认识酵母。长期以来，人们利用烤面包或蒸馒头所剩下的面团，即俗称“老面 、“发 面起子 、“老酵，来进行面团发酵。在这种古老的传统方法中，起发酵作用的是包括 酵母和细菌在内的多种微生物，其中包括多种产酸菌，最主要的是乳酸菌和醋酸菌，因而 面团发酵，在蒸馒头或烤面包之前，必须用碱中和。随着酵母技术的逐渐发展，酵母工业 逐渐形成。作为一种工业，从最初的啤酒酵母泥在市场上销售算起，酵母工业的发展历史 已经有2 0 0 多年【i 】。 自1 7 世纪开始，很多年来人们一直用从啤酒醪液的泡沫和滤饼中回收的废酵母来制 作面包。但是这种泥状啤酒酵母变质很快，运输和使用不方便，使产品的商品化受到限制。 1 7 8 1 年，在荷兰从啤酒泡沫中经离心分离出来的啤酒上面发酵酵母，经迸一步压榨成块后， 丌始在市场上销售，这就是最早的商品面包酵母。1 8 4 6 年，第一个酒精酵母工厂在维也纳 建立。在这种方法中，酵母与酒精是同时得到的，酵母是酒精的副产物，因而被称为酒精 酵母。这种生产酵母的方法被称为维也纳法。后来，在中欧，由于啤酒工艺出现了改革， 酵母菌种从上面发酵酵母转变为下面发酵酵母，如卡尔斯伯酵母 c a r l s b e r g e n s i s ) ，而下发 酵酵母对面团的发酵力较差，于是酵母工业就随着生产的发展逐渐从啤酒工业中独立出来 【2 】 o 中国酵母生产始于1 9 2 2 年，1 9 4 9 年以前只有上海大华利酵母厂，产品为压榨酵母( 含 水量7 0 左右) 。国内活性干酵母的研究和生产始于2 0 世纪7 0 年代，1 9 7 4 年上海酵母厂 首先试制出面包活性干酵母。国内酵母的生产作为一种产业的出现则是在2 0 世纪8 0 年代， 随着8 0 年代中期湖北安琪酵母股份有限公司( 原名中国生物开发中心宜昌食用酵母基地) 、 广东丹宝利酵母厂和广东梅山马利酵母有限公司的相继投产，标志着中国的活性干酵母工 业化生产达到了国际水平。活性干酵母行业处于快速发展期，全国的销售量每年基本上以 第一章前言 1 0 1 5 的速度递增。1 9 9 8 年国内高活性干酵母的总产量为1 8 万吨，2 0 0 1 年活性干酵 母总产量达3 5 万吨，2 0 0 5 年的总产量在5 8 万吨左右，2 0 0 8 年国内高活性干酵母总产量 可达9 8 万吨，活性干酵母生产企业也由1 9 9 8 年的3 家发展到目前规模不等的企业1 4 家嘲。 按品种分，目前国产活性干酵母已问世正式推向市场的有家庭用小包装面包酵母、高活性 面包酵母( 低糖) 、高活性面包酵母( 高糖) 、耐高温酒精活性干酵母、常温酒精高活性干酵母、 生香酒用高活性干酵母、黄酒高活性干酵母、葡萄酒高活性干酵母、啤酒高活性干酵母等。 中国酵母市场的广阔前景吸引了国际酵母大公司纷纷以收购、参股、合资等方式进驻其中。 l e s a f f r e 集团是目前全球最大的酵母供应商，成立于1 8 5 3 年，其酵母业务在全球5 大洲拥 有2 5 家酵母工厂，年产活性千酵母2 0 多万吨，其高糖面包活性干酵母的质量目前被烘焙 界公认为一流，2 0 0 1 年全资收购了安徽明光酵母厂。宾那斯集 虱( b u n s p h i l p & c o m p a n y l i m i t e d ) 是目前全球三大酵母集团之一，在全球2 0 个国家拥有31 个酵母工厂，目前在中 国有烟台马利、河北马利、哈尔滨马利、梅山马利合资酵母公司【4 l 。 1 1 面包酵母概述 1 1 1 面包酵母形态及分类 面包酵母( b a k e r sy e a s t ) 是具有制作面包最适宜特性的酵母的总称。酵母是一种单细胞 微生物，其形态为圆形、卵圆形、椭圆形或香肠形，大小随菌种不同而有差异。生产面包 所用的酵母以椭圆形的品种较好。 目前，国内外使用最多的是啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 。这是发酵工业上最常 用的菌种之一，按照其长宽的比例可将其分为三组。 ( 1 ) 细胞多为圆形或卵形，长与宽之比为l 2 。这类酵母除了用于酿造饮料酒和制作 面包外，还用于乙醇发酵。其中德国2 号和1 2 号最有名，但因其不能耐受高浓度盐类， 故只适应于以糖化的淀粉质为原料生产乙醇和白酒。 ( 2 ) 细胞形状以卵形和长卵形为主，也有些圆形或短卵圆形的细胞，长与宽的比例为2 。 2 第一章前言 常形成假菌丝，但不发达也不典型。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于酿造 啤酒、蒸馏酒和酵母生产，葡萄酒酿造业称为葡萄酒酵母。 ( 3 ) 大部分细胞长宽之比大于2 ，它以俗名为台湾3 9 6 号酵母为代表。我国南方常将其 用于糖蜜原料生产乙醇。其特点耐高渗压，可耐受高浓度盐类。该酵母原称为魏氏酵母【5 1 。 1 1 2 面包酵母的作用 面包酵母作为起发剂，在发酵过程中利用面粉中的可发酵性糖进行新陈代谢，产生二 氧化碳和少量的醇和酸。二氧化碳可使面团疏松多孔；醇和酸在烘焙时与面粉中存在的有 机物质发生复杂的反应，产生芳香的风味物质，增加人们的食欲。酵母在面包制作上起产 气、改变面团构造质地、产生香味及提供营养的作用可以概括如下： ( 1 ) 使面包体积膨松：面包酵母利用面粉中的可发酵性糖而产生二氧化碳和酒精，使 面包疏松多孔，体积大而膨松； ( 2 ) 改善面包的风味：面团在经面包酵母发酵过程中产生的酒精和面团中的有机酸， 在烘烤中形成酯类，使面包具有酯香。而化学膨松剂则不具备这种芳香味： ( 3 ) 增加面包的营养价值：面包酵母主要是由蛋白质构成的，在酵母中约含有3 0 一- 4 0 的蛋白质( 以干物质计) 和大量b 族维生素。每克于酵母中含有2 0 - - - 4 0 p g 硫胺素，6 0 - - 8 5 1 a g 核黄素，2 8 0 p g 尼克酸，这些营养成分提高了发酵食品的营养价值【6 1 。 1 1 3 面包酵母的特性 根据面包酵母从好氧型向微好氧型急剧变化的特殊生理环境，面包酵母应具备如下基 本特性： ( 1 ) 有潜在很高的糖酵解酶活性； ( 2 ) 具有快速适应底物变化的能力； ( 3 ) 具有合适的蔗糖酶( 或其他水解酶) 的活性： ( 4 ) 具有潜在很高的麦芽糖发酵速度； 3 第一章前言 ( 5 ) 具有合成在厌氧条件下生活所必需的酶和辅酶的能力。 此外，在适宜条件下具备较快的生长速率，对在面团发酵起始时所含的高蔗糖浓度具 有一定的忍耐性，以及由于酸性添加剂的使用而必须具备的广泛p h 适应性，也都被认为 是应当具有的性质。其中面包酵母的耐糖性是指酵母对面团中使用的蔗糖的适应能力，是 酵母性能的重要指标之一。有些酵母只适用于无糖或低糖面团，而有些酵母则同时适用于 低糖面团或高糖面团。 在面包酵母的众多特性中，发酵力性能无疑是衡量面包酵母质量的最重要的指标。酵 母的发酵力只有达到一定指标，才能符合面包生产的工艺要求。优良的面包酵母应具有良 好的发酵性能，表现在不论在无糖面团还是在高糖面团中都具有快的发酵速度和强的产气 能力；具备较高的比生长速率，较快的繁殖速度；在高糖环境中具备较短的延滞期，生长 较快等等【7 1 。 1 1 4 目前市售面包酵母的种类 按照面包酵母的特性分类可分为：普通高糖面包酵母、普通低糖面包酵母和耐冻高糖 面包酵母。 一般把适合在7 以上糖浓度中生存的面包酵母称为“高糖面包酵母”，反之称为 “低糖面包酵母”。目前国内市场上主要是这两种类型的面包酵母。随着冷冻面团技 术的发展，耐冻高糖面包酵母在欧美发达国家已被广泛生产和运用，具有较好的耐糖 性以及耐冻性。而低糖耐冻面包酵母在国内外市场上仍是空白【8 1 。 1 2 冷冻面团技术 1 2 1 冷冻面团技术的发展 冷冻面团技术是二十世纪五十年代发展起来的面包制作新工艺，此产品之上市，主要 是要满足那些想在家中自己能烘焙面包，而又不必花费很多时间在面团发酵处理等步骤的 消费者：这种技术是将面团制作和烘烤两个环节分离，即由较大的面包厂将已经过搅拌、 4 第一章前言 发酵、整形后的面团快速冷冻，然后将此冷冻面团销往各个连锁店或超市进行解冻、焙烤。 顾客可以在任何时间买到刚出炉的新鲜面包，也可以购买冷冻面团按自己的爱好进行加 工。使用冷冻面团技术既可以扩大面包的生产规模，降低成本，提高和稳定产品质量，又 极大地方便消费者( 冷冻面团技术还可以应用在馒头、花卷、速冻包子上) 。 在我国应用冷冻面团法生产发酵面制品虽然刚刚起步，但具有很大的发展潜力【1 0 , i i 】。 许多研究表明，提高冷冻面团制品质量的关键是要有耐冷冻酵母菌 1 2 1 3 】。适用于冷冻面团 法的耐冷冻酵母有耐热克鲁维酵母菌( k l u y v e r o m y c e st h e r m o t o l e r a n s ) 和啤酒酵母菌 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ) 。这些菌株多由土壤、谷物、水果和花卉等中分离得到t g , 射。日本 已开发出f r i 一4 1 3 等耐冻菌株，1 9 8 9 年底投入实际应用。i n o u e ( 1 9 9 5 ) 等通过突变的方法， 得到了适宜于冷冻面团制备的c s f ( c o l d - - s e n s i t i v ef e r m e n t a t i o n ) 突变菌株，该菌株在5 低温下不发酵，但温度回复到2 5 4 0 时，具有与亲本菌株相当的发酵性能。 1 2 2 影响冷冻面团的稳定性的重要因素 冷冻面团的稳定性，是指冷冻面团在解冻后具有的在比较短的时间内完成最后醒发， 并且烘烤出体积正常、拥有良好品质的面包的能力。冷冻面团经过长时间冷藏取出，再经 解冻、发酵和焙烤后，可以明显的发现，冷藏时间越长，面团的膨胀率越小，酵母的发酵 活力越低，这主要与酵母的耐冻性有关。 酵母耐冻性是指冷冻面团工艺制各过程中酵母忍受整个冷冻压力( 冷冻、解冻、冻存压 力) 的能力。酵母耐冻性可用冷冻后酵母产气能力来表示，这与冷冻后酵母的存活率和发酵 活力有关。对冷冻面团而言，酵母细胞的发酵活力( 即生长和繁殖的能力) 比它们的存活率 更重要。影响酵母耐冻性的因素很多，一般来说，耐冻性较好的酵母都有较高的蛋白质含 量。很大程度上，酵母的耐冻性是与前发酵期开始的快速降解后的胞内海藻糖基本含量有 关的，海藻糖能保护细胞免受冻伤。耐冻酵母在发酵时能保持较高的海藻糖基本含量。冷 冻时4 5 的海藻糖足以保护酵母在冻存的期间免受间接冻伤( 由冷冻贮存引起) 的伤害， 5 第一章前言 但更高的胞内海藻糖含量对于酵母抗冻性的进一步提高没有贡献【1 5 1 。 1 2 3 国内冷冻面团的应用前景展望 面包是深受大众喜爱的方便食品，可是由于面包容易老化而只宜鲜食、不易保存的原 因，使其发展受到限制。面包的老化也称“陈化”、“硬化 、“固化 ，面包老化后， 风味变劣，质地由软转硬，易掉渣，消化吸收率降低，营养价值下降。国内外焙烤食品行 业都致力于把最新鲜的面包推向消费者，面包的新鲜度也很大程度上决定了产品竞争力的 大小。虽然，1 0 0 多年来，世界上许多国家都在研究延缓面包老化的问题，并取得一定进 展，但冷冻面团的出现，无疑给面包乃至整个焙烤食品行业的发展注入了新的希望和生机 0 6 1 o 面包只宣鲜食，不宜保藏，造成我国面包生产规模小、成本高，采用冷冻面团技术便 可解决这一问题。它是将面团制作和烘烤两个环节分离，面包工厂只需生产出面团并冷冻 即可，快餐店、面包坊可将冷冻面团冷冻保藏，随时烘烤。使用冷冻面团既可扩大面包工 厂生产规模、降低成本、提高质量，又极大地方便了消费者。欧美、日本等国家应用冷冻 面团已有几十年了。冷冻面团的前言性研究起始于美国2 0 世纪3 0 年代c a t h c a r t 和l u b e r 等人的研究，而5 0 年代p r e n c e 的研究工作为焙烤工业中的冷冻概念奠定了基础，也为商 业操作确定了最佳参数。冷冻面团技术的优点在于将面团制作和发酵与焙烤过程独立分 开，冷冻面团的储藏、解冻、发酵及焙烤可由相对未受专业训练的人员甚至家庭主妇就可 以完成。冷冻面团的主要缺陷是货架寿命仍然相对较短，因为在冷冻储藏数周之后，冷冻 面团的性能将劣变。目前我国市场上销售的冷冻发酵食品基本上是将熟化后的制成品速 冻，并非冷冻面团f 1 7 1 。 在国内冷冻面团生产技术虽然目前还未有大范围应用，但前景广阔。主要原因如下： ( 1 ) 市场竞争激烈，份额扩大，急需以批量产品占领市场。 ( 2 ) 面包连锁店的生产销售需要。它可为连锁店大量提供新鲜的面包，使消费者以最 佳的消费方式获得最新鲜的面包。 6 第一章前言 ( 3 ) 品牌效益的需要。冷冻面团统一由中央工厂制作，其食品质量、重量等都可以得 到保证，也保证了消费者的合法权益，使企业的品牌发挥更大的社会和经济效益。 ( 4 ) 减少重复投资与人力资源浪费。若所有的连锁店可使用一套生产设备，即可减少 资金和资源的浪费。特别是实行5 天工作制，夜班人数少加班人数少，如使用冷冻面团 技术，建中央工厂，无需为此担忧。面包加工厂生产冷冻面团，将冷冻面团运往各烘烤房 或快餐店保存。 ( 5 ) 科学技术的进步。冷冻、。醒发两用冷柜的使用，为冷冻面团技术的应用提供了坚 实的基础。使用具有冷冻、醒发两用功能的设备，工人可在当天下班前把整形好的面团放 入冷柜内，设定好冷冻保藏温度和时间。解冻温度和时间，醒发温度和时间。待次日上班 时，面团已经按要求醒发完毕，即可入炉烘烤。解决了工作效率问题。总之，随着面包冷 冻技术的发展与应用，可以使生产者更简便、灵活地生产面包产品，消费者可随时吃到新 鲜的面包，这也是我国面包今后的发展方向l s j 1 3冷冻面团中耐冻酵母菌株的研究 选育耐低温的酵母菌种是获得良好的冷冻面团品质的关键因素。适用于冷冻面团制面 包的耐冷酵母有耐热克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e st h e r m o t o l e r a n s ) 和啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 。这些菌株大多是从自然界如土壤、谷物、水果、花卉等来源中分离得到。日本 已开发出f 对一4 1 3 等耐冻菌株，1 9 8 9 年底投入实际应用。i n o u e ( 1 9 9 5 ) 等通过突变的方法， 得到了适宜于冷冻面团制备的c s f ( c o l d - - s e n s i t i v ef e r m e n t a t i o n ) 突变菌株，该菌株在5 低 温下不发酵，但温度回复到2 5 4 0 时，具有与亲本菌株相当的发酵性能1 9 1 。 面包酵母耐冻性是指：冷冻面团工艺制备过程中酵母忍受整个冷冻压力( 冷冻、解冻、 冻存的压力) 的能力。面包酵母耐冻性可用冷冻后酵母产气能力来表示，这与冷冻后酵母的 存活率和发酵活力有关。对冷冻面团而言，酵母细胞的发酵活力( 即尘长和繁殖的能力) 比 它们的存活率更重要。 影响酵母耐冻性的因素很多。国内研究者的研究方向主要是海藻糖对面包酵母的耐冻 7 第一章前言 性的影响【2 0 , 2 1 】。国外研究者对影响面包酵母耐冻性的因素研究得比较全面，其研究发现胞 内海藻糖【2 2 1 、甘油【矧、乙醇f 2 4 】、热休克蛋白【2 5 l 、不同脂肪成分的比例【2 6 1 、某些带电荷的 氨基酸含量【2 7 , 2 8 l 、呼吸能力【2 9 1 、控制质膜的水运送的a q u a p o r i n 基因的表达f 3 0 1 等因素。 一般说来，海藻糖、甘油、带电荷的氨基酸、固醇磷脂比例、冰晶核基因的表达等是 面包酵母的抗冻保护剂。 1 3 1 海藻糖对面包酵母耐冷冻性的影响 海藻糖是面包酵母典型的应激代谢产物，又是酵母稳定期胞内所积累的贮藏性糖类， 能保护细胞在冷冻、脱水、高渗、高温、放射线及有毒试剂等不良环境下免遭伤害。h i n o 等认为海藻糖并不是所有种属酵母的耐冷冻机制。m e n d e s 等【2 3 1 发现，外源海藻糖能明显 提高酿酒酵母冷冻后的细胞存活率，而且预先经过短时热处理的酵母对冷冻的耐受能力明 显增强，原因是短时间热处理使得酵母胞内积累大量的应激产物海藻糖。s h i m a 报道【2 8 】 酵母胞内海藻糖就足可以保护酵母免受冷冻伤害，而且大多数耐冷冻酵母在发酵时能保持 较高的海藻糖含量。 1 3 1 1 海藻糖对酵母细胞的保护机理 海藻糖的保护机理目前仍在研究之中，其中有两种假说最被人们所接受，一种称为 “水替代”假说，另一种称为“玻璃( 糖浆) 态”假说。“水替代 假说：生物体中的蛋白 质、糖、脂类和其他大分子物质周围均包围着一层水膜，这层水膜对维持生物大分子的结 构和功能是必不可少的。当生物大分子失去维持其结构和功能特性的水膜时，海藻糖能在 生物大分子的失水部位以氢键形式联接，形成一层保护膜以代替失去的水膜。海藻糖和磷 脂的直接结合，有助于维持膜流动性，而且在严重脱水期间海藻糖和磷脂的直接结合正是 保持机体完整性的重要原因。“玻璃( 糖浆) 态 假说：在干燥条件下生物活性物质就会被 海藻糖紧紧地包住，形成一种在结构上与玻璃态的冰相似的碳水化合物玻璃体。在这种玻 璃体结构中，分子运动和分子变性反应非常微弱，从而使生物活性物质维持原有的空间结 构。c o l a c o 等发现，海藻糖与生物大分子形成一种类似水晶状的玻璃体结构，从而有效 r 第一章前言 的保护酵母避免冷冻伤害，是玻璃态假说的有力证据。g o t t f r i c d 等【5 l 】发现，由于在机体蛋 白质周围形成玻璃态物质，使得整个系统( 包括机体蛋白质和玻璃态物质) 的粘度增大，系 统中的所有物理、化学反应速度减缓，进而保护了机体蛋白质的活性，硼酸盐和多糖可以 增加海藻糖玻璃念物质的稳定性。杨小民等发现，海藻糖的羟基与酶分子以氢键的形式结 合，能够提高酶的热变性温度，增加酶的热稳定性：另一方面，海藻糖分子包裹在酶分子 周围，或填充了酶分子的空间结构内部的空隙，并形成玻璃态物质，从而固定了酶蛋白的 空间结构，从而避免了酶的失活。目前，这两种假说还不能完全解释现有的实验现象。例 如，海藻糖与葡萄糖对保护限制性内切酶的稳定性有显著差别，这是与“水替代”假说不 相符的；玻璃态假说也有一些不能解释的问题，例如海藻糖对保护生物免遭高温伤害也非 常有效，但在高温下海藻糖无法形成玻璃态物质。因此，海藻糖保护酵母细胞的机理仍需 继续深入的研究【1 7 】。 1 3 1 2 海藻糖分解酶与面包酵母的耐冷冻性 面包酵母海藻糖分解代谢由两类海藻糖酶( t r e h a l a s e ) 调控，中性海藻糖酶( n t h ，由n t h l 和n t h 2 基因编码) 和酸性海藻糖酶( a t h ，o d a t h l 基因编码) 。在面包酵母中，中性海藻糖酶 ( n t h ) 存在于细胞质中，可以被蛋白激酶的磷酸化作用所调控，所以又称为调节型海藻糖 酶。葡萄糖和蔗糖能够迅速激活海藻糖分解途径，其他糖类如麦芽糖也可以在一定程度上 开启或关闭该途径。酸性海藻糖酶( a t h ) ，由于其不被蛋白激酶的磷酸化作用所调节，又 称为非调节型海藻糖酶。b e l t r a n 5 2 l 等报道，中性海藻糖酶n t h l 缺失突变株( z s n t h l ) f l l n t h l 与n t h 2 双缺失突变株( a n t h l 和n t h 2 ) 仍然能利用胞内海藻糖，虽然胞内海藻糖的消耗速度 减缓，当进一步缺失酸性海藻糖酶( a a t h l ) 后，胞内海藻糖就无法消耗，暗示了酸性海藻糖 酶( a t h ) 也可以参与胞内海藻糖的代谢【3 i l 。 k i m 等人认为在不同的突变株里，海藻糖的积累模式是不同的。在可酵糖性培养基上， z l a t h l 菌株胞内积累了2 倍于z s n t h l 和亲本的海藻糖。在y p 一2 0 葡萄糖培养基上，亲本和 z 3 n t h l 较早的由对数期进入稳定期，而z 1 a t h l 和z i n t h l 和a t h l 仍可继续保持l o h 的对数生长。 o 第一章前言 厶嘲腴速积累海藻糖l 匕z s n t h l 和亲本维持较长的时间，且总量也高。a n t h l 在海藻糖积累 和生物量方面与亲本区别不大。因此k i m 等人认为实验条件下，敲除酸性海藻糖基因对酵 母海藻糖积累和抗逆性提高比敲除中性海藻糖更有效 4 6 1 。 s h i m a 等以商用面包酵母为亲本，通过基因缺失方法，获得了海藻糖酶突变株( z s n t h l a t h l ，z 全n t h l ，z s a t h l ) ，所有突变株的海藻糖降解得到抑制，在稳定期后期均可积累2 倍于 亲本的海藻糖，耐冷冻能力明显优于亲本，而且产气力也得到提高，尤其是厶n t h l 菌株。 但z s n t h l 和a t h l 突变株在海藻糖积累上并没有明显的优势，且海藻糖的积累和酵母的遗传背 景有关系【2 8 l 。 1 3 1 3 外界条件与海藻糖含量 细胞体内海藻糖的含量是由合成和分解来调节平衡的，这种平衡随着生长周期、营养 和环境条件而发生变化。s i a u g h t e r 报道【4 7 1 ，对数生长期的面包酵母胞内海藻糖含量很低， 而从对数期生长至稳定期，由于其胞内的6 一酸海藻糖合成酶的活性的增加，胞内海藻糖 可增加5 0 倍。a n i t a 等人认为【船1 ，培养基内的碳源和氮源的缺乏均可引起海藻糖的大量积累， 而氮源则真正控制着海藻糖的降解。培养基中的碳源的改变，如麦芽糖代替葡萄糖后也能 够影响海藻糖的积累。酿酒酵母中海藻糖的积累还依赖于它的生长温度。适宜的环境温度 不利于酵母细胞海藻糖的积累，而较高温度( 非致死温度) 则刺激了磷酸海藻糖合成酶活性 的增加，海藻糖快速积累，并随后保持在一个高的水平，以此抵抗外界高温危害。此外其 他一些因素影响海藻糖的积累，如面包酵母的培养基中含l 2 的n a c l 时，有利于胞内海 藻糖的积累：质量浓度为1 8 甘露醇( 酵母不利用) 可使6 一p 一海藻糖合成酶活性增加两倍； 增加通氧量有利于海藻糖积累，也有人认为厌氧状态有利于积累。 1 3 2 氨基酸对面包酵母耐冻性的影晌 同本t e r a o 和高木等人报道，在面包酵母菌株的冷冻一解冻过程中，某些带电荷的氨基 酸可作为细胞保护剂，尤其是精氨酸，脯氨酸和谷氨酸可以提高酵母的耐冷冻性。s u m r a d a 等发现，由基因c a r i 所编码的精氨酸酶参与了酵母胞内精氨酸的第1 步降解，此酶催化l 1 0 第一章前言 一精氨酸成为l 一鸟氨酸和尿素【4 9 】。s h i m a 等以工业面包酵母t 1 1 8 ( 双倍体) 为亲本，构建了 精氨酸酶缺失突变株c a il8 ( 双倍体) ，并发现突变株c a iig 能在胞内积累大量精氨酸或谷氨 酸盐，而且该菌的冷冻面团发酵力大大增加，说明基因c a r l 的缺失能增加面包酵母的耐冷 冻能力。t a k a g i 等获得l 株l 一脯氨酸类似物抗性突变株，该突变株能积累较高含量的胞内 l 一脯氨酸，同时也表现出较高的耐冷冻性能。他们建立了此突变株的基因文库，通过将 突变文库转化野生型菌株( 不能利用l 一脯氨酸) ，发现突变位点位于编码谷氨酰胺激酶 ( l u t a m y lk i n a s e ) 的p r 0 1 基因，野生型基因的1 5 4 b p 处的a s p ( g a c ) 被a s n ( a a c ) 所替换，从 而使谷氨酰胺激酶和谷氨酰胺磷酸盐还原酶( g l u t a m y lp h o s p h a t er e d u c t a s e ) 的活性增加，这 两种酶在酵母胞内形成一个复合体，共同催化从l 一谷氨酸盐形成l 一脯氨酸的最初两步 【2 7 l o 1 3 3 胞内甘油对面包酵母耐冻性的影响 外源甘油是一种细胞保护剂，因此经常被用作酶的保护剂以及细胞的冷藏保护液。 m y e r s 报道，胞内甘油的增加可以延长压榨酵母产品货架期。h i r a s a w a 和i z a w a 认为，胞内 甘油在冷冻耐受性中起到的重要的作用，甘油培养基有利于生长酵母胞内甘油的富集。近 年来对面包酵t 覃( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 胞内甘油的代谢研究较为透彻( 图l 1 ) ，并在对 甘油代谢的研究的基础上，选育了许多耐冷冻面包酵母菌株【1 8 】。 g l u c o s c 、t = g 犬、j 气矛、，。 静舔喈u p 删o j y & l 强r o l d h 隧a 0 寥。o 矛 。 o l y e e 黼r o l i ， 浅滏 ( g 耥c y ! y p t l 图i i 面包酵f f 莹( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) p 抱甘油的代谢研究 第一章前言 甘油一3 一磷酸脱氢酶( g p d h ) 和甘油- - 3 - - 磷酸酯酶( g 3 p a s e ) 是面包酵母中重要的甘 油合成酶，分别由基因g p d l 和g p d 2 与基因g p p l 和g p p 2 编码。甘油一3 一磷酸脱氢酶突变株 妇砒电舭) 由于基因g p d l 和g p d 2 的缺失，导致甘油合成途径的关闭和甘油无法合成，对 于冷冻表现的比野生型菌株更加敏感。 面包酵母中甘油的降解是通过甘油脱氢酶( g d h ) 进行的，面包酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 卒少包括4 种编码甘油脱氢酶( g d h ) 能j 基因，分别是a r a l ，g c y l ，g r e 3 和y p r l 。 i z a w a 等构建甘油脱氢酶敲除突变株( a r a l ag c y l ag r e 3 ay p r l a ) ，发现甘油脱氢酶( g d h ) 功 能的破坏有利于胞内甘油的积累，且细胞耐冻性能的增强，从而增加了此突变株在冷冻面 团中的发酵力。胞内甘油的积累对面包品质包括风味、颜色和质地都无影响。但是酵母甘 油在胞内的积累需要碱性环境和亚硫酸钠的诱导，在面团的酸性环境下无法积累甘油【2 7 2 8 1 o 1 3 4 胞内固醇磷脂比例对面包酵母耐冻性的影响 生物细胞膜的相变温度的高低和构成细胞膜的脂肪酸不饱和程度密切相关，即生物膜 带有的不饱和脂肪酸越多，相变温度越低。以面包酵母为代表的啤酒酵母，构成细胞膜的 主要不饱和脂肪酸是棕榈酸和油酸，像亚油酸那样含2 个以上双键的不饱和脂肪酸含量极 少。松村等人将不饱和脂肪酸生成酶基因转移到面包酵母中，改变构成细胞膜不饱和脂肪 酸比例，可以提高其耐冷冻性。m u r a k a m i 等研究了冷冻面团中面包酵母不同脂肪成分与耐 冷冻能力的关系。研究结果表明，面包酵母的总脂含量，包括中性脂肪、游离脂肪酸、固 醇和磷脂，大约在0 2 3 0 - 0 3 2 2 m g m g ( 蛋白) 。作为酵母中的主要磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙 酰胺、磷脂酰丝氨酸的含量在冷冻敏感株和冷冻抗性株之间没有明显差别，即磷脂的成分 比例并不影响酵母的耐冷冻性能。但固醇与磷脂的摩尔比对酵母的耐冷冻性能有较大的影 响，冷冻敏感株的固醇磷脂摩尔比比耐冻菌株的要高许多。这是因为固醇与磷脂的比例影 响酵母细胞质膜的流动性，从而反映了面包酵母的耐冷冻i 生能的差异口6 】。 1 3 5 冰晶核基因的表达对面包酵母耐冻性的影响 1 2 第一章前言 h w a n g 等在f i t t i 蠹t e r w i n i ah e r b i c o l a 中分离到大小为3 6k b 冰晶成核基n ( i n a ) ，将其转化 到酿酒酵母中获得i n a 表达转化子，称为i n a ( + ) 菌株，该基因在g a l l ( 半乳糖启动子) 的调控 下进行表达。与野生型酵母菌株相比，转化子i n a ( + ) 的冰晶核形成能力增加，包含细胞的 小水滴的冻结温度从一1 3 上升到一6 。i n a ( + ) 菌株的生长温度需要低于2 5 ，i m 基 因才能表达，而且温度在5 - - 2 0 之间的交替转换可以诱导i n a ( + ) 菌株的冰晶成核活性增 强，当在5 下被诱导大约1 2 h ，i n a ( + ) 菌株达到最大的冰晶成核活性。虽然i n a ( + ) 菌株的 耐冷冻性能有所提高，但该菌株需要低温进行诱导才能达到预期效果，因此并不能应用于 冷冻面团的生产。外源甘油是一种细胞保护剂，因此经常被用作酶的保护剂以及细胞的冷 藏保护液。m y e r s 报道，胞内甘油的增加可以延长压榨酵母产品货架期。h i r a s a w a 和i z a w a 认为，胞内甘油在冷冻耐受性中起到的重要的作用，甘油培养基有利于生长酵母胞内甘油 的富集【2 4 1 。 1 4 面包酵母的低糖适应性 面粉的主要组成部分是淀粉。不加糖面团中的可发酵性糖主要是淀粉经过a 一和p 一 淀粉酶作用水解产生的麦芽糖。当a 一淀粉酶和p 一淀粉酶同时对淀粉起水解作用时，a 一 淀粉酶在淀粉的分子内部进行水解，而p 一淀粉酶则从非还原末端开始。a 一淀粉酶作用于 面粉中的损伤淀粉使之变成小分子糊精，因此产生更多新的末端，便于p 一淀粉酶作用。 糊精分解的最终产物主要是麦芽糖和少量葡萄糖。淀粉酶将淀粉转化成麦芽糖，连同面粉 中含有的少量麦芽糖，在酵母分泌的麦芽糖酶的作用下，被分解成两分子的葡萄糖。麦芽 糖必须被吸收到酵母体内后刃能被麦芽糖酶分解。酵母利用麦芽糖的酶类是诱导酶，只有 当葡萄糖含量低于0 1 时才能合成。在酿酒酵母中，与麦芽糖利用有关的酶类是a d 一 葡萄糖苷酶( 麦芽糖酶) 和麦芽糖透性酶。在不存在葡萄糖苷酶时，少数几个麦芽糖分子通 过一种非专门的运输机制进入细胞，然后诱导麦芽糖酶和麦芽糖透性酶的合成，从而进一 步使麦芽糖快速进入细胞。麦芽糖在细胞内水解为两个葡萄糖分子而被利用。酶产生出现 的迟滞期将影响酵母的发酵速度。因此在无糖面团中，淀粉是经两步水解才最后生成葡萄 1 1 第一章前言 糖而被发酵的。由于过程复杂，所需时间较长，这是无糖主食面包发酵时间长的主要原因。 一般来讲，面团发酵中，麦芽糖迟于葡萄糖被利用。对于麦芽糖适应性的面包酵母， 在麦芽糖与葡萄糖共存时先利用葡萄糖，而麦芽糖到发酵后期才被利用。而对于麦芽糖适 应性好的面包酵母，在麦芽糖和葡萄糖同时存在下可较快地利用麦芽糖，因此在无糖面团 中起发速度较快。 按照l e s a f f r e 公司研究人员的意见，可将酵母菌株划分为“q u i c k 和“s l o w 两种类 型。按其定义，“q u i c k 型菌株在不含糖的面团中有良好的产气能力，而在甜面团中活力 降低：“s l o w ”型菌株在甜面团中活力较高，而在不含糖的面团中活力较低。因此，有些酵 母的耐糖性很低，适合制作低糖的主食面包；有些酵母的耐糖性很高，适合制作高糖的点 心面包【3 2 l 。 1 5 选题的目的及研究内容 自上世纪7 0 年代以来，由于抗冻性面包酵母商业化生产的实现，促进了冷冻面团技 术的发展和应用。我国传统的发酵面制品如包子和西方的面包只宜鲜食，不宣保藏，会造 成面包生产规模小、成本高采用冷冻面团技术便可解决这一问题。它是将面团制作和烘 烤或蒸制两个环节分离，工厂只需生产出面团并冷冻即可，快餐店、面包坊，甚至消费者 个人可将冷冻面团冷冻保藏，随时烘烤、蒸制。使用冷冻面团既可扩大发酵面制品工厂生 产规模、降低成本、提高质量，又极大地方便了消费者。将冷冻面团技术应用到我国传统 的发酵面制品生产，使我国该领域生产逐步实现规范化，提高现有产品的档次和品质，使 产品即能保持产原有风味又方便。 目前国内没有低糖耐冻面包酵母产品，而我国的传统发酵面制品和欧美式样的主食面 包都是无糖或是低糖制品，因此具有优良品质的耐冻性低糖面包酵母有很广阔的发展前 景。 本文的研究内容主要有以下几个方面： ( 1 ) 低糖适应性耐冻面包酵母的筛选及性能测定。采用低温诱导法及低糖平板筛选出 1 4 第一章前言 性能良好的低糖适应性耐冻面包酵母，并对已筛选出的低糖适应性耐冻面包酵母在冷冻后 的发酵力、存活率，麦芽糖酶活力、耐糖性各方面性能进行测定。 ( 2 ) 酵母细胞构成的测定。对低糖适应性耐冻酵母的细胞构成成分即胞内海藻糖含量， 氨基酸组成和脂质组成进行了分析并与普通酵母进行比较，进而了解其对酵母耐冻性的影 响。 ( 3 ) 低糖适应性耐冻酵母面包制作的应用实验。 第二章低糖适应性耐冻酵母的筛选及性能测定 第二章低糖适应性耐冻酵母的筛选和性能测定 2 1引言 目前国内有关低糖适应性耐冻面包酵母方面的研究很少，大都有关高糖型面包的相关 性能的研究，而我国的面食如馒头、包子等都是无糖或低糖类的面制品。我国的传统面食