（发育生物学专业论文）激活前后热激对猪孤雌胚胎早期发育的影响.pdf

摘要 曼曼曼曼曼鼍曼i 一 一m 。 。一。 ml m i 一 u o 曼曼量曼量曼! 曼! 曼! 曼曼曼皇曼曼! 曼! ! 曼曼曼曼 摘要 哺乳动物的卵母细胞和早期胚胎对环境条件的改变较为敏感，而相对于其他物种来说 猪卵母细胞和早期胚胎对温度更为敏感。为探讨高温对猪卵母细胞和早期胚胎发育的影响 和机理，本次实验对体外成熟卵母细胞分别在孤雌激活前或孤雌激活后进行4 2 持续2 小 时或4 小时的热激，以孤雌胚胎的卵裂率、发育到囊胚的比例、诱导型热激蛋白7 0 ( h s p 7 0 ) 的表达与分布以及第二次减数分裂纺锤体微管的形态和分布为指标综合地研究了热激对猪 孤雌胚胎植入前发育的影响。 实验结果如下： 1 ) 孤雌激活前2 小时热激组的卵裂率( 9 3 1 4 士2 3 0 ) 显著( p ，o 0 5 ) 高于4 小时热激组 ( 8 1 4 3 士5 4 3 ) ，囊胚率( 4 1 3 6 + 2 2 7 ) 显著( p 0 0 5 ) 高于对照组( 3 0 8 7 + 3 3 8 ) 和4 小时热激 组( 3 0 3 7 士3 5 2 ) 。三组囊胚平均细胞数差异不显著( 3 5 8 7 + 3 9 9v s 4 0 2 5 + 3 0 5 v s 3 7 8 4 + 3 0 3 ) 。孤雌激活后热激组卵裂率、囊胚率与对照组相比均无显著差异，4 小时热激 组的囊胚平均细胞数( 2 6 6 8 + 3 4 0 ) 显著( 尸 0 0 5 ) 少于对照组( 3 7 5 1 + 2 3 3 ) 。 2 ) 激活前热激，对照组和热激组h s p 7 0 表达水平无显著差异：激活后热激，2 小时 热激组h s p 7 0 表达水平显著低于4 小时热激组，对照组和4 小时热激组h s p 7 0 表达水平 无显著差异。 3 ) 激活前热激实验中，对照组和熟激组卵母细胞内h s p 7 0 呈点状均匀分布，与染色 体区无相关性；激活后热激，对照组和热激组染色体区均出现h s p 7 0 聚集现象，且随着热 激时间的加长，聚集现象更为明显。 4 ) 激活前热激导致微管紊乱和部分解聚；激活后热激也导致微管紊乱和部分解聚，纺 锤体微管长轴与两组染色体的连线偏离，染色体分布分散。 结果表明：猪成熟卵母细胞在激活前和激活后对热激的反应性不同，胞质内h s p 7 0 的 分布模式也不同。热激导致h s p 7 0 表达量的改变与孤雌胚胎植入前的发育能力无直接联 系。热激造成猪卵母细胞孤雌胚胎纺锤体微管的紊乱和解聚，但这种不利作用不影响猪孤 雌胚胎的植入前发育。猪孤雌胚胎对热激表现出一定的抗性。 关键词：热激；卵母细胞；孤雌胚胎；h s p 7 0 ；猪 v i i a b s t r a c t _ 一一一一一i i 鼍皇! ! 曼苎曼鼍皇曼曼曼皇曼! ! ! 曼皇曼! ! ! 曼! ! 曼! 曼曼! 皇 e f f e c to fh e a ts h o c kh a p p e n e dbe f o r eo ra f t e r a c t i v a t i o no ni nv i t r od e v e l o p m e n to fp o r c i n e p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o s a b s t r a c t t h em a m m a l i a no o c y t e sa n de m b r y o sa r es e n s i t i v et oe n v i r o n m e n tf a t o r s p o r c i n eo o c y t e s a n de m b r y o sa r em o r es e n s i t i v et h a nt h eo t h e rs p e c i e s t oa s s e s st h ee f f e c ta n dm e c h a n i s mo f h i g ht e m p e r a t u r eo np o r c i n ei nv i t r om a t u r e d ( i v m ) o o c y t e sa n dp a r t h e n o g e n e t i c ( p a ) e m b r y o s ， p o r c i n em a t u r e do o c y t e sw e r et r e a t e db e f o r eo ra f t e ra c t i v a t i o nw i t hat e m p e r a t u r eo f4 2 1 2f o r 2 h 4 h ，t h ec l e a v a g er a t ea n dt h eb l a s t o c y s tr a t eo fp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o ，t h ee x p r e s s i o na n d d i s t r i b u t i o no fi n d u c i b l eh e a ts h o c kp r o t e i n7 0 ( h s p 7 0 ) a n dt h em o r p h o l o g i c a lc h a n g eo ft u b u l i n w e r es t u d i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 ) t h ec l e a v a g er a t eo f2 h h b a ( h e a ts h o c kb e f o r ea c t i v a t i o n ) g r o u pa r es i g n i f i c a n t ( p 0 0 5 ) h i g h e rt h a n4 h h b ag r o u p ( 9 3 14 4 - 5 14 v s81 4 3 4 - 12 15 ) ；t h eb l a s t o c y s tr a t eo f2 h h b a g r o u p ( 41 3 6 4 - 5 0 9 ) a r es i g n i f i c a n t ( p 0 0 5 ) h i g h e rt h a nb o t ht h ec o n t r o l ( 3 0 8 7 4 - 7 5 5 ) a n d 4 h h b a g r o u p ( 3 0 3 7 4 - 7 8 6 ) ；t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei na v e r a g eb l a s t o c y s tc e l ln u m b e r b e t w e e n3g r o u p s t h e r ea r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nc l e a v a g er a t ea n db l a s t o c y s tr a t e b e t w e e nc o n t r o lg r o u pa n dt r e a t e dg r o u p sa f t e ra c t i v a t i o ne x c e p tt h ea v e r a g eb l a s t o c y s tc e l l n u m b e ro f4 h h a a ( h e a ta f t e ra c t i v a t i o n ) g r o u pi s s i g n i f i c a n tl o w e r ( p 0 0 5 ) t h a nc o n t r o l g r o u p ( 2 6 6 8 4 - 7 5 9v s3 7 51 4 - 5 2 2 ) 2 ) t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nc o n t r o la n dt r e a t e dg r o u p si nt h ea m o u n to fh s p 7 0 b e f o r ea c t i v a t i o nw h i l et h ea m o u n to fh s p 7 0i n2 h h a ai ss i g n i f i c a n tl o w e rt h a n4 h h a ag r o u p a f t e ra c t i v a t i o n b u tt h eh s p 7 0e x p r e s s i o nl e v e la r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e t w e e nt h e c o n t r o lg r o u pa n d4 h h a a g r o u p 3 ) t h eh s p 7 0p r o t e i ni su b i q u i t o u s l yd i s t r i b u t e di nt h eo o p l a s ma n ds h o wn oa s s o c i a t i o n w i t hn u c l e a rw i t h w i t h o u th e a ts h o c kb e f o r ea c t i v a t i o nw h i l et h eh s p 7 0p r o t e i nc o n c e n t r a t ei n t h en u c l e a rr e g i o nw i t h w i t h o u th e a ts h o c ka f t e ra c t i v a t i o na n db e c a m em o r eo b v i o u sa f t e r4 ho f h e a ts h o c k 4 ) h e a ts h o c kr e s u l t si nt u b u l i nd e g e n e r a t i o ni no o c y t e s e m b r y o sa n da f f e c tt h ef o r m a t i o no f m e i o t i cs p i n d l ea n dd i s t r i b u t i o no fc h r o m o s o m e sa f t e ra c t i v a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a t ： 1 ) t h ee f f e c t so fh e a ts h o c ko nt h ep o r c i n ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o sp r e i m p l a n t a t i o n d e v e l o p m e n ta n dh s p 7 0d i s t r u b u t i o na r ed i f f e r e n tw h e nh e a ts h o c kh a p p e n e db e f o r eo ra f t e r a c t i v a t i o n 东北农业大学理学硕十学位论文 2 ) t h e r ei sn od i r e c t l ya s s o c i a t i o nb e t w e e nt h eh s p 7 0e x p r e s s i o na n dt h ep r e i m p l a n t a t i o n d e v e l o p m e n tc o m p e t e n c eo fp ae m b r y o s 3 ) s p i n d l em i c r o t u b eo ft h es e c o n dm e i o s i sd i s o r d e ro rp a r t i a l l yd e g e n e r a t ea f t e rh e a ts h o c k b u tt h e nv i t r op r e i m p l a n t a t i o nd e v e l o p m e n tc o m p e t e n c eo fp ae m b r y oi sn o ta f f e c t e d 4 ) p ae m b r y oi sr e s i s t a n tt oh e a ts h o c k k e y w o r d s ：h e a ts h o c k ；o o c y t e ；p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o ；h s p 7 0 ；p o r e i n e x c a n d i d a t e ：z h e n gz h o n g s p e c i a l i t y ：d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f l i uz h o n g h u a 研究生学位论文独创声明和版权使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含未获得 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期易万年月必日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) v 拥 沁 咖 帕苫p汐 础州 咖 吵 引言 ) m - - _mmmmm ! 曼曼曼曼曼曼皇曼皇曼鼍曼皇皇量皇曼皇曼皇曼曼曼曼 i 引言 高温是造成热带和亚热带地区夏季家畜受精率和妊娠率低的主要原因。牛的受精率和 胚胎存活率在炎热季节较凉爽季节低( h a n s e ne ta 1 ，2 0 0 1 ；m o n t ye ta 1 ，1 9 8 7 ) ，妊娠率从 凉爽季节的5 0 5 5 降低到炎热季节的1 0 2 0 ( b a d i n g ae ta 1 ，l9 8 5 ) 。相对于其他种类细 胞，卵母细胞的生长、成熟和早期胚胎发育过程中发生剧烈而复杂的结构和生化变化，涉 及到细胞内容物的大量积累、细胞的快速分裂、基因表达的关闭和开启等环节，因而对热 激表现出更高的敏感性和复杂性。之前相关的研究主要集中在牛和小鼠等物种上，猪上的 相关研究较少而且存在一定争议。相对于其他哺乳动物的卵母细胞和早期胚胎，猪卵母细 胞早期胚胎对温度更为敏感，在卵巢运输、卵母细胞和胚胎体外操作和培养的过程中，过 高或过低的环境温度都会造成其发育能力大大降低。猪卵母细胞早期胚胎中含的大量脂滴 可能是其对温度较为敏感的原因之一，但确切机制仍不明。 1 1 热激蛋白的简介 1 1 1 热激蛋白的发现和相关概念 热激蛋白最初是在果蝇中发现的。早在1 9 3 5 年，科学家就观察) u 】b n 热果蝇的蛹可诱导 发育缺陷型。1 9 6 2 年遗传学家r i t o s s a 等研究果蝇唾液腺染色体时发现，正常果蝇幼虫的 唾液腺中有多线染色体，它比一般染色体粗1 0 0 0 - 2 0 0 0 倍，在光镜下就可看见染色体。将 2 5 培养的果蝇幼虫无意间置入3 0 - - 一3 2 的环境中，3 0 分钟后在其巨大的唾液腺染色体上 发现了3 个新的膨突。进一步观察认为，热激诱导的果蝇染色体膨突现象不存在组织和发 育期的差异，其膨突的生成与该区带基因的转录加强有关，提示热激时可能有某种蛋白合 成的增加。人们将这种现象称为热激反应或热激应答( h e a ts h o c kr e s p o n s e ，h s r ) 。1 9 7 4 年t i s s i e r e s 等采用s d s p a g e 方法，从热激果蝇幼虫的唾液、脑和马尔皮基氏管中分离得 到6 种新的蛋白峰，而有些蛋白峰却比未应激的幼虫要少( t i s s i e r e se ta 1 ，1 9 7 4 ) 。t i s s i e r e s 认为温度的增高抑制了部分正常的蛋白合成，同时激发染色体内基因转录合成一组特殊 的蛋白质，这种特殊的蛋白质称为h s p 。7 0 年代以后人们相继报道，不仅鸟类及哺乳动物 也存在环境升高诱导h s p ，而且这一现象亦存在于大肠杆菌和回膜虫属中。1 9 8 2 年a d e m s 等用类似的方法也证实，一切生物细胞( 包括原核细胞和真核细胞) ，温度增高时均可合成 一类具有生物学活性及其多种生理功能的蛋白质( a d a m se ta 1 ，19 8 2 ) 。不仅如此，其他 因素刺激，如氧化磷酸化解联剂、重金属( 汞、铜) 、氨基酸类似物( 刀豆氨酸) 、抗菌素( 嘌 呤霉素) 、紫外线照射、饥锇、缺血或缺氧、创伤、感染、肿瘤等也同样可以诱导类似蛋白 质的产生，故又称这类蛋白质为应激蛋e t ( s t r e s s p r o t e i n ，s p ) 。确切地说，热激反应不仅表 现了它对物种的普遍性，而且对不同的应激条件也具有反应的相似性，广义而言，各种刺 激因子引起的这种热激反应现象称为应激反应( s t r e s s r e s p o n s e ，s r ) 。为区别其他蛋白质， s c h l e s i n g e r 等认为h s p 必须具备以下条件：其合成条件需环境因素刺激，尤其是温度升高 几度时；该基因的5 端非编码区有一段1 4 碱基对组成的保守序歹i j ( p e l h a m 盒) ，作为 h s p 2 m r n a 转录的启动子( 又称热激因子) ( s c h l e s i n g e re ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 1 1 2 热激蛋白的分类 人们应用分子生物学技术例如双向凝胶电泳、荧光x 线照相、分子杂交等方法已检测 到的h s p s 至少有4 3 种以上。有人根据其分子量、等电点将h s p s 分成5 大家族( b u c k i o v a 东北农业大学理学硕七学位论文 e t a l 。1 9 9 5 ) ： 1 ) 小分子量h s p s 家族：包括h s p l 9 、h s p 2 2 a 、h s p 2 2 b 、h s p 2 3 、h s p 2 5 、h s p 2 6 、 h s p 2 7 、h s p 2 8 及h s p 3 2 。在应激条件下，这些小分子h s p s 的合成都有不同程度的增加， 其表达与胚胎、组织、细胞的生长和分化关系较密切。 2 ) 中等分子量h s p s 家族：这一家族的h s p s 在正常情况下通常很少或不表达。主要 包括定位于线粒体的h s p 6 0 、与胶原有特殊亲和力的h s p 4 7 、与胚胎软骨细胞有关的 h s p 4 3 - 4 5 ( 亦称骨坏死因子，o s t e o n e c t i n ) 和h s p 4 0 。 3 ) h s p 7 0 家族：该家族成员最多，共有2 1 种蛋白质。进化上属高度保守的应激蛋白。 h s p 7 0 具有多种功能，它是目前国外研究最多的一组h s p s ，它与体内体外胚胎生长发育 和畸形发生关系极为密切，也是本文讨论的重点。 4 ) h s p 9 0 家族：主要包括h s p 8 3 、h s p 8 7 、h s p 9 0 、g r p 9 4 ( 内质网素) 和存在于大肠 杆菌中的h t p g 等。h s p 9 0 家族与激素受体、蛋白激酶等关系密切，和h s p 7 0 一样具有分 子伴侣功能。r u t h e r f o r d 等认为这些蛋白质在调节细胞间信号通道的“开”和“关”方面可能发 挥重要作用。 5 ) h s p l1 0 家族：该家族由h s p l 0 4 和h s p i1 0 组成。h s p l 0 4 具有介导非活性蛋白解 聚作用；h s p l1 0 在应激条件下能促进核仁功能的修复。 根据作用和调控方式，h s p s 可分为构成型热激蛋i 兰1 ( c o n s i t i t u t i v eh e a ts h o c kp e o t e i n s h s c s ) 和诱导型热激蛋i 刍( i n d u c i a b l eh e a ts h o c kp r o t e i n s ，h s p s ) 。前者在细胞的正常代谢和生 理条件下表达和发挥作用，后者在机体和细胞受至o , i j 激时表达，能保护细胞内蛋白免受变 性凝集( a n g e t a l 。1 9 9 1 ) ，或促进不利环境或热损伤导致的变性蛋白的功能恢复( p a r s e l l e ta 1 ，1 9 9 3 ) ，从而使细胞产生抗逆性。 1 1 3 热激蛋白的主要生物学特性 热激蛋白的主要分子生物学特性有以下几个( l i n d q u i s t e t a l ，1 9 8 6 ) ： 1 ) 高度保守性：热激蛋白被认为是生物进化最保守的成分，不同种细胞产生的h s p s 分子序列绝大部分相同或类似。如不同来源的真核生物其h s p 7 0 的同源性为6 0 - - - 7 8 ， 但不同族h s p s 之间则无明显序列同源性( 如h s p 6 0 和h s p 7 0 之间) 。 2 ) 非特异性：除热环境以外，其他的物理、化学及生物应激原，如缺血、缺氧、感染、 创伤、重金属离子、氧自由基等均可诱导h s p s 的产生。 3 ) 时间性：生物体或组织受到应激刺激后，需要度过一个绝对恢复期。细胞先在此期 间合成h s p s ，其后才能耐受应激刺激。另外，超出一定期限就失去其保护作用。 4 ) 交叉耐受性：即一种应激刺激诱导细胞产生h s p 7 0 ，不仅使细胞对该刺激的耐受 性增加，也增加了细胞对其他应激原刺激的耐受性。 5 ) 弱的a t p 酶活性：h s p s 可以结合a t p 并使其分解，而获得发挥其作用的能量。 6 ) 模拟性：能以分子模拟宿主自身抗原，兼具迷惑宿主与致病的两重性。 7 ) 双重性：有自身抗原和特异抗原，能引起抗感染免疫及肿瘤防护，又能诱导多种自 身免疫病及感染炎症。 1 2 热激蛋白与胚胎发育 1 2 1 热激蛋白与胚胎正常发育 研究发现，在胚胎生长、分化、发育过程中表达多种热激蛋白。其表达无固定模式， 2 引言 但具有时间顺序性和组织特异性，如h s p 9 0 、h s p 7 3 、h s p 6 0 及h s p 2 7 等在正常胚中都有 表达( c a v e s t a n ye ta 1 ，1 9 8 5 ) 。 1 ) 小分子量h s p s 家族 h s p s 在鼠胚肌组织分化过程中高度表达，随胚胎的发育，表达逐渐增强，具有时间顺 序性。9 1 5 天h s p 2 5 表达于心肌，1 2 1 5 天h s p 表达于颈部肌肉群，1 5 1 5 天所有肌组织中 h s p 2 5 都有较高水平表达( l o o n e se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。h s p 2 7 的表达具有组织特异性，它通过 不同的磷酸化状态以三种主要的异构体形式存在于鼠胚中。如心肌的h s p 2 7 以磷酸化形式 为主，而其它组织中以非磷酸化形式为主。这些小分子量h s p s 的表达与胚胎、组织、细 胞的生长和分化密切相关，如h s p 2 2 、h s p 2 3 与胚胎形态分化有关；h s p 2 5 与心脏肌组织 的发育有关；h s p 2 7 与肌动蛋白细胞骨架的稳定性有关：泛素与核染色质的组蛋白有关： h s p 2 8 磷酸化后可以刺激胚纤维组织细胞生长( m a s u d ae ta 1 1 9 9 8 ) 。 2 ) h s p 6 0 家族 h s p 4 3 4 5 与胚胎软骨细胞的发育有关；h s p 4 7 定位于内质网上，与i v 型胶原特 异结合，做为分子伴侣参与前胶原的生物合成与分泌。在鼠胚发育中，h s p 4 7 主要表达于 中胚层分化而来的组织，如结缔组织、软骨、骨、脊索及体节，也表达于从神经嵴分化而 来的组织。在中枢神经系统，h s p 4 7 位于细胞增殖区，如神经管的腹侧及脉络丝( m a s u d a , h o s o k a w aa n dn a g a t a , 1 9 9 8 ) ；h s p 6 0 s 定位于线粒体，可协助细胞色素等从基质到线粒体 内膜空间的运输。h s p 6 0 s 还参与细胞骨架蛋白如微管蛋白、肌动蛋白的合成( l i ne ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 3 ) h s p 7 0 家族 h s p 7 0 家族是一类最保守、最重要的热激蛋白家族，包括6 8 、7 2 、7 3 、7 5 、7 8 k d 等 多种蛋白。正常细胞表达结构型h s p 7 0 ，应激时含量增高，诱导型h s p 7 0 仅出现于应激细 胞中。h s p 7 0 在植入前的小鼠胚中表达，从卵裂期基因的激活，经过囊胚形成、植入、原 肠胚、神经胚型、器官形成期直到胚胎发育成熟( c a v e s t a n y ，e 1 w i s h ya n df o o t e ，1 9 8 5 ) 。 结构型h s c 7 3 通常在神经管闭合、神经外胚层分化和增殖过程中有较高水平的表达，位于 细胞浆和细胞核内，参与神经元的分化( w a l s he t a l ，1 9 9 7 ) 。 h s p 7 0 参与细胞增殖，在细胞有丝分裂过程中起一定的作用。结构型h s p 7 0 位于星体、 纺锤体及中心体等有丝分裂装置。向鸡胚中加入微量抗h s p 7 0 的抗体，随抗体浓度的增加， 可破坏有丝分裂装置，阻断细胞分裂，干扰细胞分化( s c o n z oe ta 1 。1 9 9 9 ) 。m o r e a u 等也 发现，两栖类动物胚s 期早期细胞的转录活性与h s p 7 0 的核转移有关( m o r e a ue ta 1 1 9 9 8 ) 。 h s p 7 0 家族n 端结构域高度保守，具有a t p 酶活性，a t p a d p 交换位点类似g 肌动 蛋白a t p 酶结构域，协助蛋白质完成细胞内转移。h s p 7 0 与这些蛋白质结合，帮助其穿过 内质网腔或线粒体膜。当细胞内转移完成后，在a t p 参与下，二者解离，从而使这些蛋白 质恢复其功能结构。h s p 7 0 还是一种类固醇激素受体结合蛋白，协助受体发挥作用 ( k i m m i n se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 4 ) h s p 9 0 家族 h s p 9 0 家族主要存在于细胞质中。s p 9 0 1 3 在植入前的小鼠胚中表达，至囊胚发育中 期表达广泛，主要位于中枢神经系统及骨骼形成区。h s p 9 0 1 3 及h s c 7 0 可能参与神经系统 及骨的形态发生( l o o n e s ，r a l l u ，m e z g e ra n dm o r a n g e ，1 9 9 7 ) 。h s p 8 4 和h s p 8 6 在8 1 5 天 小鼠胚表达较高，h s p 8 4 表达于所有组织，而h s p 8 6 在睾丸中表达较高，并局限于生殖细 胞中，推测h s p 8 6 可能在精子发展中起作用( g r u p p ie ta 1 ，1 9 9 1 ) 。h s p 7 0 及h s p 9 0 也参 与了哺乳动物精子细胞的形成过程，精子细胞发生的基因型取决于微管动力学的变化，而 h s p 9 0 在维持信号传导途径及促进微管的形成方面起间接作用( y u ee ta 1 。1 9 9 9 ) 。 h s p 9 0 可以与激素受体结合，也是一种类固醇激素受体结合蛋白。当激素与其受体结 3 东北农业大学理学硕士学位论文 合后，h s p 9 0 即从受体上脱离下来，促使受体从非d n a 状态转变为d n a 结合状态。h s p 9 0 也与多种细胞蛋白相“伴随”，但其作用不依赖a t p ( k i m m i n sa n dm a c r a e 2 0 0 0 ) 。 5 ) h s p l l 0 家族 h a t a y a m a 研究发现，h s p l 0 5 在9 1 l 天小鼠胚表达较高，第1 4 天开始下降。h s p l 0 5 位于鼠胚各种组织细胞的细胞质和细胞核中，h s p l 0 5 在小鼠胚器官发生中起一定作用 ( h a t a y a m ae ta 1 1 9 9 7 ) 。 1 2 2 应激状态下热激蛋白与胚胎发育 1 2 2 1 胚胎保护作用 哺乳动物胚胎在应激条件下诱导合成大量的h s p s ，而其它蛋白的合成暂时停止或减 弱。新合成的h s p s 做为分子伴侣，维持蛋白质的正确空间构象，参与耐热性形成，抑制 细胞凋亡，保护胚胎，抵抗更严重的应激损伤，使胚胎得以存活。 1 ) 分子伴侣作用 分子伴侣是一类互不相关的细胞内蛋白质，能介导其他蛋白质的正确装配，本身并不 参与形成具有功能的最终装配产物。蛋白质在跨膜运输前必须解折叠，跨膜后又需要折叠， 从而形成其功能型空间结构，此过程均需要分子伴侣的参与。分子伴侣具有解折叠酶的功 能，解折叠后便蛋白质的疏水面暴露，分子伴侣识别并与之结合，保护其疏水面，防j 卜蛋 白质相互作用发生凝聚，直至蛋白质的跨膜转运完成( b l a g o s k l o n n ye ta 1 ，2 0 0 1 ) 。高温及 其它一些毒性物质可激活热激基因，诱导合成h s p s ，已知h s p 6 0 、h s p 7 0 、h s p 9 0 、h s p i5 3 0 、h s p l 0 0 等都可做为分子伴侣，在多肽的折叠和跨膜转运方面发挥重要作用。h s p s 可 与热变性蛋白质的疏水面结合，防止其相互结合，促使变性蛋白质恢复，或使不能恢复的 蛋白质降解。 h s p s 还可维持多肽链的伸展状态，协助其跨膜转运。在线粒体、内质网等不同区域内 发挥作用，如线粒体基质中h s p 6 0 以1 4 个单位聚合形式存在，参与h + - a t p 酶f l 的b 亚 单位与其他亚单位之间的组装；内质网中的分子伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白( b i p ) 属于 h s p 7 0 家族，能促进跨膜输入的蛋白质组装及鸟氨酸、转氨甲酰酶的折叠与组装，在维持 蛋白质的生物活性方面起关键作用( m i s k o v i ce ta 1 ，1 9 9 9 ) 。此外，热激蛋白可与类固醇激 素受体结合，称受体相关蛋i 刍( r a p s ) ，主要包括h s p 7 0 s 和h s p 9 0 s 两大家族，调节细胞 间信号通道，维持受体构象稳定，使其与配体特异结合。许多类固醇激素受体如雌激素、 黄体酮等其结构都包括一个激素结合蛋白和两个h s p 9 0 s 。胚胎发育过程中，应激原直接或 间接影响激素信号传递，热激蛋自在此方面起一定的调节作用。总之，h s p 做为分子伴侣 可调节类固醇激素受体、酶、c a s p a s e s 及其它蛋白质的重建。 2 ) 参与胚胎耐热性 当哺乳动物胚受到一个未致死量的热激反应后，对随后的应激刺激具有短暂的抵抗作 用，这一现象称为耐热性或应激耐受。它可以增加胚的存活率，减少细胞死亡，促进生长 发育( m i r k e se ta 1 ，1 9 9 9 ) 。已知多种h s p s 参与胚耐热性的产生，主要为h s p l 0 4 、h s p 7 0 及小分子量h s p 。热耐受的早期主要影响了细胞骨架系统，使肌动蛋白微丝破坏、微管分 解。h s p 2 7 通过调控肌动蛋白的聚合作用，参与耐热性的产生，h s p 2 7 的磷酸化对肌动蛋 白微丝的稳定是必须的。在无应激条件下，未磷酸化的h s p 2 7 结合到肌动蛋白丝的多聚尾 端，从而阻止其发生聚合反应；高温应激条件下。磷酸化h s p 2 7 增多，与肌动蛋白丝多聚 尾的亲和力减弱，h s p 2 7 从微丝多聚尾端解离下来，肌动蛋白单体与未封闭的微丝尾端结 合增强。从而使肌动蛋白微丝在热激反应后的恢复能力增加( m i r k e se t a l ，1 9 9 6 ) 。h s p 7 0 在植入后鼠胚耐热性的诱导方面起直接作用。转基因小鼠耐热性增强，且耐热性的水平与 4 引言 h s p 7 0 的表达水平密切相关( m i r k e s ，c o r n e l ，w i l s o na n dd i l m a n n ，1 9 9 9 ) 。受孕1 0 天鼠胚， 耐热性的诱导产生与消失大约需8 h 时间。鼠胚经4 2 处理后，在不同的时间点检测h s p 7 2 结果显示，l h 后h s p 7 2 m r n a 强烈表达，8 h 后则未检测到。8 h 后检测到h s p 7 2 蛋白，5 h 后鼠胚不再表达h s p 7 2 m r n a 。说明在这一时间点及以后不再合成新的h s p 7 2 ，耐热性与 h s p 7 2 诱导合成的水平密切相关( t h a y e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。耐热性的保护作用大约维持8 h ， 可抵抗更严重的高温和其他致畸刺激，此时h s p 的合成增加，而正常蛋白的合成减少。 3 ) 抑制细胞凋亡 在胚胎发育过程中，通过凋亡可清除对机体没有用的细胞。若细胞凋亡的调节发生改 变则可能引起先天性发育异常。现认为，凋亡是各种细胞毒性物质及致畸原的作用机制之 一。胚结构出现异常之前，细胞往往发生过度凋亡。已知d n a 降解是凋亡的一个重要标 志，鼠胚经4 2 处理后，t u n e l 阳性的凋亡小体数目增多，胚耐热性的诱导产生与d n a 降解的显著减少有关，因此与凋亡的发生有关( m i r k e se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。而耐热性的诱导依 赖于h s p s 的水平，h s p s 的表达对高温、氧化应激等诱导的凋亡有抑制作用。已知许多致 畸原通过激活凋亡途径从而导致胚发育异常，包括激活细胞外标记调控蛋白酶( e r k s ) 、细 胞内应激酶( j n k s ) 及应激激活蛋白酶p 3 8 ( c a v e s t a n ye ta 1 ， 1 9 8 5 ) 。g a b a i 等研究发现， 细胞内h s p 7 2 水平增加，可以抑制应激诱导的j n k 及p 3 8 的激活，减少细胞凋亡；h s p 7 2 还可通过抑制线粒体细胞色素c 的释放，或直接与细胞内细胞色素c 结合，从而阻止 c a s p a s e 的激活，抑制细胞凋亡。h s p 2 7 可阻止由f a s a p o l 2 1 及s t a u r o s p o f i n e 诱导的凋亡。 因此，h s p s 基因家族可能代表了第三类抗凋亡基因家族( b u z z a r de ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 植入前的哺乳动物胚不能诱发热激反应，对各种致畸原高度敏感，胚死亡率及异常率 相当高。囊胚期，热激反应诱导大量h s p s 合成，胚若处于相同应激条件，其死亡率及异 常率明显下降( m i r k e se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 1 2 2 2 胚胎损害作用 o e r m a i n 提出高温致畸的热激效应理论，高温使编码热激蛋白的基因表达加快，而正 常蛋白的表达受抑制，导致胚胎发育异常。受孕1 0 天鼠胚，用3 5 s 2 蛋白氨酸标记， s d s p a g e 分析结果发现，无论是体内还是体外不同高温处理后的鼠胚，l 8 h 后都可观 察到7 0 k d 及9 0 k d 蛋白质合成短时增加。热激蛋白对胚胎有一定的保护作用，但其保护 作用是有一定限度的。当高温的强度或持续时间超过一定限度，可导致胚异常发育甚至死 亡( f i s h e re ta 1 。1 9 9 5 ) 。细胞内h s p 水平增加可以使细胞对凋亡的敏感性增加，应激诱 导的h s p s 不能阻止伴随诱导的凋亡，h s p s 的表达增加及凋亡分别是细胞在应激水平增加 的第一阶段和第二阶段反应。h s p s 在应激诱导损伤的早期阶段有保护作用，一旦触发细胞 凋亡，h s p s 则不具备完全的保护作用。应激诱导h s p s 大量合成，导致胚胎发育异常，是 否也可通过此间接途径，目前尚待研究。 所以，在一定的应激强度范围内，热激蛋白可以保护胚胎，抵抗更强烈的刺激。但当 应激强度超过一定阈值，热激蛋白则干扰胚胎的生长发育，热激蛋白不同家族通过不同的 作用方式调节胚胎发育。 1 3 热激对猪卯母细胞和早期胚胎发育的影响和h s p 7 0 的表达 变化 h s p 7 0 是研究的最多的一种h s p s ，它在许多动物、植物的胚胎中都能表达，且往往 在胚胎的各个发育阶段都表达。在胚胎发育过程中，h s p 7 0 被认为具有分子伴侣、抗凋亡 等多种功能，推动胚胎的发育。这也是我们选择h s p 7 0 作为主要研究对象的原因。 5 东北农业大学理学硕十学位论文 1 3 1 猪卵母细胞生长和成熟过程中h s p 7 0 的表达和对热激的反应 1 3 1 1 卯母细胞生长和成熟过程中h s p 7 0 的含量变化 l a n s k av 等人从猪卵巢表面抽取不同直径的卵泡中的卵母细胞，并按卵母细胞的直径 将其分为3 组，分别检测三种直径的卵母细胞对热激的反应性和h s p 7 0 含量的变化( l a n s k a e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。结果显示：l 、8 0 9 0 1 a m 的卵母细胞自身合成大量h s p 7 0 ，4 3 热激l 小时 后卵母细胞内诱导合成的h s p 7 0 量达到最大值。热激4 小时后，h s p 7 0 含量迅速下降，热 激6 小时候，h s p 7 0 含量又显著上升。2 、1 0 0 1 1 5 1 x m 的卵母细胞热激与否都合成h s p 7 0 ， 热激后h s p 7 0 含量下降，热激后h s p 7 0 的合成并没有因为热激时间的加长而出现改变。3 、 完全生长卵泡中的卵母细胞卵母细胞中储存了大量的h s p 7 0 ，热激后h s p 7 0 大量减少。 实验说明了以下2 个问题：l 、在猪卵母细胞的生长过程中不断积累h s p 7 0 ，到成熟时达 到最大量；2 、较小直径的卵母细胞能被热激诱导而提高h s p 7 0 的表达量，而随着卵母细 胞的生长、直径的加大，这种能被诱导产生h s p7 0 的能力逐渐下降，直到卵母细胞完全 生长时完全缺失。 在卵母细胞的生长过程中表现出很高的蛋白合成活性( h y t t e le ta 1 ，2 0 0 1 ) ，在生长的 卵中没有经过热激就能自身合成热激蛋白，表明h s p 7 0 是随着卵母细胞的生长自发合成 的，高水平的h s p 7 0 可能与新合成蛋白的保护有关，也暗示了h s p 7 0 在卵母细胞中的重 要作用。卵母细胞在生长末期，积累了大量的蛋白，小鼠g v 期卵( l i ue ta 1 ，2 0 0 4 ) 和牛 未成熟卵、成熟卵( e d w a r d se ta 1 ，1 9 9 7 ；e d w a r d se ta 1 ，19 9 6 ；e d w a r d se ta 1 ，19 9 7 ) 都含高水 平诱导型h s p 7 0 ，但此时转录和翻译活动逐渐终止，卵不再合成大量新生蛋白，所以此时 对猪卵母细胞进行热激不但不能诱导合成h s p 7 0 ，反而会消耗h s p 7 0 ，有可能是因参与了 其他蛋白的保护而被消耗。在大鼠中，卵母细胞的热激反应能力也在卵生长期最高，而在 逐渐成熟时降低甚至终止( c u r c ie ta 1 ，1 9 9 1 ) 。这种热激反应阻断现象可能是一种卵子发 生过程中的普遍现象( h e i k k i l ae ta 1 ，1 9 8 5 ) 。 1 3 1 2 卯母细胞生长和成熟过程中进行热激对h s p 7 0 表达和胚胎早期发育的 影响 1 ) g v 期热激对猪卵母细胞和孤雌胚胎发育的影响 将在屠宰过程中遭受体腔内4 1 3 4 2 1 高温热激3 0 分钟后的猪卵巢取出，抽取卵 母细胞进行体外培养，与屠宰时未遭受热激的卵母细胞相比，成熟率无显著影响，但是孤 雌激活后的卵裂率和囊胚率均显著降低。免疫荧光实验显示。热激导致了g v 期卵母细胞 细胞骨架的严重干扰，微管和微丝在热激后减少甚至完全消失，但是m i i 期的纺锤体形成 正常( t o n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 。可能微管和微丝在热激解除后又重新恢复，使得m i i 期纺锤体 形成正常，而没有影响到核成熟。熟激导致g v 期卵母细胞内部分蛋白的变性，h s p 7 0 作 为分子伴侣可能参与了这部分蛋白的修复。蛋白的变性和h s p 7 0 的损耗可能导致了孤雌激 活后卵裂率和囊胚率的降低。 2 ) 成熟时热激对猪卵母细胞h s p 7 0 表达和后期发育的影响 t s e n gjk 等人将体外培养成熟的猪卵母细胞进行4 1 5 c 为期2 小时或4 小时的热激， w e s t e r nb l o t 结果显示，对照组与热激组的h s p 7