（食品科学专业论文）Rhodococcus+equi+42胆固醇氧化酶的发酵、纯化及初步应用.pdf

中困农业人学坝l ：学位论殳 摘要 摘要 胆川醇氧化酶( e c l 1 3 6 ) 在食，铺加j ：、医疗检测、生物抗虫等方面的作用日益受到人们 的重视，并且显示出巨大的应删潜力。胆同醇氧化酶可以用来降解食品原料中的胆i 剞醇，牛产 低j j 日川醇的健康食t 铺：在医疗检测中用作 缸清胆醇含量的检测试剂；生物抗虫方面作为b t 毒蛋自最主要的补充，对鞘翅目昆虫有强烈的毒杀作用。为此本课题从以r 四个方而对马红球 凶4 2 ( r h o d o c o c c u se q u i4 - 2 ) 发酵产生的胞内胆同醇氧化酶进行初步的研究，以期对实践应用 提供理论依据：胆【刮醇氧化酶的发酵产酶规律及发酵条件优化；胞内酶提取条件研究、部分纯 化以及粗酶的基本特性分析；腱同醇氧化酶住食品加1 及生物抗虫方面的应用；急性毒理。试 验等。 r h o d o c o c c u s e q u i4 - 2 菌株的生长及产酶规律以7 2 h 为一个周期。氮源单因素试验证明，胰 蛋白胨是产f | ! = l 同醇氧化酶的最佳氮源。正交实验结果得到最佳配方为胆吲醇2g l ，t w e e n8 0 lm l l ，什油不添加。二元二次正交同归组合试验得到的最佳参数为胆嘲醇2 1 9 2g l ，t w e e n8 0 4 8 6 8m l l ，酶活力预测值为6 1 0u l 。验证试验结果证明酶活力最人值可达到6 2 1u l ，增k 率为1 4 1 。 l o m m o l l 磷酸钾缓冲液( p h 7 5 ) + 0 5 t r i t o nx 1 0 0 的提取液对胞内h a 同醇氧化酶的提 取效果最佳，提取时间为1 0 m i n 。不禽有t r i t o nx 1 0 0 的极性溶液的提取效果较差，0 9 n a c l 年p h 7 5 磷酸钾缓冲液相对而言具有稍好的提取效果。酶活力测定体系中含有1 t r i t o n x 一1 0 0 时显色最深，红色均匀且稳定持久，酶活力最高。 酶蛋白中存在有含量相当高的糖组分，糖含量为3 7 6 3 m g m l ，蛋白含量为1 1 0 6 m g m l t 者之比为3 4 ：1 。酶促反应的最适p h 7 5 ，酶活力稳定范围p h 5 0 - 1 0 0 。粗酶的热稳定性良好 4 0 及4 0 。c 以下酶活力保持不变。 r h o d o c o c c u se q u i4 - 2 苗体细胞对鸡蛋黄中胆i 剐醇的降解率为4 9 2 6 ，胞内酶提取液为 4 0 9 2 ，上清液为3 7 0 5 。杀虫试验表明饲喂1 5 天时棉铃虫的死亡率分别是：胞内酶试验组 1 0 0 ，菌悬液组6 6 7 ，上清液组4 0 0 。 胞内酶提取液的经口半数致死晕l d 5 0 人于2 1 5 0 0 m g k g ，属于无毒级别。活菌制剂在细胞 数在1 7 2 1 0 9 个m l 剂量以r 不会引起急性毒性反应。 笑键词：月日州醇氧化酶，咆内酶，提取，纯化，理化特性，麻川，急性毒理 a b s t r a c t t h e s i g n i f i c a n tf u n c t i o n so fc h o l e s t e r o lo x i d a s ei nf o o dp r o c e s s i n g ，m e d i c a la s s a ya n db i o l o g i c a l p e s t 。r e s i s t a n c ew e r er e c o g n i z e dg r a d u a l l ya n ds h o w e dm o r ea n dm o r ep o t e n t i a l i nt h i sp a p e r , f o u r t o p i c s w e r e i n v e s t i g a t e d ：( 1 ) t h eo p t i m i z a t i o n o f t h ec u l t u r e m e d i a ：( 2 ) t h ec o m p a r i s o n so fd i f f e r e n t e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sa n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d s ，a n di n v e s t i g a t i o n so fs o m ep h y s i c a lp r o p e r t i e so ft h e e x t r a c t e d e n d o e n z y m e ；( 3 ) p r i m a r ya p p l i c a t i o n si nf o o dp r o c e s s i n ga n dp e s t - r e s i s t a n c e ；( 4 ) t h ea c u t e t o x i c i t yt e s to ft h ee n d o e n z y m ea n dt h em i c r o b ec e l l s t h e p e r i o d so fc e l lg r o w t ho re n d o e n z y m ep r o d u c t i o nw e r e7 2h o u m b e s tn i t r o g e ns o u r c ew a s p r o v e dt ob et r y p t o n e t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i aw a s2 9 lc h o l e s t e r 0 1 1 m l lt w e e n8 0w i t h o u t g l y c e r o l ，d e t e r m i n e db yo r t h o g o n a la r r a y f u r t h e ro r t h o g o n a lr e g r e s s i o ne x p e r i m e n ts h o w e dt h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n sa s2 1 9 2 9 lc h o l e s t e r o la n d4 8 6 8 m l lt w e e n8 0 a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yw a s p r e d i c t e dt ob e6 1 0u lw i t hah i g l li n c r e a s i n gr a t eo f1 4 1 t h ep o t a s s i u mp h o s p h a t eb u f f e r c o n t a i n i n g0 5 t r i t o nx 一1 0 0c o u l de f f i c i e n t l y e x t r a c tt h e e n d o e n z y m ef r o mw i t h i nt h ec e l l s ，a n dt h eo p e r a t i o nt i m ew a s1 0m i n u t e sp r o p e r l y ，t h ee x t r a c t i o n e f f e c t so fs o d i u mc h l o r i d es o l u t i o na n dp h o s p h a t eb u f f e rw i t h o u tt r i t o nx - 1 0 0w e r em u c hw o r s et h a n p h o s p h a t eb u f f e rc o n t a i n i n gt r i t o nx 一1 0 0 t h ee n z y m ea s s a ys y s t e mc o n t a i n i n gl t r i t o nx 一1 0 0 s h o w e dt h eb e s tc o l o ro fr e dw i t hf i n es t a b i l i t ya n dt h eh i g h e s te n z y m e a c t i v i t y t h ee n z y m ep r o t e i nc o n t a i n e dh i g hl e v e lo fs a c c h a r i d e ，t h ep r o p o r t i o no fs a c c h a r i d ea n dp r o t e i n w a s3 4 ：1 t h eo p t i m a lp hf o re n z y m er e a c t i o nw a s7 5 a n dt h ee n z y m er e m a i n e ds t a b l ew i t h i n p h 5 0t o1 0 0 t h ee n z y m e h a de x c e l l e n tt h e r m a ls t a b i l i t yl o w e rt h a n4 0 c t h em i c r o b ec e l l s ，e n d o e n z y m ea n dt h ec u l t u r es u p e m a t a n tc o u l da l ld e c r e a s et h ea m o u n t so f c h o l e s t e r o li ne g g y o l k ，t h ed e c r e a s i n gr a t ew e r e4 9 2 6 ，4 0 9 2 a n d3 7 ，0 5 r e s p e c t i v e l y t h e ya l s o s h o w e dh i g hp e s t - r e s i s t a n ta c t i v i t y , a n dc o u l ds t r o n g l yi n h i b i tt h eg r o w t ho ft h ec o t t o nb o l lw o i t n s a f t e r1 5d a y sf e e d i n gt h ef a t a l i t yr a t ew e r e1 0 0 6 6 。7 a n d4 0 o r e s p e c t i v e l y t h ee n d o e n z y m ew a sc l a s s i f i e da sn ot o x i c i t yw i t ht h em e d i a nl e t h a ld o s e ( l d s 0 ) h i g h e rt h a n 2 1 5 0 0 m g k g ，m o r e o v e r ，t h em i c r o b e c e l l sh a d n tb e g o t t e nt h ea c u t et o x i ce f f e c t so ft h eb i o m a s sl o w e r t h a n1 7 2 1 0 9 c f u m l ， k e r w o r d s ：c h o l e s t e r o lo x i d a s e ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，p h y s i c a lp r o p e r t i e s ，a p p l i c a t i o n ，a c u t et o x i c i t y i l 独创性声明 y 6 598 0 6 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：喜甫 时间： a 。0 4年f 月z h 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体卜 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：毒诗时间：。斗 年月博日 导师躲遣琏 帆一仁年钒珀 t 陶农业火学顺l 学位论史 第一章绪论 1 1 研究目的和意义 1 1 1 胆固醇的存在与分布 第一章绪论 甾类或类嘲醇类化合物( s t e r i o d s ) 多少不等的广泛存在于生物界。它们的功能多种多样：作 为激素，对代谢起调宵作用；作为乳化剂，有助j _ 脂类物质的消化和吸收；还具有抗炎症作川等。 其中的一人类称为同醇类( s t e r o l s ，甾醇类) 化合物，其特点是在甾核的第三位 ：有个羟基， 在第t ，r 七位上有一个分支的碳氯链。植物中不含有胭网醇，只有豆周醇( s f i g m a s t e r 0 1 ) 、谷俐醇 ( s i t o s t e r 0 1 ) 等，1 i 能被动物吸收利州。胆固醇只存在于动物体内，是脊椎动物细胞的重要成分， 在神经组织和肾上腺中含量相当丰富，它约占脑的例形物质的1 7 。人体内发现的胆t i ，儿乎全 都是由胆吲醇构成。肝、。t 4 - 1 1 表皮组织中含量也相当多。其结构如图1 - 1 所示： 动物能吸收利用食物中的胆同酵，也能自身合成。其生理功能与生物膜的透性、神经髓鞘的 绝缘物质以及动物细胞对某种毒素的保护作用有一定的关系。尽管胆同醇对动物和人类的生存是 必需的，但是过多却有害。近几十年来，冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病已成为威胁人类 健康的常见病、多发病，。i 各种疾病死亡率之首。国内外人量研究资料表明，膳食冈素与一0 脑血 管疚病的发生密切相关，过多的食川脂肪和胆吲醇含量高的食物，容易诱发上述疾病。控制和减 少膳食中腑嗣醇的摄入量，对降低血清胆同醇水平，预防心脑血管疾病至关重要”j 。 胆同醇降解代谢的第一步就是胆捌醇的氧化，在自然界中通常由胆同醇氧化酶来催化该反麻 进行。胆醇在胆同醇氧化酶的催化f ，生成胆甾4 一烯- 3 酮( c h o l e s t - 4 一e l l - 3 - o i l e ) 和过氧化氢 ( h 2 0 ：) 。整个反应由两步完成，第一步是胆固醇的氧化过程。月日固醇与等摩尔的0 2 在胆i 司醇氧 化酶的作h jr ，将3 何上的羟基氧化生成羰基，即中间产物5 胆甾烯一3 一酮，同时脱f 氢。，0 ：生 成过氧化氢；第二步是中间产物5 - 胆甾烯3 酮继续在c o d 的作用下发生异构化，将5 位上的烯 烃烈键异构成4 位r 的烯烃双键，生成终产物4 胆甾烯一3 - 酮。反应的机理如图1 - 1 所示。 4 ：疹 ，；、，k 一。 。，、! 。r ”、r 7 ，、“ | 、 ，“ ，一二t 、 图1 - 1 胆固醇氧化酶的作用机理 f i g1 一lm e c h a n i s mo f c h o l e s t e r o lo x i d a s ea c t i o n 压 中圈农业人学坝1 ：学位论文 第一章绪论 胴周醇氧化酶( c h o l e s t e r o lo x i d a s e ，c o d ) 是一种能由产酶微生物产生，并分泌到胞外 【e x t r a c e l l u l a r ) ，或仍留在胞内( c e l l l i n k e d ) ，或结合在细胞膜( m e m b r a n e b o u n d ) 上的日j 氧化弗 降解胆吲醇的微生物酶。 h 2 0 2 ，4 - 氨基氨替比林( 4 - a m i n o a n t i p y r i n e ) 与苯酚( p h e n 0 1 ) 在过氧化物酶( h p o d ) 的俄 化r 生成醌距胺类早红色的化台物( q u i n o n e i m i n ed y e ) 。反应的机理如图1 2 所示。酶活力的检 测体系就是根据这个原理设计的。 羔 戈。t 州1 弋哪 图卜2 酶活力检测反应原理 f i g1 - 2m e c h a n i s mo f c l l z y m ea c f i v i l yd e l e r m i n i n g s y s l e m 0 自从f l e g g 2 1 利r i c h m o n d i ”1 于1 9 7 3 年第一次阐述了用c o d 来分析检测血清中胆同醇的含量 以来，c o d 已逐渐成为临床诊断中使州最为广泛的酶制剂。这主要是由于酶分析法操作十分简 便，特异性强，灵敏度高，比传统的l i e b e r m a n n b u r c h a r d 分析法具有突出的优越性。这种新型 的酶分析法可以为患者提供简便的一次性试剂盒，方便的检测自己血清中的胆固醇水平。 1 12 胆固醇氧化酶的微生物来源广泛 月日固醇氧化酶的微生物来源十分广泛，很多种属的微生物都有利用胆固醇的能力，可产生胞 内胆同醇氧化酶( 以a 表示) 或是可分泌的胞外胆固醇氧化酶( 以b 表示) ，并将胆固醇降解为 多种不同的产物。目前已知的产生苗有f 列几种： a r t h r o b a c t e r ( 节杆菌) s 。i m 7 9 5 1 ( 1 9 8 8 ，a b ) j i m p l e xi n d u c t h i em u t a n tu s a 1 8 【b j ( 1 9 8 8 ，b ) s i m p l e xc o n s t i t u t i v em u t a n tu s 3 0 1 1 【6 j ( 1 9 8 8 ，b ) a c t i n o m y c e s ( 放线菌) l a v e n d u l a et ? - s ( 1 9 7 9 ，a ) b a s i d i o m y c e t e s ( 担子菌) f e 月r 抽“se d d d p sf e r m p5 7 7 6 【9 】 b r e v i b a c t e r i u m ( 短杆曲) s 把r 。，f c “mf 1 d - ”】 2 ( 1 9 8 4 年专利) ( 1 9 7 3 ，b ，一f a d ) ! ! s ! 目_ g ! ! ! 自! ! ! ! ! ! ! s ! ! ! ! ! ! ! s ! ! ! ! ! ! ! 自!：= ： s t e r o l i c u mn o v s p a t c c2 1 3 8 7 【j 2 ( 2 0 0 2 ，新型c o d ) b a c i l l u s ( 芽孢杆菌) s u b “l i ss f f3 4 1 3 j c o r y n e b a c t e r i u m ( 棒状杆莳) c h o l e s t e r o l i c u m 1 4 1 m y c o b a c t e r i u m ( 分支杆菌) 1 1 5 , 1 6 1 n o c a r d i a ( 诺卡氏曲) e r y t h r o p o l i s 【1 7 1 1 8 l ( 与r h o d o c d c c “se w t h r o p o l i s 是相同的种属) r h o d o c h r o u sn c i b1 0 5 5 4 1 1 9 。州( 与rr h o d o c h r o m s 是相同的种届) p s e u d o m o n a s( 假单胞菌) t e s t e r o n i f l u o r e s c e n s s p s t - 2 0 0 【2 5 】 s p ，c o x 6 2 91 2 6 , 2 7 1 r h o d o c o c c u s ( 红球菌) e q u i a t c c - 3 3 7 0 1 f 2 q e q u ia t c c 3 3 7 0 6 1 2 9 1 p q u i n o 2 3 3 0 1 s p g k i ( c i p1 0 53 3 5 ) 1 3 1 】 s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e ( 裂褶菌) 3 2 , 3 3 1 s t r e p t o m y c e s ( 链霉菌) 打口d i n p t c c1 1 2 1 3 4 1 l i v i d a n v l d l a 5 c e h j1 3 5 - 3 7 s p b a 0 0 5 3 s l s t r e p t o v e r t i c i l l i u m ( 链轮丝菌) c h o l e s t e r o l i e “m 【3 9 】 ( 滓：f a d 表示酶的活性中心以一f a d 为辅基) ( 2 0 0 2 ，b ) ( 1 9 7 7 ) ( 1 9 4 9 ，1 9 9 5 ，a ) ( 1 9 7 3 ，a b ) ( 1 9 7 6 ，a ) ( 1 9 9 8 ，b ) ( 1 9 8 9 ) ( 1 9 9 1 ， ( 1 9 9 1 ， ( 1 9 8 9 ， ( 1 9 9 2 ， ( 1 9 7 9 ， b ) a h ) b ) a b ) b d ) ( 2 0 0 1 ，b ) ( 1 9 9 0 ) ( 1 9 8 2 ，啪) 胆同髀氧化酶的来源广泛，主要来自于各种野生型菌株，通过限制性培养基的筛选，可以得 到符合要求的菌株。限制性培养基咀胆i 司醇( c h o l e s t e r o l ，略作c h o ) 或者c h o 与其他结构类似物， 如谷尚醇( s i t o s t e r 0 1 ) 、且同醇( s t i g m a s t e r 0 1 ) 等相混台，作为唯一的碳源和能源，以诱导菌株产 生c o d i j ”。还有些c o d 来亡j 丁突变型菌株。l i u w h ( 1 9 8 8 ) 等人试验发现，a r t h r o b a c t e rs i m p l e x 菌株的诱变型突变体u s a 1 8 和组成型突变体u s 3 0 1 1 在一定条件f 也产生c o d ，而且纯化后 的c o d 的理化特性和催化特性与其他已报道的c o d 基本相同 6 1 。鉴y - c o d 在临床诊断中曰益 碌现出的重要性，t a k a r as ( 1 9 8 4 ) 等人进行了i ：业化尝试，他们使用标准生产菌株b a m d i o m y c e t e s l e n t i n u se d o d e s f e r m p 5 7 7 6 发酵生产胆闱醇氧化酶，并改进了相应的提纯1 艺，于1 9 8 4 年获得 美国擘利。 3 中国农业人学硕i j 学位论艾 第一章绪论 近年米人们对c o d 的研究又有了新发现，f u j i s h i r o ( 2 0 0 2 ) 等人从b r e v i b a c t e r i u ms t e r m & 啪 f i o v s p a t c c 2 1 3 8 7 中发现一种新的c o d ，经试验证明，它的分子特性和催化特性都与以往发现 的c o d 显著不同，突出表现在它对c h o 的高度亲和力上( k m = 3 0u m ) ，这是首次在b r e v i b a c t e r i “m s t e r o l i c u mn o v s p a t c c 2 1 3 8 7 中发现的新型c o d ，因此被命名为c o di i 。 胆嘲醇氧化酶的来源十分广泛，尤其是n o c a r d i a 、s t r e p t o m y c e s 和p s e u d o m d h 口5 产生的c o d ， 现已在临脒诊断中广泛应用于测定人鹿清胆i 古1 醇含量。不同来源的胆同醇氧化酶的催化反应效率 不同，与底物亲和能力最强的是n o c a r d i a 来源的胆【古| 醇氧化酶k m 为5 1 4 um ；而v m a x 最人 的是s t r e p t o m y c e s 来源的酶，为1 5 8um m i n m g 。而且这三种酶在反应体系中的稳定时间也不相 同：s t r e p t o m y c e s 来源的酶最稳定，稳定期为1 0 周；n o c a r d i a 来源的酶稳定期为8 周，p s e u d o m o n a s 来渊的酶最不稳定，稳定期只有6 周。综合比较起来，s t r e p t o m y c e s 来源的酶性能稳定，在临床 麻h j 中表现良好，弗且生产成本最低，货架划最长，所以是现今工业化生产中最主要的检测试剂 牛产原料【“i 。 然而市售的c o d 价格依然相对较高，主要是因为自然状态下微生物的酶产量很低，无法满 足人们的需要。因此人们一方碗继续培养驯化高产菌株，另一方面运用基因r 程方法，克隆和表 达不同来源的c o d 基因，以期得到稳定高产的基因上程菌，以满足商业应用i l ”j 。 1 13 胆固醇氧化酶的基本特性 胆固醇氧化酶( e c1 1 3 6 ) 的基本生理生化特性如表1 - 1 所示【“。 表1 1 胆固醇氧化酶的基本特性 t a b 1 - 1p h y s i c a lp r o p e r t i e so f s o m ec h o l e s t e r o lo x i d a s e s 【i | ：表可以看出，h 日圃醇氧化酶具有以f4 个基本特性： ( 1 ) 胆同醇氧化酶通常是一1 氐分子量蛋白 ( 2 ) 胆i 古| 醇氧化酶稳定的p h 范围较宽，发挥活性的最适p h 一般为7 0 7 5 ( 3 ) 胆l 吉1 醇氧化酶比较耐高温 ( 4 ) 胆l 矧醇氧化酶的等电点趋势为p l 8 o 目前发现的各种微生物来源的胆固醇氧化酶均为单体，以黄素腺嘌呤_ 二核甘酸( f a d ) 为辅 基，接受电子进入氧化磷酸化途径并提供微生物细胞所需的能鼙，有些胆围醇氧化酶需要金属离 ，作为辅基。该酶存在3 个活性中心：底物结合活性中心，决定酶与底物的亲和能力：氧化活性 4 中心，催化胆吲醇的氧化；异构化活性中心，催化中问产物异构化为终产物。甾短杆菌 ( b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m ) 来源的胆( 枷尊氧化酶经x 一射线晶体结构衍射分析，参见圈1 - 3 ，结 果可以证明以上假说i ”。 胆吲醇儿乎不溶丁水，但溶于氯仿、苯酚，乙醇、异肉醇等有机溶剂，这些溶剂也对i e ! 浏醇 氧化酶的催化反应速率有影响。其中苯酚、甲苯、二甲苯、丙笨等能有效的提高链霉菌、假单孢 杆菌、诺 氏菌来源的胆嘲醇氧化酶的催化速率，氯仿则降低所有来源的酶的催化速率( n o r i y u k i d 等，1 9 9 8 ) 。另外，低浓度的非离子去垢剂t r i t o nx 1 0 0 能显著提高多种来源的酶的活性。 图卜3 胆固醇氧化酶的空间结构示意图( 黑点为f a d 辅基) f i g1 - 3 a n i l l u s t r a t i o no f c o ds h o w i n g t h es e c o n d a r y p r o t e i ns t r u c t u r ee l e m e n t s 1 1 4 胆固醇氧化酶的主要用途 人体内胆阃醇代谢和1 输送的异常往往与动脉粥样硬化相关，能够引起心肌梗死、中风、动脉 瘤利胆结i i 等疾病。胆吲醇的些代酣产物如类甾醇和类甾烷酮有致癌作州，因此，检测血浆和 食物中的胴同醇含鼙在临床上具有重要意义。目前通常使用的方法是将胭嗣醇氧化酶、胆圃醇脂 酶和过氧化氢酶复合在起，或将这三种酶固定在膜上，做成复合酶电极，作为血浆总胆同醇的 检测试剂”“。 另外，直接添加胆固醇氧化酶可以降低食品中的胆矧醇含量，或者将胆固醇氧化酶基因克隆 钊某些发酵生产菌株中，在发酵生产过稗中同时降低食品中的胆同醇含量；胆| 古1 醇氧化酶还可以 抑制某些昆虫的生k ，将胆同醇氧化酶基田克隆到植物中，可以选育出抗虫植物新品种。 中国农业人学硕l j 学位论文 第一章绪论 胆咧醇氧化酶还可咀作为体外生成类醇激素前体物的催化物。皮质类嘲醇激素是类在 c 2 0 钉酮基、c 2 l 有羰基、含2 1 个碳原r 的四烯三酮类固醇，性激素中的睾酮、孕酮也是一类四 烯三酮”“。在体外合成这些类剧醇激素，可通过目日周醇氧化酶氧化朋同醇生成四烯三酮而进一步 合成。 1 1 5 降低食品中胆固醇的方法 降低体内血清胆固醇水平，可以从药物治疗、改变饮食结构、以及降低食品本身胆固醇含量 等儿方面米考虑。前者为跃学界所关注，后者为食品加1 技术人员和营养学家所关心。 从食晶本身来看主要通过改变食品原料和生产加工方法来实现。目前已有多种方法可供选 择 5 6 - 5 9 】，主要包括有机溶剂提取、超临界流体提取、b 环糊精包埋、多糖沉淀、蒸汽捉馏法、分 子蒸馏法等。但是以上方法都存在有各自的缺陷操作复杂、对设备要求高、成本高昂等。于是 生物降解法逐渐成为近年来的研究热点。生物降解法主要是利用微生物或酶来降解胆同醇。微生 物法操作粗放，产物成分复杂，对人体健康的影响不易控制；酶法降解效率较高，产物相对单一， 主要的困难在于高纯度的酶很难获得。 近年来又相继出现了生产低胆圃醇食品的新方法，诸如改善种猪、肉鸡的饲料中各种营养成 分的比例或者在日粮中添加可降解胆固醇的有益微生物等。这些方法更加简便易行，从源头上 降低了食品原料中的胆固醇含量，解决问题更加彻底，研究重点转入了动物营养的合理和优化。 由此可见，由各个学科方向的专家齐心协力，从各个层面同时努力，彻底解决降低食品月日固醇含 量的难题指日可待。 1 16 胆固醇氧化酶的杀虫机理 棉铃象甲( a n t h o n o m u sg r a n d i s ) 是危害美国棉花生产的一种重要害虫，1 9 世纪从墨西哥传 入美囤德克萨斯。由丁l 它的生活史非常特殊，常用的化学杀虫剂很难有效的控制。棉铃象甲的成 虫主要以花粉为食物，雌性成虫将卵产在棉蕾中，一个花蕾中产一个卵，一只雌性成虫一生可产 约3 0 0 枚卵。幼虫在棉蕾中发育，以棉蕾内的植物组织为食物，因而造成落蕾。使用化学农药防 治时，它们因有铃壳的保护而不受伤害。化蛹后成虫从脱落的棉蕾中钻出来并开始一个新的世代a 在环境条件适宜的年份，一个生长季它们可以繁殖7 8 代。棉铃象甲对b t 毒蛋白不敏感，因而转 b t 毒蛋白基网的抗虫棉对它的防治效果不理想。 胆蚓醇氧化酶是近儿年才发现的一种抗虫蛋白质，它对敏感害虫鞘翅目的棉铃象甲的毒 杀能力与早期发现的b t 毒蛋白相当，对鳞翅目的一些害虫如划蚜夜蛾等也有较强的抑制生k 发 育的作用。因为它的毒杀能力强，杀虫谱又与现在广。泛使用的b t 毒蛋白具有一定的互补性，所 以被认为是继舭毒蛋向之后第二代杀虫蛋白的代表之。 h 日同醇氧化酶毒杀棉铃象甲的幼虫，并不是冈为胆固醇氧化酶降解了植物组织中的甾醇，使 幼虫缺乏可供吸收的甾醇引起的，也不是因为植株中含有甾醇降解产物而使幼虫中毒。直接饲喂 预先经月旦阎醇氧化酶处理，而后使酶失活的饲料并不能使幼虫表现中毒症状，说明毒性来自于有 活性的胆同醇氧化酶【6 9 】。光学显微镜观察j 食川了胆同醇氧化酶的棉铃象甲幼虫中肠，发现低剂 6 中田农业入学碗i 学位论文 第一章绪论 茸饲喂的幼虫中肠上皮细胞层受损，高剂最饲喂的幼虫中肠上皮细胞崩解，伴随幼虫死亡的发生。 此现象与舭毒蛋白饲喂敏感害虫后中肠纹缘膜受损的情况类似。 胆吲醇氧化酶可以氧化某些生物膜上的胆同醇，由磷脂、解崮醇利蚩白质组成的生物膜决定 了这种氧化作心的可行性。膜t 的胆l 越醇被氧化后，膜的结构会发生一些变化，从而使膜的功能 受到影响。饲喂胆固醇氧化酶的棉铃象甲幼虫中肠上皮细胞崩解，可能是因为膜上的月日固醇被氧 化，细胞的通透性增加，细胞内物质外溢从而使细胞裂解。所有昆虫中肠上皮细胞膜的结构都相 似，均由磷脂、胆【刮醇和蚩白质二种主要成分构成，胆固醇氧化酶为什么易f 与棉铃象甲幼虫中 肠膜上的胆固醇作崩而不易与直翅日、同翅目等皑虫的中肠膜作_ 【f ；i ? 是否昆虫中肠道的酸碱环 境影响酶的作用范围? 是否除了降解膜j 二的胆固醇以外，酶与膜之间还存在别的作用方式? 这些 都是深入研究胆同醇氧化酶杀虫机理有待解决的问题。 1 1 ，7 本研究的目的意义 随着人们对健康的呼声越来越高，高血清且日崮醇带来的危害也逐渐被人们接受。由此带来一 场关于生产低胆固醇食品的革命。许多营养价值很高的动物性食品因其胆同醇含量较高，令人望 而却步。为，获得营养价值高而胆固醇含量低的食品，人们采用了很多方法来解决这一矛盾。本 试验的目的即是在不影响食品原有的色、香、味、营养成分，无任何毒副作崩的前提下，对高胆 吲醇食品进行生物转化，使其低胆i 古l 醇化，低脂化，从而满足人”j 的健康需求。 本试验在前人的基础上加以改进和发展，放弃研究含量极低，活力不高的分泌型胞外酶，转 而将焦点集中于胞内酶上。虽然胞内酶的分离纯化有相当的难度，但是它的活力远远高于胞外酶， 极具应用潜力。如果在食品加工过程中对酶制剂的纯度要求不是很高，那么直接使用粗酶制剂是 可行的。升且粗酶的提取操作简单、成本低廉，是很好的食品加t 生产辅料。 将粗酶直接麻用于食品加工带来的另一个重要问题就是酶的安全性问题。由于本试验使用的 rp f4 2 是偶蹄兽的条件致病菌，有很强的病原性，因此有必要对其安全毒理作用进行深入的 到f 究。条竹允许的话，应该继续进行亚慢性、慢性毒理学，以及致癌、致畸和致突变研究。 本试验对粗酶液进行了棉铃虫杀虫试验，结果证明了马红球菌r , e q u i4 2 有很高的抗虫活性， 这将为棉铃虫的生物防治提供有力的理论依据。 1 2 国内外研究现状 121 胆固醇氧化酶的各种提纯方法 一般说来，月日固醇氧化酶的提取和纯化过程基本上与其他的酶蛋白相似，但是对于不同微生 物来源的酶。具体步骤稍有差别。 胆l 司醇氧化酶的提取技术的选择主要取决于酶的分泌特i 生，也就是说，首先商确定该酶是膜 结合酶( m e m b r a n e b o u n de n z y m e ) 或胞内酶( c e l l 1 i n k e de n z y m e ，e n d o e n z y m e ) 还是分泌出米的 胞外酶( e x t r a c e i i u l a re n z y m e ) 。胞外酶的提取相对简单一些，酶分泌到培养液中t 通常只需离心 除太茁体细胞，就可以得到一定量有活性的粗酶。而提取膜绌台酶就比较困难，必须先经过细胞 7 ! ! ! s 目| ! ! ! ! ! e ! ! ! ! ! 目e ! ! ! ! ! s ! ! ! ! ! 目! ! ! ! s ! ! ! ! ! ! ! ! ! 自备 ： 裂解将酶从细胞壁内部释放出来。有许多方法可以实现细胞裂解，r i c h m o n d 【1 7 | 最早使用机械破碎 法执n o c a r d i as p 中提取c o d 。早期的机械破碎法常使h ；j 高压均质法和球磨挤压法。通常这些方 法不能有效的释放膜结合酶，同时还会引入更多的杂蛋白，以及多种其他物质的污染。另一个重 要的缺点是释放m 大鼍的核酸，网而在提纯目标酶蛋白z 前需要增加额外的纯化步骤，使纯化过 科更加复杂。 针对膜结合酶，近年来的研究热点集中在以非离子表面活性剂为基础的双水相提取系统上。 a l b e r t s s o nf 1 9 7 1 年【4 ”首次提了液一液分离的坝水相体系。这种方法最大的优点是两相中水的 含鼙都很高，确保不稳定的生物人分子的变性减小到最低程度。 酶从生物材料中提取出来后接着进行纯化操作。由丁c o d 在提取介质中通常只占很小的比 例，尤其是膜结合酶，所以纯化的第一步就是尽可能多的去除其他杂蛋f = i ，第二步即是浓缩目标 蛋白。 1 2 2 双水相提取( a q u e o u st w o p h a s es y s t e m ) 技术 以非离子表面活性剂为基础的烈水相提取法( n o n i o n i cs u r f a c t a n t b a s e d a q u e o u st w o p h a s e s y s t e m ) 是近年来蓬勃兴起的一种新颖的提纯方法，j “泛应用于提纯各种生物大分子，在蛋自质、 核酸、多糖、多肽的纯化中取得了令人满意的效果。该法由a l b e r t s s o n 于1 9 7 1 年首次提出【4 6 i ， 随后箨国研究人员都对此进行了深入的研究。印度的g u p t a ( 1 9 9 9 ) p “，德国的k u l a ( 1 9 9 3 ) 【4 “， 瑞典的s i v a r s ( 2 0 0 0 ) 1 4 9 】对般水相体系的流变学特性、相行为以及提取机理进行了研究。k u l a 将 该体系应用于c o d 的提纯，取得了一系列成果，从1 9 9 1 年开始连续发表文章 2 4 , 4 8 , 5 0 , 5 1 5 2 , 5 3 ，最 终实现了t 业化连续生产。同时进一步探讨了表面活性剂的回收与循环利用，使该方法日臻完善， 实现了从实验室到工业化生产的飞跃。 菲离子型表面活性剂【4 9 l ，例如t r i t o n 系列( p o l y o x y e t h y l e n ea l k y lp h e n o l s ，对叔辛基苯基聚 己二醇醚) c m e o n 系列( a l k y lp o l y o x y e t h y l e n ee t h e r s ，聚氧乙烯脂肪醇) ，t w e e n 系列 ( p o l y o x y e t h y l e n es o r b i t o le s t e r s ，聚氧乙烯山梨醇酯) ，以及a l k v l g l u c o s i d e s ( 烃基配糖物) 与亲 水性聚合物，如p e g ( 聚乙二醇) 或d e x t r a n ( 葡聚糖) ，在较低的温和的温度下形成双水相体系。 随着温度升高，当到达某一临界温度时，双水相体系发生浑浊，进而发生两相分离，溶解_ 其中 的亲水性不同的物质即发生重新分配。发生相分离的温度范围称为浊点。应用相图和热动力学模 型可以清楚的研究两相行为。膜蛋白，例如噬菌调理素( b a c t e r i o r h o d o p s i n ) 和c o d ，经分离进 入表丽活性剂胶团相。而亲水蛋白，如b s a 和溶菌酶，则进入聚台物相中。膜蛋闩的分离主要 取决】= _ _ 表面活性剂与膜蛋白之间的非特异性疏水相互作用力。两相间的表面活性剂浓度著越大， 进入胶团相的膜蛋白就越多；聚合物的分子量越小，胶团的尺寸就越大。亲水蛋白的分离主要取 决丁体积排阻效应，也就是说，相内组分的尺寸( 体积) 越人，亲水蛋 1 越倾向于进入对立的相 中。体系中离子型表面活性剂的添加只能轻微的改变膜蛋向的分离，但强烈影响亲水蛋白，因此 可川来提高膜蛋白与亲水蛋白的分离效果。 k u l a 和m i n u t h 等人深入研究r 这种双水相体系，使用怍离子表面活性剂c 1 2 e 0 5 ( p e n t a e t h y l e n eg l y c o lm o n on d o d e c y le t h e r ) 直接济解羊提驳膜结合硝c o d ，原料为未经任何澄 清处理的n o c n r d i ar h o d o c h r o u s 菌株的发酵豫液。同叫还探讨了最住操作条件表面活性剂的浓 8 中国农业大学烦i ：学位论文 第一章绪论 度和生物量的关系，以及某些化学试剂的添加对蛋白质的溶解性和稳定性的影响。试验表叫，9 0 以上的酶蛋向被提取进入胶团相。这说明使i _ 该方法，可以实现一步澄清、预浓缩( 浓缩至4 倍) 和酶蛋白的部分纯化( 纯化至5 倍) 。 尽管上述方法对c o d 的提纯非常有效，但是所使用的聚氧乙烯脂肪醇表面活性剂，如 c 1 2 e 0 5 ，c 1 2 e 0 6 ( h e x a e t h y l e n eg l y c o lm o n on - d o d e c ：e t h e r ) 雨ic 1 4 e 0 6 ( h e x a m e t h y l e n eg l y c o lm o n o n t e t r a d e c y le t h e r ) 的价格十分昂贵，不适于大规模生产p 4 i 。因此k u l a 和m i n u t h 继续寻找价格低 廉的介质p “，考察了以氧乙烯基团窄分布的聚氧乙烯表面活性剂混合物( c 。2 e 0 5 c 1 4 e 0 6 ， c 1 4 e 毡c 1 4 e 0 6 ，c 1 2 - 1 s e 0 5 ) 为基础的双水相浊点提取系统，得到了较好的提取率且降低了成本。 同时还选h = | 工业级纯度的表面活性剂混合物( d e h y d o ll s 4 ，d e h y d o