（环境工程专业论文）六氯苯好氧降解菌群的筛选及降解特性研究.pdf

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 i 摘摘 要要 六氯苯（hcb）是优先控制污染物的 12 种典型持久性有机污染物（pops)之一， 对人类健康和环境都有严重危害。 目的：目的：目前对 hcb 尚无经济、有效而又适用面广的处理方法，为了探讨 hcb 的生物降解可行性，对有毒且难降解的 hcb 进行生物降解实验。 方法：方法：从长期受 hcb 污染的环境中采用富集及驯化培养筛选出具有降解效果的 好氧菌群，利用四联发酵罐扩大培养该好氧菌群，并基于固定化微生物技术采用发 酵罐模拟强化 sbr 处理系统处理含 hcb 的实际废水。 结果：结果： （1）hcb 好氧降解菌的富集培养。自武汉市某化工厂出水沟中采集在自 然界中已经经历了驯化的表层底泥，选择合适的培养基，富集培养对 hcb 具有良好 降解效果的好氧菌群，经初步鉴定该好氧降解菌主要为 alcaligenes 菌属和 azospirillum 菌属。检测该降解菌群对 hcb 的累积耗氧量，高于其内源呼吸耗氧量。 当培养温度为 30，ph 为 7.0 时，该菌群能在 18 天内将无机盐培养基中浓度为 4.5mg/l 的 hcb 降解 55%以上，降解速率达到 137.5g/(ld)； （2）hcb 降解菌群的 培养。利用发酵罐扩大培养，并对发酵产物进行降解性实验，证明经扩大培养后仍 具有降解活性，降解率达 35以上；(3) 好氧降解菌群的废水降解研究。固定化降 解菌群后，用于强化模拟 sbr 系统处理含 hcb 的废水，结果表明，降解菌群的加 入对于 hcb 的去除有所加强，而且能改善原废水对四膜虫的急性毒性，但对 cod、 氨氮的去除影响较小。 结论：结论： 经筛选的 hcb 好氧降解菌群能够以 hcb 为唯一碳源或能源生长， 对 hcb 的有较好的降解效果，经扩大培养后的发酵产物仍具有降解特性，固定化后的菌剂 能有效该善传统生物处理 hcb 的去除效果。 关键词： 关键词： 六氯苯，好氧生物降解，降解特性，发酵，生物强化技术 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ii abstract hexachlorobenzene (hcb) is one of the typical persistent organic pollutants (pops), which can lead to serious hazards to human health and environment. objective: as the reason of the bioaccumulation, persistence as well as potential toxicity, there is no economic, effective and widely applicable treatment of hcb at present. biodegradable experiment has held to investigate the biodegradability of hcb. method: an aerobic microbial community which was able to grow at the presence of hexachlorobenzene was enriched from sediment from contaminated site. fermenter was use to magnifying culture microbial community and based on immobilized microorganism technique, fermenter would be simulated as strengthening sbr system to treat the actual wastewater with hcb. results: (1) isolation of aerobic microorganisms degrading hcb. two strains of microorganisms which were able to grow at the presence of hcb were isolated from the sludge collected from the drain of a chemical plant in wuhan. the strains showed the capability of degrading hcb efficiently, and they were identified as alcaligenes sp. and azospirillum sp. during the growth of the mixed microorganisms on hcb, the cumulative consumption oxygen amount was detected higher than their endogenous respiration. under the condition of temperature 30, ph 7.0 and the concentration of hcb is 4.5mg/l , the hcb decomposition rate of these bacterial reached 137.5 g(l d)-1. (2) culture of aerobic microbial community degrading hcb. inoculated microorganisms to fermentation tank, after expanded incubating, they still have the biodegradability of hcb, and the degradation rate was more than 35%. (3) degradation of wastewater by aerobic microorganisms. immobilized microorganisms were used to enhance sbr system to treat the wastewater with hcb. the results show that the removal of hcb was efficient by adding the aerobic microorganisms, and also an improvement on the acute toxicity of original wastewater to tetrahymena pyriformis, but cod, ammonia removal was less affected. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 iii conclusion: the results showed that the aerobic microbial community was able to utilize hcb as sole carbon and energy source, and the degradation of hcb was efficient. they still have the biodegradability of hcb even after magnifying cultured, and immobilized microorganisms could improve the traditional biologic treatment to remove hcb. key words: hexachlorobenzene, aerobic biodegradation, biodegradability, fermentation, bioaugmentation technique 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出贡献 的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律 结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。 保密， 在 年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 1 绪论绪论 1.1 研究目的 研究目的 本研究课题来源于环境科学研究所承担的教育部重点科技攻关项目“持久性有 机污染物控制原理研究（104250） ”的部分内容。 六氯苯（hexachlorobenzene，c6cl6，简称 hcb）是优先控制污染物的 12 种典 型持久性有机污染物（pops)之一，对人类健康和环境都有严重危害。目前对 hcb 尚无经济、有效而又适用面广的处理方法，为了探讨 hcb 的生物降解可行性，对 有毒且难降解的 hcb 进行生物降解实验。 从环境中富集培养对 hcb 有降解效果的 好氧降解菌，对其降解特性作初步研究。同时通过扩大培养获得 hcb 好氧降解菌 剂， 并用于含 hcb 的实际废水处理， 为 hcb 菌剂的制备及工程应用提供科学依据。 1.2 研究背景 研究背景 由于具有长期残留性、生物蓄积性、半挥发性高毒性，hcb 已成为全球性的环 境污染物，是 12 种典型 pops （persistent organic pollutants，持久性有机污染物） 之一，在美国和欧盟均名列在优先控制污染物的“黑名单”上1。作为环境内分泌干 扰物，能够导致生物体内分泌紊乱、生殖及免疫机能失调、神经行为和发育紊乱以 及癌症等严重疾病23。历史上最严重的 hcb 中毒事件发生在上个世纪 50 年代的 土耳其，大约有 4000 人在食用了喷洒过除真菌剂 hcb 的小麦后患上了一种类型的 卟啉症，上百人因此丧生。研究环境中 hcb 的降解菌，并寻找去除 hcb 的有效方 法是目前 pops 研究的热点之一。 环境中 hcb 的来源与其使用密切相关， hcb 主要应用在杀虫剂和杀菌剂、 石 墨阳极的处理、军事烟雾、合成橡胶助剂、木材防腐剂、有机合成化工的原料、铝 或其它金属制造过程中的助熔和脱气等方面。carpenter 等4调查发现美国在 20 世 纪 50 年代 hcb 作为杀虫剂的使用量高达 345000kg； 在 60 年代 hcb 的使用量达 到高峰。美国国家环保总局（usepa）曾对部分农药生产过程中 hcb 的释放量进 行估算5，如生产 1 kg 五氯硝基苯会释放出约 500 mg（北美地区）或 1000 mg（北 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 美以外的地区）hcb；生产 1 kg 百菌清会释放出约 40 mg（北美地区）或 100 mg （北美以外的地区）hcb；hcb 进入环境的途径包括含有这些产品的废水、空气以 及废物焚烧产生的烟道气和飞尘的释放。目前全球每年仍有高达 1200092000kg （平均约为 23000 kg） 的 hcb 释放到环境中去。 我国虽禁止了其作为农药的使用， 但仍保留 hcb 的生产，主要是用于生产农药五氯酚、五氯酚钠和其它化工产品。 环境中仍残留大量的 hcb。 由于 hcb 可通过食物链富集，由食物、饮水和空气进入人体，分布于体内所 有组织并对人体产生危害， 七十年代中期联合国环境规划署、 世界卫生组织将 hcb 列为环境监测和生物监测项目1。在国内，环境中仍存在大量的 hcb。蔡全英用 gc/ms 分析技术对我国 11 个城市污泥中的 5 种氯苯化合物进行了研究。hcb 在 所有城市污泥中均被检测到，与国外的城市污泥相比， 我国污泥中 hcb 的含量则 高于国外或与之相当6。 有报道称华东某两个特大城市自来水中检测出的 hcb 浓度 分别为世界卫生组织（who）建议标准的 170 倍和 15 倍7。王子健测定了 13 种 取代苯类污染物在淮河 4 个监测断面水、水体沉积物，鲤鱼（grass carp）中的浓 度，按照 2000 年实施的地表水标准，hcb 严重超标8。袁旭音等分析了太湖沉积 物中的有机氯农药残留情况，发现 hcb 在几乎所有的样品中均被检出，且相对其 他有机氯农药，hcb 的残留水平最高9。 chon-lin lee 对台湾南部高雄海岸 40 站的表面沉积物中的氯苯类化合物进行 了分析，发现其中 hcb 最高含量为 22.3ng/g，比 1995 年的研究结果要高的多。尽 管在发达国家，hcb 作为农药停用比中国早几年，但其检出率依然较高。以前的研 究表明北美洲的安大略湖被氯苯类化合物严重污染， 其中最高的为 hcb， 其浓度达 到 97 ng/g10。k.a. tricklebank 分析了意大利北部帕尔马的三个城市和悉尼的三个 中心城市的十种有机氯杀虫剂的污染浓度，发现 hcb 是最频繁发现的有机氯杀虫 剂，占采集样品的 7011。d.uen 对从日本周围海域（日本海岸和北太平洋西部） 重复采集的水样分析发现， hcb 的浓度分部是非常均匀的， 然而日本海岸样品的平 均浓度（42 ng/g）却明显比太平洋海岸的（33 ng/g）要高12。berendl vandrooge 于 1999年五月至2000年七月从坦纳利弗岛海拔2367米采集逆增层大气样品并分析了 其中的 hcb 等约 20 种有机污染物的沉降情况，发现 hcb 的沉降率为 86ng/m2.a， 而这些样品只能代表总沉降量的一部分，在湿沉降中情况将更加的严重13。 hcb 的去除方法包括物理法、化学法和生物法14。物理去除方法主要为吸附 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 法，该方法是利用吸附剂处理水中的 hcb ，应用广泛、技术成熟，但只适用于低 浓度废水，处理成本高，且存在二次污染。化学法包括：1、紫外微臭氧技术15， 2、光催化氧化技术1617，3、零价金属还原技术1819，4、射线辐照技术1，5、 电 fenton 法2021，6、fenton 试剂法22。 生物降解技术是指利用微生物的代谢过程使废水中溶解性和胶体有机污染物 氧化降解，转化为简单的物质。科研工作者通过富集培养等技术已发现了一些能够 降解 hcb 的微生物。蔡全英等对含氯苯类化合物城市污泥与稻草、木屑等在不同 条件下的堆肥处理进行了研究23。植物主要通过直接吸收降解、释放能直接降解有 机污染物的酶或通过其根系与根区微生物的联合作用进行有机污染修复。 针对 hcb 类难降解有机污染物物化处理一般具有处理成本高、矿化不完全、易产生二次污染 等缺点，故常用于生物处理的预处理，以提高可生化性，或用于某些特殊场合（如 高浓度有机物处理、低浓度有机废水的深度处理、有价有机物的回收等） 。生物处 理投资小，处理成本较低，矿化完全，同时亦是自然环境中消除污染的最终机制， 利用微生物进行降解和转化有着巨大潜力。 1.3 氯苯类有机污染物的生物降解机理氯苯类有机污染物的生物降解机理 氯苯类化合物在环境中普遍存在，是化学性质较为稳定的一类化合物。这主要 是因为氯原子有较高的电负性， 强烈吸引苯环上的电子， 使苯环成为一个疏电子环， 因而氯苯类化合物很难发生亲电反应。随着氯取代基的增多，氯苯类化合物的活性 逐次下降。与碳氢化合物相比，由于氯原子的引入其生物降解性大大降低，因此普 通生物处理很难降解氯苯类化合物。而在污水的处理过程中除部分低氯苯挥发进入 大气外，大量的氯苯类化合物仍将存留于污水和污泥中。氯苯的吸附性、挥发性、 亲脂性均处于“中间”水平，易为植物吸收，污染作物，对生态环境造成严重影响。 而氯苯类化合物通常被认为是环境外来化合物，是由于自然界中的微生物缺乏 相应的降解酶，所以难以被微生物利用。但是经过长期的接触驯化，有些微生物通 过自然变种，或通过形成诱导酶，而逐步改变自身以适应环境，能够将氯苯类化合 物降解或部分转化。迄今为止，许多学者已从土壤或水体中分离出这些微生物，如 表 1-1 所示。氯苯类化合物与芳烃类化合物相比，生物降解性大大降低，主要原因 是高电负性的氯原子使苯环成为一个很难被氧化的疏电子环。氯苯类化合物降解的 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 关键在于脱氯。根据脱氯过程中电子得失，将氯苯类化合物生物降解分为氧化脱氯 和还原脱氯，除了脱氯机制外，氯苯类化合物还有共代谢机制。 表 1-1 代谢氯苯类化合物的微生物24 氯苯类化合物 微生物 一氯苯 pseudomonas sp.（wr1306） 、p. putida （ 613-3 , 11a -5b , 631-4b2） 、 pseudomonas sp.（js1474,704 ,701,150） 、p. aeruginosa （rh01） 、白腐真 菌 phanerochaete chrysosporium、 p. putida （j s31） 、 ralstonia sp. （j s705） 、 escherichia hermanii 1 ,2 - 二氯苯 pseudomonas sp. 、 pseudomonas sp. p51 （发现质粒） 、 p. aeruginosa （rh01） 、 白腐真菌 phanerochaete chrysosporium 1 ,3 - 二氯苯 a lcaligenes sp. （obb65） 1 ,4 - 二氯苯 a laligenes sp.（a175） 、pseudomonas sp. （j s6） 、p.putida （wr1323 杂 交种） 、pseudomonas （p51） 、xanthobacter f lavus （14p1） 、p.aeruginosa （rh01） 、白腐真菌 phanerochaete chrysosporium 1 ,2 ,3 -三氯苯 未名好氧菌群、未名厌氧菌群 1 ,2 ,4 - 三氯苯 未名好氧菌群、s taphyloccus epidermidis （a-f） 、s taphylococcus saprophuticus （g） 、 s t reptococcus sp. （h , i） 、 bacillus sp. （j ） 、 l actobacillus sp. （l） 、 pseudomonassp. （ps12 , ps14） 、 pseudomonas aeruginosa （rh01） 、 pseudomonas sp.（p51） 、未名厌氧菌（群） 1,2 ,3 ,4 -四氯苯 pseudomonas chlororaphis （rw71） 1 ,2 ,4 ,5-四氯苯 pseudomonas sp.（ps14） 、b urkholderia sp.（ps14） 、未名厌氧菌群 1）氧化脱氯 在好氧条件下，氯苯类化合物的降解反应基本上遵循一种相似的先开环再脱氯 的机制。 首先在双加氧酶作用下， 在芳环中插入氧原子， 形成相应的环状氯代二醇， 再在去氢酶作用下，脱除两个氢原子转化为相应的氯代邻二酚。研究表明，好氧生 物体中不仅含有双加氧酶，而且还含有可使苯环发生邻位裂解的酶。该酶可催化氯 代邻二酚邻位开环，生成相应的氯代粘康酸，此产物在内酯化过程中脱除氯原子并 被氧化成氯代马来酰基乙酸，最终进入三羧酸循环。氯苯类化合物的氧化脱氯还存 在一种较少见的先脱氯后开环再脱氯的催化反应体系，即在单加氧酶作用下，由羟 基取代氯原子， 再经过单加氧酶的进一步作用， 形成开环裂解的中间体氯代邻二酚， 才能进一步降解。 如一氯苯的生物降解。 德国的 reineke w. 及 knackmuss h. j . 从污泥中分离富 集出能够利用一氯苯为唯一碳源的微生物。他们首先将从不同地方收集来的污泥混 合，在 20 下通入苯蒸气，再逐步提高一氯苯的蒸气浓度，直至被完全取代。容 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 器进口与检测仪相连，可以控制氯苯的浓度。经过 9 个月驯化，分离出 psudomonas 属的菌株 wr1306 。 通过细胞提取物的酶活性分析， 他们推测出一氯苯的降解机制， 即在双加氧酶作用下发生双羟基化反应，生成 3 - 氯- 顺- 1，2 - 二羟基- 3，5 - 还 己二烯， 再在 nac+ 的参与下去掉一分子氢， 生成氧化开环的中间体 3 - 氯邻二酚。 此中间体邻位裂解后形成 2 - 氯- 2，4 - 二烯- 己二酸(即 2 - 氯- 粘康酸) 。脱氯过 程发生在粘康酸内酯化形成 4 - 羧甲烯基- 2 - 丁烯- 4 - 内脂的过程中。 此产物含有 不饱和双键， 可以被逐步还原， 生成只含一个不饱和键的顺丁烯二酰基乙酸(即马来 酰基乙酸) 和碳链完全饱和的 3 - 羰基- 己二酸，并最终进入三羧酸循环(如图 1-1 所示) 。 图 1-1 一氯苯的好氧生物降解机制 氯代邻二酚具有生物毒性，会抑制一氯苯的进一步降解，在降解过程中容易形 成积累，所以反应中芳环邻位裂解形成氯代粘康酸是控速步骤。研究人员认为所有 单取代基苯的衍生物都遵循相似的好氧降解途径，即都会专一的在 2 、3 位发生双 氧化反应，形成相应的邻二苯酚的衍生物，然后邻位开环，生成取代的粘康酸。 除了人工驯化，微生物对氯苯类化合物的代谢功能还可以通过自然驯化过程获 得。 美国的 s. f. nishino 等从受氯苯污染的地下水中未经驯化便分离出 p. putida 和 bacill us 属的菌株，它们都参与一氯苯的降解。kiernicka 等从工业污水处理厂的 污泥中也未加驯化分离出一种能够降解一氯苯的 escherichia hermanii 。 这是一种黄 色短杆菌，在一氯苯浓度大于 400mg/ l 时也能存活。这说明经过长期的接触驯化， 天然菌群会逐渐适应环境，能够利用周围的有机污染物为碳源和能源，在氧气和无 机养分充足时，使目标污染物较快降解。这种自然驯化是通过土著微生物的水平基 因转移和原有基因重组而获得的。 hcb 由于苯环上有六个氯离子，结构相当稳定，通常认为不易好氧脱氯。在 hcb 的好氧脱氯方面报道较少。hcb 好氧降解的第一步是由一个羟基取代一个氯 离子，得到五氯酚（pentachlorophenol，简称 pcp）。xuehui chen 等25研究人员将 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 来源于细菌的一个细胞色素 p450 单加氧酶定点突变后获得一突变株，该突变酶能 催化 hcb 至 pcp 的反应，并具有很强的活力。pcp 能够被多种微生物彻底降解， 并以其作为唯一能源和碳源生长。 甘平等24经过 2 个月的驯化， 从某染料厂和某毛 纺厂活性污泥中分离出能够生长于 1， 4 -二氯苯、 1 ， 2 ， 4三氯苯和 hcb 的 4 种 微生物. 通过测定该混合菌降解氯苯类化合物过程中的累积耗氧量、微生物生长曲 线及降解产物 cl-的释放，证明在好氧条件下该混合菌能够以 1 ，4二氯苯和 1 ， 2 ，4三氯苯为唯一碳源和能源，降解产物 cl-浓度的变化与微生物生长周期有关. 通过好氧振荡瓶培养法测得 3 种氯苯的生物降解顺序为：1 ，4二氯苯35617 g/(ld) 1 ，2 ，4三氯苯110. 4g/(ld) hcb6g/(ld) hcb 在培养周 期内几乎不降解。 说明氯原子的引入是氯苯类难以生物降解的原因， 氯取代数越多， 越难被微生物氧化。 迄今为止，还没有在正式出版物中发现关于纯培养的好氧菌以 hcb 为唯一能 源和碳源生长报道。 2）还原脱氯 由于氯原子强烈吸引电子云，使苯环上电子云密度降低， 使氧化酶难以从苯 环上获得电子， 不易发生氧化反应。 因此， 还原脱氯反应是一种很重要的脱氯方式。 而在厌氧条件下，环境的氧化还原电位较低， 这时电子云密度较低的苯环在酶的 催化下很容易受到还原剂的攻击，使氯原子被取代，这就是还原脱氯。氯苯类化合 物显示出较好的厌氧生物降解性。许多在好氧条件下难于降解的有机物在厌氧下变 得能够甚至容易降解。还原脱氯使氯原子数减少，降低这些难降解有机物毒性，易 于被别的微生物同化。研究表明，自然环境中存在可以降解氯苯类化合物的厌氧细 菌。在含有氯苯类的河流、土壤等深层缺氧层中及鼠类肠容物中都发现了能降解氯 苯的厌氧细菌。从 80 年代至今，也已有报道用厌氧污泥、河流湖泊底泥，农田土 壤进行 hcb 的还原脱氯。 ferdi brahushi26用可耕种的土壤进行了hcb的还原脱氯研究，被水浸透的土壤 可以诱导土壤中厌氧微生物群落的活动，而且脱氯效率很高。经过20个星期的培养， 初始应用的14c-hcb只有1残留而且都在沉降的残渣中。 bea-ven chang等27研究了hcb在三种还原条件下的脱氯降解，在这三种厌 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 氧条件下从高到低的脱氯效率被测定为：产甲烷条件(0.30mg/l/d)还原硫酸盐条件 (0.12mg/l/d)脱氮条件(0.08mg/l/d)。 生物降解hcb的过程是： hcb被还原脱氯成为 pcb，进一步的降解产物是1，2，3，5tecb，接着是1，3，5tcb和1，2，4 tcb的混合物，最终产物是1，3dcb 。 s.y.yuan，c.j.su和b.v.chang等28从对于在厌氧混合基质中城市污物污泥的 hcb的脱氯的研究发现在ph7.0，30温度下，脱氯达到0.29mg/l/day；并发现脱氯 在搅动的情况下不会发生； hcb的降解途径为：hcbpcbtecbtcbdcb； hcb的浓度范围在250mgl时，较易生物降解可以观测到系列脱氯，当浓度高于 50mg/l后脱氯明显锐减。 德国的lorenz adrian等2930人长期从事氯苯类化合物的厌氧生物降解研究， 2003年12月，他们报道了厌氧菌 dehalococcoides sp. strain cbdb1能够降解hcb，该 菌株能够利用晶体状的hcb作为电子受体，还原脱氯。这是迄今为止首次由纯培养 菌株降解hcb的报道。hcb被还原脱氯成为pcb，进一步的降解产物是1，2，3，5 tecb和1，2，4，5tecb的混合物，最终的积累产物是1，3，5tcb、1，3 dcb和1，4dcb 。 babuz. fathepure等31人用厌氧污泥降解hcb， 3周就将190m的hcb完全生物转 化，每天的脱氯速率是13.6moll-1。 mark t、prytula 等人32从一条有 40 年污染史的河流中取河口的底泥和水样， 主要研究的是污染物质和有机物质的生物利用度和它们对底泥中氯苯的还原脱氯 的影响。第一批 hcb 减少率是 2.210-3 到 2.910-3d-1，希望用含有糊精的微观 世界能提高 hcb 减少率。 hcb 的去除需要很长的时间， 在大概 480 多天的培养中， 去除了 43的 hcb。而这 43的去除主要发生在前面的 200 多天。 在具体研究中，由于参与反应的微生物种群不同，环境条件不同，同一种化合 物会显示不同代谢途径，如图 1-2，这是由于不同的微生物种群在不同的环境条件 下显示出不同的特性所造成的。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 图 1-2 hcb 的两种厌氧生物降解机制 图 1-2 所描述的机制表明，hcb 通过两种途径进行降解。大量的 hcb 转化成 1 ，3 ，5 - 三氯苯，其余则生成二氯苯。这可能存在两种降解机制不同的菌群。 也说明苯环上三个氯原子的连续排列是不稳定的，中间的氯原子与碳的结合力最 弱， 最容易被还原， 借以保持更大的稳定度， 当居中的氯原子完全脱除， 如形成 1 ， 3 ，5 - 三氯苯时脱氯反应停止。 美国的 ramanand 等在产甲烷条件下研究 hcb，1 ，2 ，4 - 三氯苯的降解时， 发现 hcb 的降解还存在另外一种降解途径(见图 1-2) 。实验中没有产生 1 ，3 ，5 - 三氯苯， 也没有其它三氯苯浓度的积累， 而是进一步转化为一氯苯， 这表明 hcb、 五氯苯的降解机制将多于一种途径，有待进一步的研究。 3）共代谢脱氯 “共代谢”的概念来源于 peter 和 foster 提出的“共氧化” ，其定义为在生长 基质存在时对不可利用基质的氧化。jenson 将此概念一般化，提出“共代谢” ，现 在一般定义为只有在初级能源物质存在时才能进行的化合物的生物降解过程。不仅 包括细胞在对生长基质代谢过程中对非生长基质的共同氧化;也包括休眠细胞 ( resting cells) 对非生长基质的代谢，此时共代谢的能量来自细胞的内源呼吸。 共代谢被认为是由于初级基质诱导产生的酶和辅助因子缺乏专一性所致。由于 代谢所需的酶来源于初级基质的代谢，因此对次级基质的共代谢活性取决于对初级 基质的利用。如德国的 p. r.brunsbach 等在研究一氯苯、1 ，4 - 二氯苯的生物降 解时，发现该微生物能共代谢 1 ，2 - 二氯苯和 1 ，2 ，4 - 三氯苯。但当生长基 质消耗殆尽时，1 ，2 - 二氯苯和 1 ，2 ，4 - 三氯苯不再降解 。由于共代谢体系 中的酶缺乏专一性，在一个同时存在 2 种基质的体系内，必然存在着对所需酶的竞 争作用，两种基质的代谢速率之间存在着相互作用。在上述研究中，1 ，2 - 二氯 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 9 苯和 1 ，2 ，4 - 三氯苯的引入，降低了一氯苯的代谢速率，是细胞对生长基质的 利用产生明显滞后。 共代谢中生长基质的选择是很重要的。同种微生物可能以多种化合物为生长基 质，但是不同的生长基质诱导的酶可能不尽相同。一般来说，生长基质于非生长基 质分子结构类似时，生长基质诱导的酶可能非专一的共代谢非生长基质。如在上述 例子中，1 ，4 -二氯苯的降解菌可以降解结构相似的 1 ，2 - 二氯苯和 1 ，2 ，4 - 三氯苯。另外许多氯代芳香化合物不能被微生物直接利用作为生长基质，但可通过 选择一种合适的生长基质来诱导产生它们所需的酶及产生足够的能量驱动它们的 最初转化。如在消除氯苯类化合物代谢中产物氯代邻二酚的积累时，可以加入酵母 膏来诱导。 1.4 难降解有机污染物的生物强化技术难降解有机污染物的生物强化技术 传统生物处理工艺对毒性难降解有机废水去除效率低，微生物适应期长，不能 有效维持连续的驯化培养物，冲击负荷大，降解率低33。生物强化技术从自然界中 筛选出优势菌种或通过基因组合产生高效菌种运用到污水处理工艺，能提高对特性 污染物的处理能力 34。生物强化技术具有针对性强、应用灵活、效率高等特点， 在该领域成为研究热点35。 生物强化技术有以下几种形式： 1）直接投加特效降解微生物 生物强化技术应用最为普遍的方式是直接投加对目标污染物具有特效降解能 力的微生物，这种特效微生物经过筛选、培养、驯化之后，投入到该废水中，以目 标污染物为唯一碳源和能源，废水中的微生物可以附着在载体上，形成高效生物膜; 也可以以游离的状态存在。赵美云36等，利用经过特殊筛选、培育出的高效活性菌 群强化 sbr 法处理聚酯废水，该高效菌种对降解废水中的大量长链烷烃，在缩短 启动时间方面有着明显的作用，且可使出水 cod 较普通系统降低 100 mg/ l ，去 除率提高 6 %8 %。张仲燕，杨明风37等选用优势菌种利用生物膜法处理卡那霉 素废水，研究表明，通过投加优势菌挂膜系统由于自然驯化污泥挂膜，且去除率可 稳定达到 8890。姚传忠，张克强38等筛选出一株高效脱硫的排硫硫杆菌，并 利用上流式填料床反应器进行了挂膜试验，在进水浓度为 185 mg/ l 、停留时间为 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 40 min 时，去除率能达到 100 %。曾丽璇等人39 研究了利用优势菌处理印染废水 的工艺及脱色机理。在水解池内投入具有较好脱色效果的分属于假单胞菌属、气单 胞菌属、红螺菌属的优势菌群，来处理印染废水，结果 6a 中系统脱色率稳定在 90 %以上。 2）投加生物共代谢基质及辅助营养物质 大部分难降解有机物不能被微生物直接利用作为生长基质，但可以通过共代谢 途径进行降解。在微生物共代谢反应中产生的既能代谢转化生长基质又能代谢转化 目标污染物的非专一性的酶，是微生物共代谢反应发生的关键。投加生长基质为微 生物的生长提供直接碳源与能量，投加诱导基质能诱导微生物产生能降解目标污染 物的非专一酶，从而使难降解有机物得到降解。gregory 等40用 fe0和甲烷菌处理 高度氯化的脂肪族碳氢化合物，发现四氯化碳和氯仿的降解速度得到提高，而在含 乙酸、乳酸盐的甲烷菌培养基和 fe0的混合体系中，fe0 作为唯一的外来电子供体， 对四氯化碳、四氯乙烯（pce）和三氯乙烷（tca）除氯的效果有明显的影响，发 现四氯化碳和 tca 的除氯效果显著提高，而 pce 的脱氯程度几乎不变。说明甲烷 培养基的加入抑制了生物本征反应而提高了共代谢作用。因此，通过共代谢作用加 快毒性有机物的生物降解是一个重要的研究方向。 3）构建基因工程菌 分子生物技术飞速发展，为难降解芳香类化合物的处理提供了新的可能。在对 各类污染物降解基因研究的基础上，越来越多控制降解过程中关键步骤和限速步骤 的基因41被发现。克隆了这些基因的菌株，不仅可以免去驯化的长期过程，又有相 对于野生高效菌株更为广泛的底物利用范围。吕萍萍，王慧42等克隆有苯降解过程 中的关键基因甲苯加双氧酶的基因工程菌 e. coli. jm109(pkst11)对苯具有较高 的降解效率和降解速度，应用于固定化细胞反应器中效果突出。在较短的水力停留 时间内，可以将 1500mg/l 苯降解 70%，降解速度为 1.11mg/(ls)，延长水力停留 时间， 可以使去除率达到 95%以上.该反应器对高浓度的苯具有突出的处理效果。 同 时所得到的产物为环己二烯双醇，可以被野生非高效菌 w3 快速利用。 4）固定化生物强化技术 直接投菌法虽然简单易行，但是所投加的特效微生物容易流失，或易被其他微 生物吞噬。固定化技术是将单一或混合的优势菌株固定封闭在特定的载体上，例如 将特定的微生物封闭在高分子网络载体内，使菌体脱落少、活性高，从而提高优势 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 11 微生物浓度，增加了其在生物处理器中的存留时间。guiot43以甲烷菌强化驯化， 研究了 uasb 反应器中酚、邻甲酚、对甲酚的降解效果，游离的细菌细胞和颗粒 物自然接触，并包埋在褐藻酸盐球中，酚的降解速率至少是原来的 2 倍，其效率提 高的原因归功于含酚化合物降解菌在颗粒物上的固定化。 1.5 研究思路研究思路 (1) hcb 生物降解可行性 微生物是比较低等的生物，每代间隔很短。在生物进化过程中，微生物的代谢 调节系统总是趋向最有效地利用环境中的营养物质，优先进行生长和繁殖。在环境 选择作用下，下代微生物会继承上代微生物适应环境的特性，而摒弃不适应环境的 特性。 由于环境对微生物的选择作用， 使得微生物能通过进化获得适应环境的能力， 具有能从不同环境物质中获得能量和营养物质的能力。 在长期受 hcb 污染的地带，环境中的微生物在其进化过程中通过变种或形成 诱导酶，逐步改变遗传特性适应环境，产生降解或部分降解 hcb 的能力。在受污 染的环境中， 并不是所有的微生物都能够降解和转化 hcb， 通常只有一种或几种微 生物起作用。起降解作用的微生物由于缺乏足够的溶解氧（或其他电子受体） 、营 养盐等微生物必须的生长物质，往往成为劣势菌体。通过富集、分离和筛选可分离 获得对 hcb 起降解作用的目的菌株。 一般在受污染的土壤和沉积物中存在能降解类似 hcb 的异生素的生物体 4445。 若选择合适的培养基富集培养长期受到hcb污染的底泥， 使不能够降解hcb 的微生物死亡，能够降解 hcb 的微生物得以生长，从而获得较纯的能降解 hcb 的 微生物群体，通过多次的转接培养，可获得有稳定降解能力的菌群。 （2）生物降解菌剂的制备 在将筛选的 hcb 好氧降解菌群用于实际废水的生物处理设施前，必须获得大 量的降解菌剂。由于筛选过程中，微生物菌群处于具有选择性的压力，其微生物的 增殖受到较大的影响，菌体合成速率较慢，难以达到使用上量的要求，需利用发酵 方法对该菌群扩大培养。 由于菌种的遗传特性需要一定的条件才能表现出来，发酵时，由于选择性压力 的消失，而使微生物处于不利的生理状态，常常表现为菌种衰退。发酵后应作降解 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 12 特性研究。 在将 hcb 好氧降解菌群投加到 hcb 废水处理设施时， 为了使系统中保持一定 的生物量，避免降解菌剂的流失，或因为条件的改变而易失活，常常使用固定化方 式处理降解菌剂。 （3）实际废水处理 尽管筛选的 hcb 好氧降解菌群对 hcb 有一定的降解能力，但 hcb 废水成分 复杂， 除 hcb 外， 还有其他很多难降解有机物， 在将 hcb 用于实际废水的处理时， 需检验该降解菌群对于实际废水的降解能力，研究该 hcb 好氧降解菌群是否对废 水处理效率有所提高，为 hcb 的生物处理提供工程方面的依据。 根据以上思路，本文从降解菌的筛选、菌群的培养、实际废水处理实验全过程 研究了 hcb 的好氧降解。形成了一套完整的、系统的难降解有机污染的生物处理 研究方法，为以 hcb 为代表的 pops 物质的生物处理提供有力的科学依据。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 13 2 hcb 好氧降解菌的富集培养好氧降解菌的富集培养 2.1 前言前言 本研究实验样品来自武汉某化工厂的排水沟。由于该排水沟长期受 hcb 污染， 底泥中富集大量的 hcb，其上层底泥中富含能降解转化 hcb 的好氧微生物。选择 合适的培养基，富集培养能以 hcb 为唯一碳源的条件下生长的微生物。选取有稳 定降解能力的菌群作初步鉴定，检测其对 hcb 的累积耗氧量，并对其降解特性进 行研究。 2.2 实验材料实验材料 2.2.1 样品来源样品来源 本实验富集样本来自武汉市某化工厂排水沟的底泥。为保证样品中微生物的多 样性，采集该河的六个不同位置的泥样，采样点的分布如图 2-1。 图 21 采样点分布图 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14 2.2.2 主要试剂主要试剂 （1）富集培养基 富集培养基采用无机盐培养基46，其配方如下： na2 hpo4 12h2o 7g ， kh2 po4 2g ， (nh4 ) 2so4 0.5g ， mgso4 7h2o 0.2g ， znso4 7h2o 5mg ， namoo4 2h2o 2.5mg ， ca (h2 po4 ) 2 14mg ， feso4 0.13mg ， ph = 7 （2）化学试剂 六氯苯（中国天津试剂一厂，分析纯） ；正己烷（中国天津试剂一厂，分析纯） ； 丙酮： （中国天津试剂一厂，分析纯） 。 （3）缓冲液 对降解菌体预处理时需采用缓冲液清洗，缓冲液采用磷酸盐缓冲液，其配方如 下： kh2po4， 8. 5g； k2hpo4， 21.75g； na2hpo47h2o， 33. 4g； nh4cl 1. 7g； ph =7.2。 2.2.3 主要仪器主要仪器 微生物量检测仪器：核酸蛋白含量测定仪（biophotometer6131，eppendorf 公 司） ； 耗氧量测定仪器：bod5生化测定仪（bodtrak，hach 公司） ； hcb 分析仪器：气相色谱仪（hp6890 气相色谱仪及 hp3398a 化学工作站） ； 氯离子检测仪器：orion chn170 氯离子复合电极（thermo 产品） ； 其他主要设备：离心机（5810r，eppendorf 公司） 。 2.3 实验内容及方法实验内容及方法 2.3.1 泥样的采集泥样的采集 在每个采样点用土样采集器采集排水沟表层泥样 50g，用无菌手套装入无菌塑 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15 料带